方法文章

利用双标记嵌合体分析技术（MADM）对发育中大脑皮层进行谱系追踪与克隆分析

DOI：

10.3791/61147

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2020年5月8日

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1Institute of Science and Technology Austria

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用双标记嵌合分析（MADM）在单细胞水平上对候选基因进行谱系示踪和功能遗传学分析的实验方案。MADM克隆分析提供了一个定量框架，用于测量单个前体细胞及其子代细胞的增殖行为、细胞产出及谱系关系。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从数量有限的前体细胞开始，哺乳动物的大脑皮层形成了高度有序的功能性神经环路。然而，在发育中的神经上皮中，调控神经干细胞（NSCs）谱系转变并最终产生神经元和胶质细胞的细胞与分子机制仍不明确。用于追踪神经干细胞分裂模式并绘制克隆相关细胞谱系的技术已取得显著进展。然而，当前许多谱系追踪技术仍缺乏对子代细胞命运的细胞级分辨率，而这种分辨率对于解析前体细胞分裂模式至关重要。本文介绍了一种利用双标记嵌合分析（MADM）进行体内克隆分析的实验方案。MADM能够在单细胞分辨率下同时操控单个前体细胞，并可视化其精确的分裂模式和谱系进展。在有丝分裂的G2-X期发生的基于MADM的染色体间重组事件，结合时间可诱导的CreERT2系统，能够精确提供克隆的出生时间及其分裂模式的信息。因此，MADM谱系追踪可在单细胞水平上以前所未有的精度提供干细胞前体细胞增殖模式的定性和定量光学读出。MADM还可用于研究候选基因在神经干细胞谱系进展中的机制及功能需求。该方法的独特之处在于，可在同一组织微环境内体内直接比较对照与突变亚克隆。本文详细描述了该实验方案，并展示了在发育中的大脑皮层中应用MADM进行克隆分析和谱系追踪的实验范式。重要的是，只要存在CreERT2驱动元件，该方案可被推广应用于任何小鼠干细胞微环境中的MADM克隆分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大脑皮层是一个高度有序的结构，由六个不同的层次组成。皮层包含多种细胞类型，包括神经元和胶质细胞，它们相互作用形成功能性的神经回路。大多数（如果不是全部）皮层兴奋性投射神经元和胶质细胞均来源于一类共同的神经干细胞（NSCs），称为放射状胶质前体细胞（RGPs）1,2,3。RGPs本身则起源于组成早期胚胎神经上皮的神经上皮干细胞（NESCs）。在小鼠胚胎发育第9天（E9），NESCs开始向RGPs转变4。RGPs的谱系进展需要精确的时间和空间调控，当这一过程受到阻碍时，可能导致严重的神经系统疾病，如巨脑症、小头症、无脑回畸形，或精神分裂症和自闭症等神经功能障碍5,6。在E10阶段，大多数RGPs进行对称性增殖分裂，导致神经前体细胞池的扩增4,7。随后，RGPs逐渐开始进行不对称分裂，以特定的时间顺序产生皮层投射神经元。通过连续的神经发生波，新生神经元迁移至皮层板，形成皮层层状结构，其中早期生成的神经元位于深层，晚期生成的神经元则位于浅层8,9,10。由于克隆相关的锥体神经元在向皮层迁移时几乎不发生横向扩散，其子代细胞倾向于形成一种柱状或圆锥形结构，被称为神经元放射状功能单位4,11,12,13。到E17时，小鼠胚胎的神经发生扩增过程已完成14。RGPs还可产生室管膜细胞以及某些类型的胶质细胞，包括星形胶质细胞和少突胶质细胞1,15,16,17,18,19。RGPs具有同时生成神经元和星形胶质细胞的潜能，这一特性在所有皮层区域中似乎是一致的18，大约有1/6的产神经RGPs也会同时产生胶质细胞11。

目前，调控干细胞沿其谱系发生时间进程的遗传和表观遗传因素在很大程度上尚不清楚。基因表达的时间模式可能对放射状胶质前体细胞（RGPs）的谱系决定产生重大影响20,21,22,23,24。这种时间模式与空间模式之间紧密关联的关系如何导致不同皮层区域成年神经元类型的分子多样性，目前仍不清楚。同样，单个干细胞潜能及其细胞输出在细胞和分子水平上如何被调控，也是一个尚未解决的重要问题。未来的研究有望解答其中一些问题，最终加深我们对功能性皮层环路形成机制的理解。

发育神经生物学旨在理解脑内细胞之间的谱系关系。最初，可用于研究这一问题的工具非常有限，许多早期研究依赖于对透明生物体（如Caenorhabditis elegans）中细胞分裂模式的直接观察25。近几十年来，可用技术的数量和复杂性显著增加13,26,27,28,29。CRISPR-Cas9基因组编辑系统的出现使得通过引入可进化的DNA条形码来人工重建细胞谱系关系成为可能27,30。最近两种条形码策略的实例包括：使用归巢向导RNA将CRISPR-Cas9靶向特定的DNA条形码位点，或利用与切口酶Cas9融合的胞苷脱氨酶靶向内源性散在重复序列区域31,32。这些技术通过引入随时间逐步且稳定积累独特突变的条形码，实现了高度多重化的分析方法。基因组编辑方法具有极高价值，因为它允许基于这些条形码的共同遗传特征，对任意两个细胞之间的关系进行回溯性分析。然而，为了读取单个细胞中的条形码，通常必须破坏组织，因此来自单个前体细胞的位置信息、形态学特征以及绝对细胞数量等信息将丢失。

组合标记方法可保留空间信息，原则上还能区分定位紧密或甚至重叠的克隆33,34。一种具有信息价值的谱系示踪方法必须以稀疏且不可逆的方式标记单个前体细胞及其子代细胞。值得注意的是，Brainbow35 和 Confetti36,37 方法利用基于随机多色 Cre 重组酶的报告系统，从单一基因座表达多种荧光蛋白的组合。在体内可实现大量同时存在的颜色组合，使其在示踪大脑皮层放射状胶质前体细胞（RGP）克隆和星形胶质细胞时成为一种强大工具34。此外，已有研究开发出基于转座子的系统，可实现编码荧光报告蛋白的转基因在基因组中的稳定整合，从而用于皮层前体细胞的谱系示踪33,38,39,40,41。基于转座子的系统具有一项额外优势：报告结构可稳定整合至基因组中，从而可靠地标记具有亲缘关系的子代细胞。为特异性示踪星形胶质细胞谱系，已发展出多种方法，包括电穿孔导入piggyBac转座酶的方法，例如Star Track，该方法采用编码不同荧光蛋白的多种构建体组合40,42。另一种方法MAGIC markers则将Brainbow载体作为可移动的转基因引入。该方法已成功用于示踪胚胎期神经前体细胞及星形胶质前体细胞34,43。最近发现，通过双重组酶介导的盒式交换（MADR）进行嵌合体分析，能够稳定地标记那些从染色体上精确定义位点表达转基因元件的突变细胞44。这些强大的体内组合标记技术为前体细胞谱系动态提供了大量深入见解。然而，这些分析均在固定组织上进行，仅能提供特定发育阶段单个克隆的静态图像。为了观察单个克隆谱系动态随时间的变化，需要应用类似于在成年齿状回中所采用的慢性活体成像技术45。

双标记嵌合体分析（MADM）是一种强大的双色标记方法，可在小鼠体内对单个前体细胞进行谱系示踪46,47。实现MADM标记需要两个组分：第一，必须将MADM盒靶向整合到同源染色体上的相同位点。MADM盒包含两个嵌合型荧光报告基因，即eGFP（绿色，[G]）和串联二聚体番茄荧光蛋白（红色，tdT[T]）。GT盒包含eGFP的N端和tdT的C端，二者之间由含有loxP位点的内含子隔开；TG盒则相反，包含tdT的N端和eGFP的C端。第二，必须在同一细胞中表达Cre重组酶。在缺乏Cre的情况下，嵌合盒无法表达有功能的eGFP或tdT，因为其编码序列是断裂的。loxP位点作为Cre介导的染色体间重组的靶点，可同时重建两个表达盒。若重组发生在细胞周期的G2期并随后发生X型分离（G2-X），则两个子细胞将各自表达一种荧光蛋白。通过他莫昔芬（TM）对CreERT2活性进行时间调控，可精确获得MADM克隆的出生时间及其子代细胞的分裂模式信息（图1A）29,46,47。

MADM 能够以高单细胞分辨率系统地标记小鼠大脑中的单个克隆，其效果类似于传统的高尔基染色48或染料填充49等方法，但后者缺乏特异性且操作繁琐。由于克隆性 MADM 标记的细胞类型特异性仅由驱动CreERT2的启动子决定，因此原则上 MADM 可应用于小鼠任何器官和组织中的克隆谱系示踪47,50,51,52。事实上，已有研究利用 MADM 揭示了来自多种组织的克隆之间的谱系关系47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59。MADM 实验范式已被用于研究皮层投射神经元、胶质细胞以及发育中新皮层中出生后干细胞的谱系关系7,11,12,46,60,61,62,63,64,65。此外，MADM 还被用于在克隆水平上研究成年齿状回、丘脑、小脑颗粒细胞以及中间神经元的细胞谱系（详见表1中的完整列表）47,53,54,56,57,66。

MADM 的一个独特特征是能够将远离 MADM 基因盒的突变进行遗传连锁，从而产生遗传嵌合体（图 1B 和 图 2）。这使得野生型子代细胞被一种荧光标记标记（图 1B 中的 tdT），而纯合突变型同胞细胞则被另一种荧光标记标记（图 1B 中的 eGFP），且整个过程发生在一个未标记的杂合环境中。MADM 的独特之处在于，可在体内同一组织环境中对对照和突变亚克隆进行比较分析。最初，MADM 基因盒被靶向插入到 Rosa26 位点47，但该方法将 MADM 对基因功能的分析限制在了该位点远端的基因。为了克服（至少部分克服）这一限制并拓展基于 MADM 的基因分析可能性，研究人员已将 MADM 基因盒敲入到 7 号染色体（Chr. 7）51、11 号染色体（Chr. 11）46 和 12 号染色体（Chr. 12）51 的着丝粒附近。目前，针对小鼠全部 19 对常染色体的 MADM 基因盒靶向工作正在进行中，未来将几乎可用于研究任意基因，从而为发育谱系关系研究与功能遗传学分析的结合提供无与伦比的平台。

方案

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小鼠实验方案已由奥地利科学技术研究所（IST Austria）的机构临床前核心设施（PCF）及内部伦理委员会审核。所有繁育和实验操作均在奥地利联邦科学与研究部批准的许可下进行，符合奥地利及欧盟的动物保护法律法规。

1. 用于MADM克隆分析的实验小鼠的繁育

  1. 在傍晚（17:00）设置定时的实验性MADM交配（>P56；CD-1），并于次日上午（8:00）检查阴道栓。发现阴道栓的当天记为0.5天。实验小鼠交配设置的概览见图2。确保他莫昔芬（TM）诱导CreERT2活性的时间点以及分析时间点适合回答具体的实验问题。
    注：更多信息请参见图3及下文的代表性结果。
  2. 对于出生后取样，需同步设置繁殖以产生代孕母鼠。
    注：这些繁殖应比实验组繁殖提前1−2天开始。

2. MADM 小鼠中 TM 的诱导

  1. 制备一种 20 mg/mL TM 工作液 在15 mL或50 mL锥形离心管中将样品溶于玉米油，于室温（RT）在摇床上振荡约4小时，确保TM完全溶解。工作液用铝箔包裹后于4 °C保存，2周内使用完毕。
  2. 为诱导MADM重组事件，使用1 mL结核菌素注射器和25 G针头，对配准妊娠的母鼠进行一次腹腔（IP）注射TM。根据皮层神经发生阶段，在E10至E15期间注射TM，剂量为每只妊娠母鼠1−2 mg。对于较早的时间点（即E10），每只妊娠母鼠最大使用剂量为1 mg（25 mg/kg），以避免妊娠期间出现并发症11在E11至E15期间的时间点，使用2 mg/只孕鼠（50 mg/kg）7.
    注意：对于晚期妊娠，也可通过口服灌胃给予TM。
  3. 对于MADM克隆分析至出生后时间点，通过剖宫产在E18−E19阶段获取活体胚胎，随后将仔鼠交由代孕母鼠哺育。
    注意：根据怀孕雌性动物的健康状况，可能无需进行剖腹产手术，但仍需将幼崽交由代孕母鼠抚养，因为经TM处理的亲生母鼠可能存在泌乳困难。
  4. 通过颈椎脱位法处死怀孕母鼠，以通过剖宫产获取活胚或采集用于分析的胚胎样本。
  5. 将动物置于仰卧位，用70%乙醇消毒毛发。使用手术镊和剪刀在子宫上方的下腹部皮肤做一小切口。穿过肌肉和腹壁肌肉层做第二个切口，暴露腹膜。
  6. 用剪刀分离周围组织，取出子宫。将完整的子宫转移至装有温水的手套中，以提高胚胎存活率，直至逐一从羊膜中取出每个胚胎。
  7. 使用精细尖头剪刀和手指小心打开子宫壁以取出胚胎。剪断脐带时勿过于靠近幼体身体，以防大量失血。若胚胎需用于分析，请进行步骤3.9；若需寄养幼仔，请进行步骤2.8。
  8. 如果需要寄养，应在将幼崽转移给寄养母鼠前将其清洁。清洁过程中，应不时轻压幼崽胸部以促进呼吸。随后将其放回装有温水的第二只手套上，以提高存活率。
    注意：必须使用纸巾轻轻去除残留的羊膜和/或胎盘组织。
  9. 在将幼崽转移给代孕母鼠之前，先将代孕母鼠从笼中取出，移除其原有的幼崽，并替换为实验幼崽，然后将代孕母鼠放回笼中。
    注意：有关提高收养成功率的其他建议，请参见讨论部分。
  10. 若需进行基因分型，在出生后第6至第8天期间采集脚趾或尾尖组织样本。
    注意：仅在动物实验许可证批准此操作时方可执行此步骤。

3. 大脑中MADM克隆的组织制备

注意：对于包含出生后组织（≥P4）的实验，请继续执行步骤 3.1；对于胚胎期时间点及早期出生后阶段（P0−P3），请继续执行步骤 3.9。

  1. 通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪溶液（剂量分别为65 mg、13 mg和2 mg/kg体重）对实验用MADM动物进行麻醉，并通过捏压后肢足掌确认小鼠无反应。
    注意：分析中使用雄性和雌性MADM小鼠（CD-1背景）。如需基因分型，可在本步骤采集耳组织样本。
  2. 将麻醉后的动物仰卧置于灌注手术托盘上，并用70%乙醇消毒毛发。开始手术时，使用剪刀和手术镊小心切开皮肤外层，再进行第二道切口以穿透肌肉层。抬起胸骨尖端，剪除两侧结缔组织，操作时需格外小心避免损伤肝脏。此时应可见胸腔。
  3. 剪开膈肌并上提以暴露心脏。小心修剪肋骨并用针固定于手术托盘两侧，以充分暴露心脏。对于幼鼠，需完全移除肋骨。
  4. 将含有磷酸盐缓冲液（PBS）的针头插入左心室下部（颜色较浅的组织）。使用小型虹膜剪在右心房后端（深红色组织）做一切口，以便血液流出。
  5. 先用PBS灌注，随后立即使用新鲜配制的冰冻4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液进行灌注。对于幼鼠（P4−P10），采用注射器进行灌注：准备一支含10 mL PBS和另一支含10 mL 4% PFA的注射器，确保注射器内无气泡。对于成年动物，使用蠕动泵进行灌注。
  6. 开始PBS灌注（幼鼠：10 mL，流速2−4 mL/min；成年鼠：20 mL，使用蠕动泵，流速4−6 mL/min）。若针头位置正确，肝脏将逐渐变为透明淡黄色。
  7. PBS灌注完成后，从幼鼠体内拔出针头，再将装有PFA的针头插入同一穿刺孔。对于成年动物，在将PBS更换为冰冻PFA前需先停止蠕动泵，并确保吸入管路中无气泡产生。随后继续PFA灌注（幼鼠：10 mL，流速2−4 mL/min；成年鼠：30 mL，使用蠕动泵，流速4−6 mL/min）。
  8. 灌注完成后，断头处死小鼠，并通过精细解剖取出脑组织。将脑组织转移至4% PFA溶液中，使用至少5倍于脑体积的固定液（即在15 mL锥形离心管中加入约5−10 mL PFA），于4 °C孵育过夜，以完成灌注后固定，确保组织完全固定。随后进入步骤3.10。
  9. 对于胚胎组织及早期出生后组织（即P0−P3），在实施剖宫产术后，使用剪刀将胚胎断头。如需基因分型，可在此时采集胚胎尾部组织。立即解剖取出脑组织，并转移至12孔板中，每孔加入2−3 mL 4% PFA。于4 °C孵育过夜，进行后固定。
  10. 次日早晨，将PFA替换为PBS（成年鼠：10 mL；胚胎：2−3 mL），在室温下重复漂洗3次，每次15分钟。将组织转移至含30%蔗糖的磷酸缓冲液（PB）中，置于4 °C摇床上保存，直至组织完全沉入溶液底部。
  11. 将脑组织置于包埋模具中，使用最佳切割温度（OCT）包埋剂进行包埋，注意调整脑组织方向以适应冠状面或矢状面切片需求。将包埋模具置于干冰上冷冻，直至OCT完全变白不透明（约10−15分钟）。将组织样品储存于-80 °C，待后续使用。

4. 用于免疫组织化学的 MADM 组织制备

  1. 将组织块用OCT包埋剂固定在冰冻切片机的样品盘上：在样品盘上涂一圈OCT，待其开始冻结时，将组织块直接放入OCT中。确保组织块朝向正确，以符合所需的切面方向。
    注意：此处详细描述用于分析大脑皮层MADM克隆的冠状切片方法。
  2. 将冰冻切片机中组织块的温度设为-20 °C，刀片温度设为-21 °C。
  3. 将样品盘安装到样品架上，使组织块在切片前于冰冻切片机内适应腔室温度约5分钟。
  4. 以较厚切片（45−60 µm）修块，直至暴露目标组织区域。
  5. 当皮层边缘清晰可见时，停止切片并锁定刀片。在修块前确保刀片已遮蔽保护。
  6. 用刀片修剪组织周围多余的OCT，使脑组织四周保留约1−2 mm的OCT。
  7. 随后调整组织块方向，使皮层的一侧外侧边缘朝下，另一侧朝上（即皮层最前部边缘指向右侧）。
  8. 开始切片，成年克隆切片厚度为45 µm，胚胎克隆为30 µm。每次单独切片，并使用小刷子清除刀片下方因修块残留的碎屑。
    注意：若未及时清理，一旦切片掉落，可能难以确定切片的正确顺序。
  9. 若切片出现卷曲，可修剪组织块边缘和/或小心调节玻璃防卷板。
  10. 对于胚胎克隆分析，将切片直接贴附至磨砂载玻片上，随后在37 °C加热板上干燥，并直接进入步骤5.6。
    注意：多个切片可置于同一张载玻片上，但需确保顺序连续。
  11. 为收集成年克隆切片，准备24孔板，每孔加入1 mL PBS（通常每只脑组织需5−6块板）。从第一孔开始，使用冷镊子按切片顺序将连续切片逐个收集于PBS中。
    注意：成年组织采用漂浮切片法，以确保无遗漏切片，且贴片后无皱褶。
  12. 当切至新皮层末端时，停止切片。
  13. 对于成年克隆，继续进行漂浮切片的贴片步骤。
    注意：切片可在4 °C的PBS中保存最多24小时。

5. 成像用成年组织切片的制备

注意：需要以下工具：小号画笔、培养皿、含0.5%吐温的磷酸盐缓冲液（PBS-T）、黏附载玻片（材料表）、封片介质（材料表）、盖玻片和镊子。

  1. 用 PBS-T 填充培养皿。
    注意：使用去污剂有助于封片过程。如果需要对对去污剂敏感的其他抗原（例如糖蛋白）进行染色，则最好省略吐温的添加。
  2. 将一张粘附载玻片放入 PBS-T 中，使其几乎被液体覆盖至标签处。
  3. 将第一个切片转移至 PBS-T 中。
  4. 使用小号画笔将切片移动到载玻片上，并按切割顺序排列。其余所有切片均以相同方式操作。
  5. 当所有切片就位后，将载玻片（约 12−16 个切片/张）放入避光的载玻片盒中。稍微抬起盖子，使切片完全干燥（约 10−20 分钟），以确保其在后续步骤中保持附着。
  6. 若需对其他抗原进行免疫组织化学染色，请直接进入第 6 或第 7 节。
    注意：对于胚胎时期样本，必须至少对 GFP 和 tdT 进行免疫染色（第 6 节）。对于成体克隆样本，仅在同时对其他抗原进行染色时才需要执行此步骤（第 6 和第 7 节）。
  7. 用 1× PBS 重新水化并洗涤切片一次，每次 5 分钟，以去除残留的 PBS-T。在载玻片上加入约 1 mL 用 1× PBS 稀释的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1 μg/mL），确保覆盖所有切片，孵育 15 分钟。
  8. 小心移除 DAPI 溶液，用 1× PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。去除多余的 PBS，干燥约 1−2 分钟，然后加入 110 µL 封片介质进行封固。用 24 × 60 mm 盖玻片封片，成像前至少干燥 3 小时。

6. 仅对 GFP 和 tdT 进行免疫染色

注意：本步骤对于胚胎克隆是必需的。

  1. 将载玻片水平放置于加湿的载玻片孵育盒中。用石蜡笔标记载玻片上的区域边界，以减少所需缓冲液的用量。
  2. 用 1× PBS 重新水化组织切片。为提高染色质量，建议使用新鲜切制的组织。
  3. 每张载玻片加入 250−400 µL 封闭缓冲液（含 0.5% Triton X-100 和 2−3% 正常驴血清的 1× PBS），确保覆盖所有切片区域。孵育 1 小时。
    注意：去污剂（Triton X-100 或 Tween-20）的浓度需根据所用的一抗种类进行调整，因为不同抗原对去污剂的敏感性存在差异。
  4. 移除封闭缓冲液，并将一抗用封闭缓冲液稀释后加入载玻片（每张载玻片 300−400 µL）。
    注意：例如，针对抗-GFP/抗-tdT（MADM）的标准一抗反应，可使用鸡抗-GFP（1:500）和兔抗-RFP（1:500）。
  5. 在 4 °C 下与一抗孵育过夜。
    注意：载玻片必须保持完全水平，且缓冲液需覆盖所有切片区域，否则可能导致染色不均或染色效果差。
  6. 次日早晨确认载玻片上的封闭缓冲液仍覆盖所有切片区域。若未完全覆盖，需在室温下重复孵育 3−4 小时。
  7. 移除一抗溶液，并在室温下用 1× PBS 洗涤 4 次，每次 10 分钟。
  8. 将二抗用封闭缓冲液稀释后加入载玻片（每张载玻片 300−400 µL）：Alexa Fluor 488 标记的抗鸡 IgG（1:500）和 Cy3 标记的抗兔 IgG（1:500）。
  9. 在室温下孵育 2 小时。孵育过程中需避光，以防荧光染料发生漂白。
  10. 移除二抗溶液，并用 1× PBS 在室温下洗涤 2 次，每次 10 分钟。
  11. 用 PBS 稀释 DAPI（1:5,000）孵育 15 分钟。
  12. 用 1× PBS 洗涤切片 1 次，每次 10 分钟。
  13. 吸除多余的 PBS，干燥约 1−2 分钟，然后加入 110 µL 封片介质进行封片。
  14. 用 24 × 60 mm 盖玻片封固，室温下干燥至少 3 小时后再进行成像。建议在完成免疫组织化学染色后的 1−2 周内完成载玻片的图像采集，以确保最佳信号强度。

7. GFP、tdT 及其他抗原的免疫染色

  1. 执行步骤 6.1−6.3。
  2. 移除封闭缓冲液，并将用封闭缓冲液稀释的一抗加入载玻片（300−400 µL/片）。
    注意：当同时染色三种或更多抗原（例如 GFP、tdT 和目标蛋白），且针对目标蛋白的一抗为兔源时，建议将抗 tdT（山羊源）一抗以 1:500 的比例稀释使用。例如，在针对三种抗原的染色反应中，若采用替代的 tdT 染色方案，可使用鸡抗 GFP 抗体（1:500）、山羊抗 tdT 抗体（1:500）以及针对目标蛋白的抗体（例如兔源抗体）。
  3. 执行步骤 6.5−6.7。
  4. 将用封闭缓冲液稀释的二抗混合液加入载玻片（300−400 µL/片）：Alexa Fluor 488 标记的抗鸡 IgG（1:500）、Cy3 标记的抗山羊 IgG（1:500）和 Alexa Fluor 647 标记的抗兔 IgG（1:500）。
  5. 执行步骤 6.9−6.14。

8. MADM 克隆的共聚焦图像采集与定量分析

  1. 鉴定并记录包含克隆及其在皮层中位置的脑切片。
    注意：一个克隆所跨越的切片数量取决于克隆诱导时间、CreERT2 驱动系以及分析时间。此步骤可在共聚焦显微镜或落射荧光显微镜上进行。
  2. 使用倒置共聚焦显微镜，首先选择并配置正确的激光线和滤光片。对于 MADM 脑样本，选择 DAPI、GFP 和 tdT（激发波长分别为 358 nm、488 nm 和 554 nm；峰值发射波长分别为 461 nm、507 nm 和 581 nm）。确保针孔设置为 1 个艾里单位，以获得最佳成像质量。
  3. 针对共聚焦成像的特定设置，使用 20x 物镜和 1x 缩放倍数对克隆进行成像。对于将用于定量分析的图像，扫描速度的像素驻留时间应设为 1.52−2.06 µs（图像采集软件中的数值 7−8），不进行平均处理。根据需要调整各通道的激光强度和增益设置。
    注意：根据所需的图像质量，扫描速度和平均次数的设置可能有所不同。
  4. 一旦清晰识别出克隆，应安排成像拼图以覆盖克隆中的所有相关切片。调整 z 轴堆栈，使克隆中所有 MADM 标记的细胞均被采集，z 轴切片间隔为 1.5 µm。调整拼图区域，确保成像时涵盖整个皮层宽度（即从软脑膜表面至胼胝体）。
  5. 连续成像跨越多个切片的单个克隆，确保即使在克隆范围内无细胞的切片也进行成像，以便进行三维重建并准确解读细胞的空间信息。
  6. 按顺序从皮层的头端至尾端逐一切片分析包含 MADM 克隆细胞的切片。根据细胞形态和/或标记染色区分单个神经元和胶质细胞。基于核染色（DAPI）定义的各层边界，同步记录细胞的位置信息。
    注意：胚胎期分析的代表性结果见图4，成年期分析的代表性结果见图5。

9. 克隆的连续三维重建

注意：对连续脑切片中成像的单个克隆进行三维重建，不仅有助于三维克隆结构的可视化展示，还可用于其三维结构的分析，具体操作可按照以下步骤进行。

  1. 根据采集参数，使用图像采集软件对共聚焦拼接图像进行缝合与融合。在ZEN软件（Zeiss）中打开.czi文件，然后在处理选项卡下运行拼接方法。
  2. 将拼接后的图像堆栈以单个z平面的形式导出为TIFF格式。打开已拼接的.czi文件，然后在处理选项卡下运行图像导出方法。对于多通道图像，应将其导出为红/绿/蓝图像，以便后续图像处理。
  3. 对一个克隆的所有连续脑切片重复步骤9.1和9.2。
    注意：为了实现准确的三维重建，克隆内的所有脑切片（包括未标记细胞的切片）都必须进行处理。
  4. 使用开源图像处理软件（如ImageJ/Fiji）67,68，按从最前（rostral）到最尾（caudal）的顺序，将单个图像合并为一个图像堆栈。
    注意：此时应移除每个脑切片边缘的空白图像。
  5. 如有需要，使用名为"MultiStackReg"的ImageJ插件，按照步骤9.5.1−9.5.5对步骤9.4获得的图像堆栈进行错位校正。若无需图像对齐，则直接进入步骤9.6。
    注意：该插件首先对对比度最高的通道（通常为DAPI）进行图像对齐，然后将记录的变换应用于其他通道，从而实现多通道图像堆栈的可靠对齐。必须预先安装一个名为"TurboReg"的辅助插件。
    1. 在ImageJ中安装"MultiStackReg"和"TurboReg"插件。
    2. 打开从步骤9.4获得的待对齐克隆图像堆栈。在图像选项卡下的颜色选项中，将通道拆分为DAPI（蓝色）、GFP（绿色）和tdT（红色）。
    3. 运行"MultiStackReg"插件，通过"刚体"变换对DAPI通道进行对齐，并保存变换文件。
    4. 使用"MultiStackReg"将保存的变换文件应用到其余两个通道。
    5. 合并所有三个对齐后的通道，并保存对齐后的图像堆栈。
  6. 在ImageJ中，将从步骤9.4（或对齐后的步骤9.5.5）获得的克隆图像堆栈旋转至垂直方向，使软脑膜表面位于上方，胼胝体位于下方。如有必要，在xy平面上进行裁剪。
  7. 为进行定性展示和定量分析，可生成克隆的最大z投影图像（步骤9.8）或进行三维渲染（步骤9.9）。
  8. 在ImageJ中打开步骤9.6的图像堆栈，选择Z投影选项，并设置投影类型为最大强度。这将生成整个克隆在同一平面上的投影图像。
  9. 在ImageJ中打开步骤9.6的图像堆栈，选择3D投影 z函数，以生成可旋转的克隆三维可视化图像。
    注意：此步骤中必须输入正确的切片间隔，即图像采集时单个z堆栈的厚度。应使用插值工具消除切片之间的间隙。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MADM 技术可在 G2-X 染色体分离事件后，使两个子细胞分别表达功能性的绿色或红色荧光蛋白（图1A）。由于 MADM 事件能够对两个子代细胞谱系进行永久且可区分的标记，因此可对表达绿色和红色荧光蛋白的子代细胞谱系（亚克隆）进行定量分析。由此可确定原始前体细胞的分裂模式（例如对称性与非对称性分裂）及其分化潜能（例如产生的子代细胞数量）。在逆向推断原始前体细胞在他莫昔芬（TM）诱导时是否正在进行对称性增殖分裂或非对称性神经源性分裂时，对每个荧光标记的亚克隆进行定量具有重要意义。以往研究将皮层中来源于 Emx1-CreERT2 或 Nestin-CreERT2 的兴奋性投射神经元克隆分为两大类7,11,46。第一类称为“对称性增殖克隆”，平均包含数量较多的神经元，且绿色和红色两个亚克隆各自均含有四个或更多神经元。第二类为“非对称性克隆”，其特征是“少数”亚克隆包含少于三个神经元，而“多数”亚克隆则含有四个或更多神经元11。这些定义主要适用于皮层放射状胶质前体细胞（RGPs），在应用于其他脑区或组织时可能需要重新评估。对于这两类皮层克隆，其子代细胞均会分布于皮层的浅层和深层。

在设计MADM克隆研究时，必须考虑若干因素。通过给予他莫昔芬（TM）诱导MADM事件的时间是一个关键考虑因素（图3）。在E10时期，使用Emx1-CreERT2或Nestin-CreERT2标记皮层兴奋性投射神经元的MADM克隆时，几乎所有放射状胶质前体细胞（RGPs）仍处于对称分裂阶段11。因此，在E10给予TM可捕获多轮增殖性RGP扩增过程，从而产生包含大量神经元的克隆。然而，E10时期的RGP数量通常较少，因此TM处理产生的MADM事件非常稀少（有时每只脑组织中不足一个）。大多数RGP在约E12时期由对称分裂转变为不对称的神经发生分裂。为了特异性靶向不对称神经发生的克隆，最佳诱导时间应为E12或更晚（图3）。TM诱导与在皮层中观察到MADM重组事件之间的时间通常短于24小时。对于胚胎期TM给药，腹腔注射（IP）是首选方法，因其在克隆诱导方面具有更高的可重复性。同时，将TM剂量保持在最低水平也至关重要，原因有二：首先，若MADM重组频率升高，则可能诱导多个甚至重叠的克隆；其次，若TM剂量过高，可能导致流产率升高、胚胎重吸收以及产仔数减少。当在E10给予TM注射时，约半数妊娠母鼠出现流产，该频率自E11起逐渐下降，至E12及以后降至约三分之一的妊娠母鼠发生流产。有关以往MADM研究中使用的TM剂量、诱导时间及CreERT2驱动子的总结，请参见表1。某些TM可诱导的CreERT2驱动子在未给予TM的情况下可检测到报告基因活性69。然而，在未给予TM的情况下，使用Emx1-CreERT2或Nestin-CreERT2驱动子均未观察到异位表达或MADM重组事件。这可能部分归因于TM介导的染色体反式重组的发生频率比顺式重组低约1:1,000至1:10,000，从而降低了异位MADM标记的可能性。

在规划MADM克隆分析实验时，另一个需要考虑的因素是研究的持续时间。通过改变他莫昔芬（TM）诱导与实验分析之间的时间长度（A）（即时间窗口），可以展示随时间变化的干细胞动态64。较短的胚胎期时间窗口（例如，TM/E11−A/E13；TM/E11−A/E16）可捕捉到胚胎期神经发生的动态过程（图4）。比较来自两个或多个不同时间窗口的克隆，可定量揭示不同时期谱系进展过程中产生的细胞数量以及神经元分布的变化情况64。为了全面捕捉单个克隆的全部潜能，有必要将分析的时间窗口延长至出生后甚至成年阶段7,11,12。在胚胎期诱导并在成年期进行分析的新皮质克隆示例如图5所示。值得注意的是，皮质神经发生主要在E17前完成，而胶质发生则在此之后逐渐增加。约有1/6的神经源性放射状胶质前体细胞（RGP）还会进一步生成星形胶质细胞和/或少突胶质细胞11。

当放射状胶质前体细胞（RGPs）经历一轮或多轮增殖性分裂时，会产生对称的克隆11。在E10至E12期间诱导产生的RGP克隆平均体积更大，并提供了更多关于最终神经元分布的空间特征（图4A-C）。神经元在深层和浅层皮质中分布相对均匀的克隆呈“圆柱”形，而神经元在浅层比深层更分散的克隆则呈“圆锥”形11。为了全面获取克隆的空间与形态学信息，有必要利用连续图像对每个克隆进行计算重建。为测量克隆的弥散程度，将克隆在浅层皮质（LII−VI）中的最大侧向弥散（在所有维度中测量）与深层皮质（LV/LIV）中的神经元弥散进行比较。该比值（上层分布∶下层分布）可定量反映克隆的整体形态。

不对称克隆中，少数亚克隆的数量为三个或更少，这为单个放射状胶质前体细胞（RGP）的神经元输出提供了见解（图4D-F 和 图5A-F）7,11,12。多数群体（大亚克隆）可被标记为红色或绿色，当使用Emx1-CreERT2 或 Nestin-CreERT2 诱导时，每个克隆平均约产生七个兴奋性投射神经元（图5G）7,11,12。通过分析大亚克隆中神经元在浅层和深层皮质中的分布，可进一步解析MADM克隆中的细胞总数。少数群体（小亚克隆）由互补颜色标记，平均每克隆含1−2个细胞（图5H）。将小亚克隆与大亚克隆相加，可计算出平均为8−9个神经元的总“单位大小”（图5I）7,11,12。需要注意的是，尽管RGP的神经元输出具有高度可预测性，但仍存在一定程度的克隆异质性12,70。

在MADM盒远端引入突变可实现遗传嵌合体的构建，从而提供一种独特的方法来解析干细胞谱系发育的分子调控机制。因此，MADM为研究基因的细胞自主性功能（例如其与小头畸形或大头畸形的关联）提供了无与伦比的实验平台。通过比较在MADM遗传嵌合体中诱导产生的克隆与对照MADM中诱导的克隆，可以获得神经元数量和分布变化的高度定量读数。以往基于MADM的研究已在克隆水平上定量分析了Otx1在小头畸形形成中的细胞自主性功能（代表性示例见图6A-E）11。在另一项研究中，MADM克隆分析表明，Ndel1并不以细胞自主性方式调控投射神经元的数量，而是调控新生神经元进入皮层板或在皮层板内迁移的能力，而皮层板最终将发育为成年大脑皮层46。这些研究展示了MADM克隆分析在研究调控皮层发育基因的细胞自主性功能方面的高度定量特性。目前文献中尚无在克隆水平上利用MADM研究与大头畸形相关基因的实例。然而，在未来的研究中，对总体上调控皮层大小相关基因的分析，将可在分子和细胞水平上提供极具价值的见解。

GeneX 重组过程；染色体间示意图；G1、G2 期；遗传嵌合体分析。
图1：利用 MADM 在单个干细胞水平进行谱系示踪和克隆分析的原理。（A）为了使用 MADM 进行谱系示踪和克隆分析，必须具备两个组分。首先，MADM 盒必须被靶向整合到同源染色体上的相同位点。MADM 盒由两个嵌合型荧光报告基因组成：eGFP（绿色，[G]）和串联二聚体番茄荧光蛋白（红色，tdT[T]）。GT 盒包含 eGFP 的 N 末端和 tdT 的 C 末端，两者之间由一个含有 loxP 位点的内含子隔开。TG 盒则相反构建，包含 tdT 的 N 末端和 eGFP 的 C 末端。其次，必须在含有靶向 MADM 盒的细胞中表达 Cre 重组酶。loxP 位点作为 Cre 介导的染色体间重组的靶点，从而同时重建两个表达盒。如果该重组发生在细胞周期的 G2 期，并伴随 X 型分离（G2-X），则两个子细胞将分别表达两种荧光蛋白中的一种。（B）在单克隆水平上进行遗传嵌合体分析的 MADM 原理。可通过减数分裂重组将突变等位基因（如点突变、缺失、插入、如 图1B 所示的 loxP 侧翼条件性等位基因等）引入 TG-MADM 盒的远端（详见 图2 及 Hippenmeyer 等人46 中关于如何将突变等位基因引入 MADM 系统的详细说明）。当 MADM 盒之间发生由 Cre 重组酶介导的 G2-X 期染色体间反式重组时，将产生一个 GFP+ 的纯合突变细胞（GeneX-/-），用于研究目标基因，以及一个 tdT+ 的纯合野生型细胞（GeneX+/+），二者均处于未标记的杂合背景中46,47,71。其他类型的标记结果（例如黄色细胞）在克隆分析中不被使用，其机制已有详细描述11,46,47。请点击此处查看该图的放大版本。

MADM小鼠的生成过程；遗传图谱；谱系示踪；干细胞分析；重组方法。
图2：用于谱系示踪实验MADM小鼠的繁育方案。 用于克隆分析的对照MADM（A）和Gene X MADM（B）实验小鼠的繁育方案。有关MADM繁育模式的更多信息，请参见Beattie等7和Hippenmeyer等7,46。请点击此处查看该图的放大版本。

MADM谱系分析示意图；大脑皮层时间进程，纵向，渐进式取样。
图3：基于MADM的克隆谱系分析的时间进程方案。 实验设计时间窗口的示意图。在纵向取样方案中，克隆诱导的时间点保持恒定，而分析前的持续时间有所不同；在渐进式间隔取样方案中，分析的时间点保持恒定，但诱导时间有所变化。可根据所研究的科学问题，选择使用其中一种或两种方案的组合。请点击此处查看该图的放大版本。

对称与不对称RGP分裂；示意图与荧光显微镜结果；大脑发育。
图4：发育期及成年新皮层中的MADM克隆分析。 在对称性增殖（E10时给予他莫昔芬，TM）(A-C) 和不对称性神经发生（E12时给予TM）(D-F) 分裂的放射状胶质前体细胞（RGPs）中，通过TM介导的MADM克隆诱导。图中展示了在发育期（TM/E10−A/E16 和 TM/E12−A/E16）(B,E) 及成年期（TM/E10−A/P21 和 TM/E12−A/P21）(C,F) 的活体MADM单克隆，所用小鼠品系为 MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) 和 MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F)。在对照条件下，神经元产出与亚克隆颜色无关，绿色占优/少数亚克隆可与红色占优/少数亚克隆进行比较7,11。约六分之一的成年克隆还包含星形胶质细胞和/或少突胶质细胞，以白色星号标示。图B 和图F 分别经Hippenmeyer等人46 和Rulands与Simons72 许可转载。CP = 皮层板。请点击此处查看该图的放大版本。

不对称神经发生克隆分析示意图；包括 MADM 实验设置和采样结果。
图 5：利用 MADM 克隆分析定量 RGP 介导的神经元输出。 使用 MADM7,11 在克隆水平上分析单个神经发生性放射状胶质前体细胞（RGP）产生的兴奋性神经元（单位）。(A) 在发育中的大脑皮层中诱导主要为不对称 MADM 克隆的实验范式。(B) 可能的不对称克隆结果，其中大部分子克隆标记为绿色或红色。(C) 跨越单个神经发生性不对称克隆的代表性连续切片。(D,E) 在 MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- 小鼠中，于 E12 期给予他莫昔芬（TM）诱导并在 P21 期进行分析，获得的代表性不对称 G2-X MADM 克隆的三维重建图像，其中多数细胞群标记为红色 (D) 或绿色 (E)。注意，绿色和红色标记的细胞均为野生型。(F) 示意图显示两种可能的实验性 MADM 克隆结果。(G) 对来自自我更新 RGP 的 MADM-11 克隆中多数群体大小的定量分析。(H) 对来自自我更新 RGP 的 MADM-11 克隆中少数群体大小的定量分析。(I) 不对称神经发生性 MADM-11 克隆单位大小的定量分析。假设数值可表示为均值 ± 标准误（SEM）。比例尺 = 100 µm (D 和 E)。TM = 他莫昔芬（Tamoxifen）。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于研究基因突变对神经元投射影响的MADM克隆分析示意图及图表。
图6：利用MADM克隆分析研究导致小头症和大头症的基因。 对导致小头症或大头症的候选基因进行功能遗传学解析时，假想的MADM克隆分析结果。为了剖析目的基因（Gene X）在神经元输出中的细胞自主性功能，MADM技术需要通过减数分裂重组将突变等位基因引入MADM盒的远端（有关如何将突变等位基因引入MADM系统的详细信息，请参见图2、Hippenmeyer等46以及Laukoter等46,73）。(A,B) 表示用于克隆RGP单元功能分析的实验性MADM范式的示意图。突变亚克隆可构成少数（A）或多数（B）细胞群体。(C-E) 在定量分析对照MADM（白色柱状图）、Gene-X MADM小头症（灰色柱状图）和Gene-X MADM大头症（黑色柱状图）的不对称克隆时，假想的MADM克隆分析结果。(C) 多数群体大小的定量分析。(D) 少数群体大小的定量分析。(E) 不对称神经发生克隆的单体大小定量分析。假想数值可表示为均值 ± 标准误（SEM）。S = 假想情景，其中亚克隆细胞数量与对照组相比可能达到统计学显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：文献中的MADM克隆研究。 文献中包含MADM克隆谱系实验的研究汇总，包括所使用的CreERT2驱动子、他莫昔芬（TM）剂量及注射时间。请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种利用MADM在发育中的新皮层体内追踪单个放射状胶质前体细胞（RGP）谱系的方法。当与他莫昔芬（TM）诱导型CreERT2系统联合使用时，MADM事件的发生时间可被精确控制，从而在单细胞水平上对干细胞分裂模式提供高度定性和定量的可视化读出。通过调节TM的给药剂量，在理想情况下，每个大脑半球皮层平均可获得少于一个克隆，从而实现足够的空间分离，明确区分各个独立克隆。该方法在保持组织完整性的前提下，还能获取有关细胞位置、形态以及绝对细胞数量的关键信息。目前已有研究在染色体11（Chr. 11）7,11,12,46,56,57、染色体7（Chr. 7）51以及Rosa26位点的原始MADM系统47,53,59上开展MADM克隆分析研究。该技术在单细胞水平上的高分辨率，前所未有地揭示了子代细胞的形态特征及其克隆关系，并允许对增殖中的干细胞及新生克隆进行活体成像46,52。

剖宫产及通过代孕母鼠哺育幼鼠，以分析出生后时间点的克隆情况，是本实验方案中必要且关键的步骤。根据经他莫昔芬（TM）处理的妊娠母鼠的健康状况，可能无需进行剖宫产。然而，仍需使用代孕母鼠哺育幼鼠，因为经TM处理的母鼠可能存在泌乳困难。在使用不同CreERT2驱动系时，对代孕哺育的需求未观察到差异。MADM小鼠品系和代孕母鼠均维持在远交CD-1遗传背景上。如果无需进行剖宫产，则用于产生实验幼鼠的经TM处理的妊娠母鼠，可根据3R原则重复用于后续的实验性交配（需注意，仅当动物实验许可允许时方可执行此操作）。代孕母鼠可在其自身分娩后2天内用于哺育幼鼠，但当代孕母鼠与需寄养的实验小鼠同日分娩时，寄养成功率更高。因此，在步骤1.1中，必须同步安排代孕母鼠的定时交配。维持寄养幼鼠数量与代孕母鼠自身产仔数相近，有助于提高寄养幼鼠的存活率，因此可能需要移除部分甚至全部代孕母鼠的亲生幼鼠。其他可能提高寄养成功率的措施包括：用垫料和食物擦拭实验人员的手套（以去除手套的气味）；剖宫产后用代孕母鼠污染过的垫料和巢材轻轻擦拭幼鼠；以及在将寄养幼鼠放入代孕母鼠笼具前，先使其与代孕母鼠的亲生幼鼠密切接触。

与其他基于报告基因的谱系示踪方法类似，在为MADM克隆实验选择最合适的CreERT2驱动子时，必须仔细考虑。首先，所使用的启动子必须在时间和空间上针对目标前体细胞群体表达重组酶。找到这样的启动子可能具有挑战性，因为某些启动子在发育的不同阶段可能会改变表达模式或被沉默。为了提高细胞类型特异性，已有研究采用多个位点特异性重组酶，每个重组酶由不同的启动子驱动。当一个或两个重组酶在同一细胞中表达时，该细胞及其子代将被荧光报告基因标记74,75,76,77。总之，选择一个特异性针对所分析前体细胞群体的CreERT2驱动子至关重要。

该方法中最关键的步骤是克隆的鉴定，因为所有细胞必须明确地源自单个重组事件（步骤 8.1）。通过滴定他莫昔芬（TM）浓度，可确保每侧脑半球中红色/绿色细胞簇少于一个，从而最大化分析单个克隆的概率（步骤 2.2）7,11。如果目标克隆周围 500 µm 范围内存在相邻的细胞簇，则应舍弃该克隆。因此，在克隆出现前后需检查多个切片，以确保附近无其他重组事件。由于荧光信号较弱，对胚胎期克隆需进行 eGFP 和 tdT 的免疫组织化学染色（见第 6 节）。仅当需要共标记其他抗原时，才建议对成年期克隆进行此操作。在成像克隆时，必须完整捕获克隆所在皮层的全层宽度（即从软脑膜表面至胼胝体；见步骤 8.4），以免遗漏任何细胞。这也有助于图像处理过程中的图像对齐（第 9 节）。本方案的第 8 节需要倒置共聚焦显微镜，但可根据实际可用的显微镜配置进行调整。可使用落射荧光显微镜，但推荐使用共聚焦显微镜，因其可减少焦平面外的光污染。同时，必须调整激光强度和增益，以便明确区分绿色、红色和黄色细胞。无论使用何种配置，均建议采用至少 20x 的物镜，以确保紧密排列的细胞之间实现充分的空间分离。除记录所有细胞的皮层深度外（步骤 8.6），还必须利用脑图谱（如 Allen 脑图谱或其他立体定位坐标图）确定克隆所在的皮层区域。此外，应采用统一的文件命名规范，以确保克隆图像易于识别。文件名中可包含以下信息：唯一图像编号、成像日期、动物基因型、诱导年龄、分析年龄，以及该图像在同一批克隆图像中的序号。

在距离一个MADM盒较远的位置引入突变，可特异性地产生遗传嵌合体71，并能够在克隆水平上解析调控谱系和细胞类型多样性的分子机制7,11,46,62。为了利用MADM生成遗传嵌合体，MADM盒必须在减数分裂过程中与目标基因位于同一条染色体上（繁殖方案见图2）。因此，目前使用MADM进行的克隆分析仅限于位于7号染色体51、11号染色体46、12号染色体51以及位于Rosa26位点远端的6号染色体上的基因47。未来的研究将开发靶向任意染色体的MADM盒，从而几乎可在克隆水平上对小鼠基因组中的所有基因进行嵌合分析。

最后，MADM 并不限于分析发育中新皮层中的前体细胞。许多干细胞微环境的研究都可以受益于解析克隆相关细胞时空排列的能力。通过将 MADM 应用于大脑的其他区域、疾病状态（例如癌症）或其他组织47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59，研究揭示了来自不同类型前体细胞和干细胞克隆的谱系关系（当前 MADM 克隆研究的完整列表见表1）。MADM 另一个有趣的未来应用方向是将其与额外的功能性或亚细胞报告系统相结合，这将提高从克隆中获取信息的广度和深度。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Hippenmeyer实验室所有成员的讨论，感谢奥地利科学技术研究所（IST Austria）的生物成像设施、生命科学设施和临床前设施提供的技术支持。本工作得到了奥地利科学技术研究所机构经费的支持；R.B. 获得了奥地利科学基金（FWF）Lise-Meitner项目（M 2416）的支持；N.A. 获得了奥地利科学基金（FWF）Firnberg项目（T 1031）的支持；GC 作为ISTplus博士后研究员，获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议（No. 754411）的支持；A.H. 获得了奥地利科学院（ÖAW）DOC博士生奖学金（Doctoral Fellowship of the Austrian Academy of Sciences）的支持。本研究还获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下授予S.H.的资助（基金协议No 725780 LinPro）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 结核菌素注射器（Omnifix Luer Lock）Braun9204512N
1,4-二氮杂二环辛烷（DABCO）Roth0718.2
10 mL 注射器（Omnifix Luer Lock）Braun8508429N
15 mL 锥形离心管Sarstedt65.554.502
24 孔板Roth/Greiner Bio-oneCE56.1
27号×3/4英寸针头（Sterican）Braun16010256E
玉米油SigmaC8267-500ML
盖玻片（24 × 60 mm，1号）赛默飞世尔科技（Menzel）15747592
Cryostat Cryostar NX70Thermo Fisher Scientific957000H
Dako笔（蜡笔标记笔）安捷伦S200230-2
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）InvitrogenD1306
一次性切片刀（MX35 Ultra）Thermo Fisher Scientific705830
精细镊子（Dumont #5）Fine Science Tools (FST)11254-20
玻璃防滚板组织相容性M 449980
甘油SigmaG5516
LSM 800 共聚焦显微镜Zeiss
封片剂25 mg/mL DAPCO，6 g 甘油，2.4 g Mowiol 4-88，6 mL dH₂O20.12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)
Mowiol 4-88Roth0713.2
正常驴血清创新研究IGDNSER100ML
ParaformaldehydeSigma441244-1KG
Peristaltic pump 323E/D 400RPMWatson-Marlow036.3124.00A
蔗糖SigmaS8501-5KG
Superfrost Plus 玻璃载片Thermo Fisher ScientificJ1800AMNT
他莫昔芬SigmaT5648
组织包埋模具 T-12（22 mm 方形）Polysciences Inc.18986-1
Tissue-Tek O.C.TSakura4583
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Trizma盐酸盐Sigma93363
吐温-20SigmaP9416-100ML
<强>软件与插件：
Fiji1.52pFiji
MultiStackReg1.45下载链接
TurboRegEPFL 生物成像
禅蓝2.6Zeiss
<强>实验模型：生物体/品系：
小鼠： <4℃过夜，置于至少五倍于脑体积的新鲜4%多聚甲醛中。>Emx1-CreER杰克逊实验室JAX:027784
小鼠 <在4℃下，将脑组织置于至少五倍于脑体积的新鲜4%多聚甲醛中固定过夜。>MADM-11-GT杰克逊实验室JAX:013749
小鼠： <在4℃下，将收获的器官置于至少五倍于脑体积的新鲜4%多聚甲醛中过夜。>MADM-11-TG杰克逊实验室JAX:013751
<强>一抗：
鸡抗GFP 1:500Aves LabsGFP-1020
山羊抗tdTomato 1:500Sicgen 抗体AB8181-200
兔抗 RFP 1:500MBLPM005
<强>二抗：
驴抗鸡 Alexa Fluor 488 1:500Jackson Immuno Research715-475-150
驴抗山羊Cy3 1:500杰克逊免疫研究705-165-147
驴抗兔 Cy3 1:500杰克逊免疫研究711-165-152

参考文献

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