方法文章

商业化品系快速生长无菌肉鸡的生产及其在微生物组研究中的应用

4.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61148

⸱

2020年6月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRAE, PFIE, UE-1277, 2INRAE, ISP, Université de Tours

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用商品化肉鸡品系Ross PM3的种蛋制备无菌雏鸡的方法。该方法可经适当调整后用于其他禽类物种无菌动物的制备。

摘要

由于无菌动物模型的可获得性，研究肠道微生物群对宿主生理功能和免疫能力的贡献得以实现，而无菌动物模型被认为是金标准。鸟类因其无需在无菌条件下饲养其亲代，是制备无菌动物的理想模型。目前的无菌鸡主要来源于特定病原体阴性（SPF）实验品系，但这些品系难以代表商业化的鸡品系。 本文提出的方法实现了从肉鸡产业广泛使用的快速生长型肉鸡品系Ross PM3中培育无菌鸡。 鸡蛋在肉种鸡场产下后立即收集。 从收集到转入无菌孵化隔离器的整个过程中，鸡蛋均经过严格的去污处理。 雏鸡在无菌隔离器中孵化，并在确认其无菌状态所需的期间内持续维持于该无菌环境中。本方案最初为SPF白来航鸡实验品系开发，现已成功适配于Ross PM3肉鸡品系，同时也适用于鹌鹑。因此，该方法是一种稳健且易于推广的流程，可广泛应用于其他具有经济、生物或生态意义的家禽及筑巢鸟类。

引言

近年来，科学界和公众对肠道微生物群在动物健康中所起作用的兴趣显著增加。肠道微生物群由栖息在动物肠道不同生态位中的细菌、病毒、真菌和古菌组成，直接或间接参与调控炎性疾病、感染性疾病和代谢性疾病，这些疾病不仅影响哺乳动物，也影响家畜，如家禽1。为更深入研究肠道微生物群在健康与疾病中的作用，已开发出多种动物模型。例如，无菌动物和已知菌群动物可分别用于研究完全缺乏微生物或特定微生物群对感染性疾病的生理病理影响2,3。然而，这些动物的培育和维持需要专门的技术和设施，其高昂的成本、繁重的劳动强度以及所需的专业技能限制了众多研究人员的使用。事实上，必须定期监测无菌动物是否可能受到污染，监测方法包括细菌培养、显微镜检查、血清学检测、大体形态学观察以及基于测序的检测技术。类似的操作流程也适用于其他物种，例如家畜，这些动物体型通常更大，其繁殖和维持需要更大的设施，这在一定程度上阻碍了微生物群相关研究的开展。

家禽，尤其是鸡，是全球畜牧业生产的核心，每年饲养数量可能超过400亿只。鸡是全球最重要的动物蛋白来源（http://www.fao.org/poultry-production-products/en/）。此外，鸡的饲养和食用不存在任何文化或宗教禁忌。家禽肠道微生物群在动物的生长、饲料转化率、免疫功能、抗病原体能力以及其他多种营养、生理或病理过程中发挥着重要作用4。因此，无菌鸡的制备对于阐明微生物群与其宿主之间的相互作用至关重要4。尽管微生物群落存在于鸡的输卵管中5，但健康母鸡刚产出的鸡蛋内容物通常几乎不含微生物，蛋壳和蛋膜具有机械屏障作用，可防止微生物侵入4。此外，雏鸡易于在没有亲代照料的情况下饲养，这一点与哺乳动物不同，使得在无菌条件下无需亲代抚育即可生产无菌动物成为可能。

实验设施“农场动物、模式动物与野生动物感染生物学”（PFIE，UE-1277，法国国家农业食品与环境研究院卢瓦尔河谷中心，努济伊，法国，https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12）是法国国家基础设施网络EMERG’IN（https://www.emergin.fr/）的组成部分。PFIE在无菌鸡的生产方面已有40多年的经验，用于开展各类实验研究7,8,9,10,11。这些动物来源于自20世纪70年代起在封闭环境中繁育的白来航蛋鸡品系的无特定病原体（SPF）鸡蛋。无菌禽类主要用于微生物学研究7,8,9，近年来因其在肠道微生物群对行为13、营养利用14、免疫系统发育15及内分泌活动影响等方面的研究而重新受到关注。尽管已有使用无菌肉鸡品系的研究发表16，但相较于使用实验蛋鸡品系的研究，相关报道仍较少。随着科学问题逐渐转向微生物群与宿主在禽类健康与福利方面的相互作用，我们对原有技术方案进行了改进，以生产目前全球使用最广泛的肉鸡品系——Ross PM3品系的无菌肉鸡。

方案

动物护理程序遵循欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）以及法国关于动物实验的法规。

1. 隔离器准备

  1. 在正压硬质隔离器内放入所需材料：50 mL 离心管、5 mL、10 mL 和 25 mL 塑料移液管、辐照饲料、高压灭菌水以及无菌密封塑料容器。
  2. 用 2% 季铵盐溶液填充转移用杀菌捕集器。
  3. 使用甲醛蒸气对隔离器进行三次灭菌，每立方米（m3）使用 60 mL 福尔马林（24% 甲醛）与 30 g 高锰酸钾反应。每次灭菌之间移动隔离器内的材料，以确保所有接触表面均被灭菌。
  4. 在引入卵之前，至少提前 2 天将隔离器温度设定为 37 °C。在引入当日，将湿度计调节至相对湿度（RH）65–70%。

2. 卵的收集与孵化

  1. 根据产蛋鸡群良好的孵化率（产蛋高峰期至少达到80%）以及良好的卫生状况（即无常见家禽病原体，且鸡群中无疾病发生），选择合适的农场收集鸡蛋。在传送带上通过肉眼挑选清洁且无瑕疵的鸡蛋。
  2. 将鸡蛋在室温下浸入1.5%过氧乙酸溶液中5分钟，立即对蛋壳表面进行去污处理。
  3. 使用经甲醛蒸气消毒的容器将鸡蛋运送至实验场所。
  4. 将鸡蛋在4 °C条件下储存24小时。重复步骤2.2中所述的去污程序，并将其放入孵化 incubator（第0天）中孵化19天。

3. 孵化

  1. 第19天，在无菌条件下使用检卵灯通过透光法检查受精率、存活率（运动能力）及胚胎发育情况。 仅将活体孵育的鸡蛋放入无菌孵化隔离器中。
  2. 用1.5%过氧乙酸溶液喷洒选定的卵，持续30秒，或直至每个卵的整个表面均被覆盖，以进行去污处理。在将卵转移至隔离器的过程中，卵与喷雾接触时间共计16分30秒。
  3. 将卵转移至无菌孵化隔离器中，用无菌去离子水冲洗，然后放入孵化区域。
    注意：动物在无菌隔离器中孵化并饲养。它们被喂食 随意摄取 使用经γ射线灭菌的商业饲料，并通过饮水器提供经高压灭菌的自来水。

4. 细菌学状态分析

  1. 孵化后一天，直接从不同雏鸡的直肠中采集粪便样本，并将其汇集至一个灭菌的玻璃管中，以使该样本能够代表给定隔离器内所有动物的状况。
  2. 由于粪便样本呈不同程度的液态，向其中加入相当于1 mL粪便于9 mL含刃天青的巯基乙酸盐肉汤中。将剩余粪便样本加入9 mL脑心浸出液肉汤（BHI）中，并将试管置于37 °C静置培养18至48小时。此步骤可促进多种需氧菌、兼性厌氧菌及非苛养厌氧菌的生长。
    注意：含刃天青的巯基乙酸盐肉汤主要用于检测非苛养厌氧菌，但也适用于需氧菌的检出。该培养基符合欧洲、美国和日本药典对无菌检测的要求18,19,20。
  3. 在培养18小时后肉眼观察培养基是否发生任何变化。48小时后，取一滴BHI粪便肉汤培养物置于载玻片上，在显微镜下（40倍放大）观察是否存在细菌。
  4. 若怀疑存在细菌，可从BHI培养物中取样接种至BHI琼脂平板，于37 °C培养18至48小时。
  5. 若出现菌落，应采用MALDI-TOF质谱等高通量技术进行精确的微生物鉴定。
    注意：若72小时后细菌学分析结果为阴性，则判定动物为无菌级。

结果

共进行了六轮无菌雏鸡的制备，所用Ross PM3鸡胚来自法国两个不同的农场（表1）。总共收集了853枚鸡蛋，经过两次去污处理并孵化19天后，存活率为86.40%。其中490枚存活的鸡蛋接受了第三次去污处理，并被转入不同的孵化隔离器中，平均孵化率为79.80%。相对于最初收集的鸡蛋总数，该孵化率为68.94%。

然而，孵化结果因实验批次的不同而存在显著差异：与收集的卵数相比，活雏鸡的比例在41.67%至88.16%之间。在同一实验中，不同孵化批次之间也观察到了此类变异。由于并非所有隔离器在所有运行中都被使用，因此难以排除隔离器依赖性效应的影响。然而，该批次效应与产蛋母鸡的年龄直接相关（图1），来自较老年母鸡的卵其存活率较低。

使用四种不同的孵化隔离器进行了六次实验。经过细菌学检测后，16个隔离器中的14个所饲养的动物被确认为无菌动物，成功率为87.5%。其余两个隔离器被一种环境来源的非致病性细菌污染。

所有用于科学实验的动物在孵化后至少三周内直至研究结束均保持无菌状态。

卵存活率比较图表；D19 与孵化率，按孵化周数（第6周至第26周）划分。
图1：母鸡年龄对孵化率的影响 本图展示了基于产蛋母鸡群年龄（以产蛋周数表示）所观察到的孵化率。请点击此处查看此图的放大版本。

收集的卵D19 可存活卵D19 可存活卵/收集的卵转入隔离器 1 的卵转入隔离器 2 的卵转入隔离器 3 的卵转入隔离器 4 的卵转移卵总数在隔离器 1 中孵化的可存活雏鸡在隔离器 2 中孵化的可存活雏鸡在隔离器 3 中孵化的可存活雏鸡在隔离器 4 中孵化的可存活雏鸡可存活孵化雏鸡总数隔离器1中孵化/转移卵的可存活率隔离器2中孵化/转移卵的可存活率隔离器3中孵化/转移卵的可存活率隔离器4中孵化/转移卵的可存活率总体孵化/转移卵的可存活率
运行 11019392.08%2324--472223--4595.65%95.83%95.74%
运行 213011790.00%25252575202418-6280.00%96.00%72.00%82.67%
运行 31329773.48%26-26459714-1328*2753.85%50.00%62.22%56.70%
运行 413011689.23%3635--713334--6791.67%97.14%94.37%
运行 518014882.22%3030303012026*2517246686.67%83.33%56.67%80.00%76.67%
运行 618016692.22%-4040-80-3535-7086.67%87.50%87.50%87.50%
总计85373786.40%1401541217549089141832433782.14%91.56%68.60%69.33%79.80%

表1：不同孵化实验的技术结果。 本表总结了进行的6组无菌孵化实验的结果：收集的鸡蛋数量、孵化第19天时胚胎的存活率，以及在不同隔离器中成功孵化的健康雏鸡数量。

讨论

已有多种方法被用于制备无菌鸡，此前已有相关报道7,21,22。其中一些简单的方法（例如本文所述方法）通过使用不同的消毒剂来减少蛋壳表面及隔离器内的细菌载量。最常用的消毒剂包括氯化汞、季铵盐、碘仿、次氯酸钠和二氧化氯溶液。这些方法的结果通常令人满意。然而，尽管这些方法易于实施，但能够应用该技术并大规模饲养无菌鸡的机构仍然较少，因此无菌鸡的应用相对罕见，仅用于回答某些特定的科学问题。本文所描述的方法、材料和设备可实现高效的无菌肉鸡孵化率，且雏鸡在至少3周内保持健康和无菌状态（该时间覆盖了其用于科学研究的实验周期）。

结果表明，将该方案改进后用于从商业家禽养殖场收集的鸡蛋中生产无菌雏鸡是成功的。 在SPF鸡蛋生产方面的经验表明，孵化效率主要取决于产蛋母鸡的年龄以及所收集鸡蛋的质量。在选择养殖场和收集鸡蛋时，已充分考虑了这两个参数。采用相同方法，无菌肉鸡的平均孵化率明显优于本机构此前SPF蛋鸡生产的孵化率（79% vs 35%），且未影响动物的无菌性（87% vs 83%）。这些差异可能与禽类的遗传背景（肉鸡与蛋鸡）有关，也可能与蛋壳质量有关，SPF动物由于已封闭繁育超过40年，其鸡蛋的蛋壳可能更为脆弱。此外，我们还证明，从养殖场到实验设施的运输时间超过2小时并不会影响孵化效率和雏鸡质量。

尽管用于孵化隔离器的灭菌程序以及鸡蛋去污方案已经过优化，但仍有约10%的隔离器未能达到无菌状态。 为了查明污染来源，在引入鸡蛋之前对孵化用隔离器进行常规无菌检测至关重要。

关于鸟类的无菌状态，我们尝试采用能够从粪便样本中培养需氧菌和非苛养厌氧菌的方法，从而确保检测到的是存活且具有活性的细菌。这些方法符合国际药典对无菌检测的要求，代表了一种快速、简便且成本较低的常规检测技术。然而，分子生物学技术（如16S rRNA基因测序）虽然无法提供有关细菌活性的信息，但可用于确认不可培养细菌的存在。事实上，最近一项研究表明，母体输卵管微生物群中的某些细菌可通过蛋清传递给胚胎，并随后构成胚胎肠道菌群的主体5。此外，另一项研究指出 早期胚胎所携带的部分微生物定植者源自母鸡，而肠道微生物的丰度和多样性在后续发育过程中则受到环境因素和宿主遗传背景的影响23。然而，这些研究结果基于DNA序列分析，其中大量检测到的细菌可能已在蛋清（富含抗菌分子）中死亡或无法增殖。Thomas及其合作者16通过将粪便样本接种于BHI平板并检测可培养的需氧菌和兼性厌氧菌来进行无菌检测，从而凸显了标准细菌学方法在无菌控制中的有效性。此外，在本研究所提出的方案中，我们采用含刃天青的硫乙醇酸盐肉汤进行生长监测，以检测非苛养厌氧菌的生长。

该方案已用于无菌鹌鹑和鸡的制备，可适用于大多数筑巢鸟类无菌动物的生产，为研究这些动物微生物群对其生理功能的贡献提供了可能。除了利用该模型研究家禽肠道中宿主与微生物群之间的相互作用外，该模型还可用于应用研究。例如，可用于评估来源于鸡肠道共生微生物的益生菌在改善动物健康和抗逆性方面的安全性和有效性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢育种者及 Boyé accouvage 协会（法国 La Boissière en Gâtine）提供受精卵。本研究是在法国中央-卢瓦尔河谷大区资助的研究联盟 APR-IA “INTEGRITY”（2017–2019）的指导下开展的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL 无菌塑料移液管Starsted86.1252.001
50 mL 离心管Falcon
BHI 琼脂平板Thermo fisher diagnosticPO1198A
脑心浸出液肉汤Thermo fisher diagnosticCM1135
含 9 mL BHI 肉汤的玻璃试管自制，并通过高压灭菌进行灭菌
含 9 mL 带刃天青的硫乙醇酸盐肉汤的玻璃试管自制，并通过高压灭菌进行灭菌
孵化用培养箱FiemeMG 576
培养箱Memmert用于细菌培养，37 °C
辐照饲料SafeU8983G10R经 40 kG 辐照处理
隔离器自制。1 m3 刚性隔离器，正压环境
微生物安全柜thermon electron corporation型号：Hera Safe
Visiscope 系列 300 显微镜VWR
移液器辅助器Drummond
塑料移液管
无菌密封盒Tuperware直径
灭菌玻璃管"sovirel"
含刃天青的硫乙醇酸盐肉汤Merck90404-500G
水浴锅Fisher scientific型号：polystat 36，用于将含 9 mL 带刃天青的硫乙醇酸盐肉汤的玻璃试管在 100 °C 下孵育 10 分钟，以再生培养基

参考文献

  1. Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. Chicken microbiota: importance and detection echnology. Frontiers in Veterinary Science. 23, 5(2018).
  2. Grover, M., Kashyap, P. C. Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology. Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).
  3. Umesaki, Y. Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).
  4. Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fernández, M. E. Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection? Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374(2019).
  5. Lee, S., et al. Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota. International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838(2019).
  6. Hincke, M. T., et al. Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation. Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).
  7. Le Bars, J. Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens. Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).
  8. Lafont, J. P., et al. Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens. Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).
  9. Brée, A., Dho, M., Lafont, J. P. Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors. Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).
  10. Dozois, C. M., et al. Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli. Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).
  11. Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization. Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).
  12. Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Brée, A., Schouler, C. Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain. PLoS One. 7 (4), 35475(2012).
  13. Kraimi, N., et al. Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica). of Experimental Biology. 222, (2019).
  14. Stanley, D., et al. Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens. Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).
  15. Han, Z., et al. Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens. Infection and Immunity. 85 (11), 0038017(2017).
  16. Thomas, M., et al. Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken. mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).
  17. Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks. British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).
  18. European Pharmacopoeia. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , reference 01/2009:20601 (2009).
  19. Japanese Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia. Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , made official March 31, 2009, by the Ministry of Health, Labour and Welfare Ministerial Notification No. 190 (2009).
  20. United States Pharmacopeia (USP). United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), December 1, 2008, official on May 1, 2009 (2008).
  21. Harrison, G. F. Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods. Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).
  22. Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. A simple method for production and rearing of the germ-free chick. J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).
  23. Ding, J., et al. Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens. Frontiers in Microbiology. 8, 1967(2017).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PM3

相关文章