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方法文章

用于研究叶际和蔬菜发酵中微生物组组装的无菌系统

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DOI：

10.3791/61149

⸱

2020年6月3日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Tufts University

本文内容

摘要

已开发出一种无菌种植大白菜的方法，该方法可使研究人员评估单一微生物物种或多种微生物群落如何在大白菜叶片表面相互作用。同时提供了一种无菌蔬菜提取物，可用于检测蔬菜发酵过程中微生物群落组成的变化。

摘要

叶表层（phyllosphere）是植物地上部分可被微生物定殖的区域，是研究微生物群落组装过程的一个有用模型系统。本实验方案概述了一种用于研究纳帕卷心菜（Napa cabbage）叶表层中微生物群落动态的系统。该方法描述了如何在试管中使用煅烧黏土和营养肉汤基质培养无菌植物。通过将特定的微生物培养物接种到无菌植物上，可对叶表层中的微生物生长及群落动态进行定量分析。此外，通过使用由卷心菜制备的无菌蔬菜提取物，还可评估发酵过程中微生物群落的变化。该系统在实验室中建立起来相对简单且成本较低，可用于探讨微生物群落组装中的关键生态学问题。同时，它也为理解叶表层群落组成如何影响蔬菜发酵过程中的微生物多样性和品质提供了研究机会。这种构建已知菌群卷心菜叶表层群落的方法也可推广应用于其他野生和农作物植物种类。

引言

叶际微生物多样性在维持植物健康方面发挥着重要作用，同时也可能影响植物抵抗环境胁迫的能力1,2,3,4,5。反过来，作物的健康状况直接影响食品安全与品质6,7。植物在生态系统功能中扮演重要角色，其相关的微生物组不仅影响植物执行这些功能的能力，也直接对环境本身产生影响8。尽管科学家已开始解析叶际微生物组的功能与组成，但影响叶际微生物群落组装的生态过程尚未被完全阐明9,10。叶际微生物组是研究微生物组生态学的一个理想实验系统11。这些微生物群落结构相对简单，且许多群落成员可在标准实验室培养基上培养10,12,13。

发酵蔬菜是植物叶表微生物群落结构具有重要意义的一个体系。在酸菜和泡菜的制作过程中，天然存在于蔬菜叶片上的微生物（芸薹属Brassica物种的叶表微生物群落）即作为发酵的接种源14,15。乳酸菌（LAB）被认为是蔬菜微生物组中普遍存在的成员，但在叶表环境中的丰度可能较低16。发酵过程中强烈的非生物选择作用促使微生物群落组成发生变化，从而使乳酸菌丰度增加。随着乳酸菌的生长，其产生乳酸，形成发酵蔬菜产品的酸性环境17。叶表微生物群落与发酵过程之间的关联为利用蔬菜作为模型来研究微生物组的构建机制提供了机会。

我们已开发出无菌种植纳帕白菜的方法，并可使用喷雾瓶将其接种特定的微生物群落。这是一种经济且可靠的方法，可均匀地将单一微生物或混合群落接种到白菜上。此外，我们还开发了一种无菌蔬菜提取物（SVE），来源于三种不同类型的白菜/品种：红甘蓝和绿甘蓝（Brassica oleracea）以及纳帕白菜（B. rapa）。在这些SVE中添加盐分可模拟发酵环境，从而实现对发酵微生物组组装过程的小规模且相对高通量的实验研究。这些方法可用于研究叶表微生物群落的组装机制，以及叶表微生物群落动态如何影响蔬菜发酵的成功。

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方案

1. 无菌甘蓝的培养

  1. 准备无菌白菜培养设备
    1. 清洗煅烧黏土以去除细小粉尘
      1. 用自来水至少冲洗煅烧黏土（材料表）3次，每次冲洗后弃去水分。
        注意：煅烧黏土会产生极细的粉尘，建议在清洗时佩戴防护口罩（材料表）。
      2. 将煅烧黏土均匀铺成薄层（约4 cm）放入高压灭菌托盘中，使用干热循环进行高压灭菌（121 °C加热20分钟，干燥20分钟）以实现灭菌。
      3. 将灭菌后的煅烧黏土摊开于托盘中，置于温暖的培养箱（30−37 °C）内至少一周，使其完全干燥。每隔3天搅拌一次，确保黏土彻底干燥，以便其均匀吸收Murashige和Skoog（MS）营养液（见第1.2节）。
        注：干燥还有助于在将煅烧黏土称量装入试管时保持体积一致。也可采用其他干燥方式（如干燥烘箱），同样适用。
    2. 清洗用于培养无菌白菜的玻璃器皿
      1. 每次使用后应彻底清洁并灭菌玻璃试管（材料表）。先将试管浸泡在30%次氯酸钠溶液中30分钟，再用自来水充分冲洗，随后在细菌学模式下进行酸洗。每次使用后也应对双通试管帽（材料表）进行酸洗处理。
    3. 白菜种子表面灭菌
      1. 将最多100粒大白菜（B. rapa var pekinensis）种子放入1.5 mL微量离心管中。
        注：向一个微量离心管中加入超过100粒种子或更换管子尺寸，可能因种皮去除不充分而影响种子发芽率。
      2. 向种子中加入1 mL 70%乙醇，涡旋振荡5分钟，然后用移液器吸弃乙醇。
      3. 加入1 mL 50%次氯酸钠溶液，涡旋振荡5分钟，再用移液器吸弃漂白液。
      4. 加入1 mL高压灭菌的去离子水，涡旋振荡5分钟，然后用移液器吸弃去离子水。
      5. 重复步骤1.1.3.4共3次，以彻底去除残留漂白剂。播种前将种子在无菌去离子水中浸泡2−8小时，以软化种皮。
  2. 培养无菌白菜
    注：大白菜（B. rapa var pekinensis）在含有浸透Murashige和Skoog（MS）营养液的煅烧黏土的玻璃试管（15 cm × 2.5 cm）中培养（图1）。
    1. 将10 g洁净的煅烧黏土称量至洁净的玻璃试管（15 cm × 2.5 cm）中。
    2. 将4.4 g MS培养基溶解于1 L去离子水中，配制MS营养液。用移液器向每支试管中加入约9 mL MS营养液，使煅烧黏土完全浸润。
      注：若试管中存在过多游离液体，会阻碍种子发芽，因此可能需要略微减少部分试管中的MS营养液用量。
    3. 用22 mm双通试管帽松盖试管，进行高压灭菌（121 °C，60分钟）。从高压灭菌器中取出后，将试管帽压紧以密封试管。待试管冷却至室温后再使用。
    4. 使用无菌超长（25.4 cm）镊子，小心地将一颗无菌白菜种子置于每支试管中央。将试管放入7孔托盘中，置于光照培养架下（使用全光谱T5荧光灯或其他植物生长照明系统），设置16小时光照周期，温度为24 °C。
      注：种子通常在一夜之间发芽，5天后长出第一片真叶。真叶是指子叶形成后出现的第一片具维管组织的叶片，边缘更皱褶，在Brassica rapa中表面覆盖有毛状体（trichomes）。
  3. 检测无菌白菜的无菌性
    注：为检测白菜是否处于无菌状态，可从每批中随机选取少量（5−10株）植株进行平板培养，以判断是否存在可培养的微生物菌落。
    1. 用灭菌镊子夹住植株基部，轻轻将白菜从玻璃试管中取出。在完全取出植株前，使用灭菌解剖剪小心剪下根部。将白菜叶片压缩后装入1.5 mL微量离心管中。
      注：较大的白菜植株在仍处于试管中时，可能需要先移除一至两片较大的叶片，以便更容易将其装入1.5 mL微量离心管。若需保留整株样品，可在其余部分装入后，再将这些大叶片加入同一离心管中。
    2. 向每个1.5 mL微量离心管中加入400 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。使用无菌微型研杵，上下研磨30次，充分匀浆化白菜组织。
    3. 取100 µL白菜匀浆液涂布于琼脂平板上，检测样品中是否存在污染物。大多数叶表微生物可在胰蛋白胨大豆（TS）琼脂平板上生长。由于白菜匀浆液较粘稠，易堵塞普通移液器吸头，因此涂布时应使用宽口移液器吸头。

2. 用微生物溶液接种植物叶表

  1. 制备接种菌株的甘油保存液
    注意：表1列出了可用于本步骤的微生物分离株。其他叶际分离株也可在此使用。
    1. 从新鲜划线培养的平板上选取单菌落，密集划线接种至两到三个相同培养基的新平板上，以获得大量菌落。
    2. 培养2−5天后，将所有平板上的菌落刮下，收集至一个含有15 mL 15%甘油的15 mL锥形离心管中，涡旋振荡充分混匀。
    3. 取1 mL充分混匀的甘油保存液转移至1.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存备用。剩余14 mL甘油保存液也于-80 °C保存，因接种白菜时需要使用相对大体积的接种液。
    4. 使用前一周，将步骤2.1.3中含1 mL甘油保存液的1.5 mL离心管置于冰上解冻，进行系列稀释（例如10-4、10-5和10-6），涂布平板以测定14 mL接种液的浓度（每微升菌落形成单位[CFU]数）。
  2. 对接种喷雾瓶进行灭菌
    1. 拆卸琥珀色圆形波士顿喷雾瓶（59 mL），将所有组件（泵头、导管、瓶盖和瓶体）放入一个带紧密盖子的大塑料容器中，用30%次氯酸钠溶液浸泡30分钟。
    2. 浸泡完成后，轻轻抬起容器盖子的一角，小心倾倒出所有次氯酸钠溶液。
    3. 用去离子水（约1 L，根据容器大小调整）注满塑料容器以冲洗瓶子，再次仅抬起盖子一角小心倒出水。
    4. 用70%乙醇溶液喷洒生物安全柜内部，并开启紫外灯照射30分钟进行灭菌。
      注意：后续操作应在生物安全柜内进行，以避免瓶子在空气中干燥过程中受到微生物污染。
    5. 从大塑料容器中取出瓶子，使用移液器向每个瓶内加入灭菌去离子水。重新组装泵头并插入每个瓶中，对每个瓶子喷压10次，使去离子水通过泵头组件，以去除残留的次氯酸钠。
    6. 重复步骤2.2.5，确保玻璃瓶中所有次氯酸钠均被彻底清除。
    7. 通过以下方法检测瓶子是否无菌：待瓶子完全干燥后，在每瓶侧面贴上标签编号，向每瓶加入10 mL 1x PBS缓冲液，并向TS琼脂平板喷压3次。喷洒后，将平板在室温下培养一周。若平板上出现任何菌落生长，则表明相应瓶子未达到无菌状态，不应在实验中使用。
    8. 在储存无菌瓶之前，倒掉所有残留的PBS缓冲液，并让瓶子在生物安全柜内彻底干燥。将无菌瓶存放于无菌塑料容器中（通常使用之前用于漂白的容器），直至使用。
  3. 制备微生物接种液并喷雾接种无菌白菜
    警告：所有操作均应在生物安全柜内进行，因为喷雾过程会产生气溶胶，若在实验台面操作可能污染工作区域或带来健康风险。
    注意：白菜在播种后5天将长出真叶，因此建议在播种一周后再进行微生物接种。由于培养管已密封，无需额外浇水。实验最好在播种后一个月内完成，因为小培养管会限制白菜的生长。
    1. 将甘油保存液置于冰上解冻，并用1x PBS缓冲液稀释至所需接种浓度（浓度根据步骤2.1.4中解冻并涂布1 mL样品所测定的结果确定）。
      注意：可采用多种不同的接种浓度，但叶际分离株在10天内可在白菜匀浆液中从104增长至108 CFU/mL。
    2. 向无菌喷雾瓶中加入10 mL稀释后的甘油保存液，先向大废液收集瓶中喷压5次，以清除喷雾瓶泵头组件中残留的PBS缓冲液。
    3. 打开白菜培养管盖，将白菜植株倾斜朝向喷雾瓶，对每株白菜喷压3次接种液，每次约提供200 µL，共约600 µL接种物。
    4. 接种后，取部分白菜样本用于测定实际接种输入浓度。使用灭菌镊子将白菜从培养管中取出，用灭菌解剖剪切除根部，然后小心地将植株放入已预先称重的无菌1.5 mL微量离心管中。如需计算每克白菜的CFU数，请记录白菜重量以供后续计算。
    5. 向每个含有白菜的1.5 mL微量离心管中加入400 µL 1x PBS缓冲液，使用无菌微型研磨杵反复研磨30次，将白菜组织充分匀浆于1x PBS中。
    6. 根据需要对白菜匀浆液进行稀释，并取样涂布平板。由于匀浆液较黏稠且含有较多植物组织碎片，移液时应使用宽孔枪头。

3. 制备无菌蔬菜提取物

注意：本方法是白菜无菌培养基制备方法的改良版本18,19。

  1. 从超市购买一颗卷心菜。在实验室中，去除并丢弃卷心菜最外层的叶片。将剩余的卷心菜切碎至适合放入搅拌机的大小，然后均质化成细腻的浆状物，即继续搅拌也不会使质地变得更细。
    注意：任何能够将卷心菜切碎成均匀细腻浆状物的搅拌机均适用于本方法。
  2. 称量均质后的卷心菜匀浆，按每克卷心菜加入2 mL蒸馏水的比例添加蒸馏水。将混合后的卷心菜浆液通过两层篮式咖啡滤纸（未漂白纸）进行过滤。
  3. 将卷心菜浆液分装至离心管中（管子尺寸需根据离心机型号确定）。在20,000 × g 条件下离心20分钟，直至大颗粒物质完全沉淀。
    注意：必须进行较长时间的离心，因为卷心菜颗粒会迅速堵塞滤器灭菌装置。
  4. 使用血清移液管小心吸取上清液，避免扰动沉淀的卷心菜残渣。若需模拟使用标准盐浓度的发酵条件，可在本步骤加入2% w/v的NaCl（即在滤器灭菌前加入）。
  5. 使用连接真空泵的0.2 µm滤器（500 mL或1 L）对蔬菜提取物进行过滤除菌。分装至无菌管中（可使用50 mL或15 mL离心管），并于-80 °C冷冻保存，直至使用。

4. 无菌蔬菜提取物的接种

  1. 将SVE解冻，并分装490 µL至1.5 mL微量离心管中。每种处理在每个时间点至少需设置五个重复，因为每个时间点的测定均为破坏性取样。
  2. 将微生物分离株的甘油保存液置于冰上解冻，并用1×PBS稀释至所需浓度。乳酸菌在SVE中的浓度可低至每毫升5,000 CFU。为达到该浓度，需将保存液稀释至250 CFU/µL，因接种时将使用10 µL加入总体积为500 µL的SVE中。
  3. 向SVE中加入10 µL稀释后的微生物分离株，上下吹打数次以充分混匀。在设定温度下培养（14 °C适用于泡菜发酵条件，24 °C适用于较高温的酸菜发酵）。
  4. 通过在第1、2、4、7和14天收集重复样本管，测定微生物分离株在SVE中的生长速率。
    注意：发酵初期进程较快，随后逐渐减缓。因此，设置较多的早期时间点可更清晰地解析出发酵动态变化过程。
  5. 在每个时间点，通过上下吹打数次充分混匀接种后的SVE。用1×PBS对SVE进行系列稀释后涂布于琼脂平板。在计数前将平板培养4−7天。
    注意：应使用Man、Rogosa和Sharpe（MRS）琼脂平板计数所有乳酸菌，酵母菌使用酵母胨葡萄糖（YPD）琼脂，大多数来自叶表微生物组的其他细菌分离株则使用TS琼脂。
  6. 使用微型pH探针在每个时间点记录样品的pH值。
    注意：此步骤应在涂布平板之后进行，因为pH探针可能在不同管或处理之间转移细胞。

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结果

Napa白菜的生长速率
种子消毒方法已用多种不同的大白菜进行测试（B. rapa var. pekinesis; 补充图1) 来自多家供应商，均表现出一致的生长状态且生长速率相似。然而，在不同物种中验证这些方法时 芸薹属 (B. rapa： 芜菁紫顶 B. oleracea： 开罗杂交种，热带巨人杂交种； 芸薹（B. campestris）： 玩具 Choi 杂交型小白菜 B. juncea 芥菜红巨人）效果有限（补充图2）。与能够形成紧密整齐莲座状结构、适合放入玻璃管中的大白菜不同，这些 芸薹属 spp. 在灭菌后萌发率较低，或茎迅速伸长，导致植株细弱、生长不良。此外，对较老的种子进行灭菌时（>不建议使用存放一年以上的种子，因为种皮会变干，导致在灭菌过程中更难去除。应定期购买新种子，并在实验前对部分白菜进行测试，以确定其是否无菌。<...

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讨论

无菌大白菜植株已被用于研究乳酸菌在大白菜叶表微生物组中的扩散限制17。无菌大白菜还可用于检测单个或成对微生物在叶表中的生长情况（图1）。针对三种不同类型的卷心菜——红卷心菜、绿卷心菜和大白菜，已测试其无菌蔬菜提取物的制备方法。这些SVE均可作为可靠的生长培养基，接种的微生物在不同培养基中均表现出一致的生长特性。SVE中单菌株的生长速率（图2）显示，乳酸菌生长迅速，并能快速酸化培养基，其过程与预期的发酵过程一致17。

无菌植物与无菌蔬菜提取物可结合使用，以解决多种不同的生态学问题，例如叶际或发酵环境中的优先效应与群落演替。通过将卷心菜匀浆后涂布培养，获得叶际分离菌，或通过酸菜培养获得乳酸菌，即可简便地构建合成微生物群落16。可在叶际或SVE中开展成对相互作用实验或剔除单一种群的实验，以评估群落成员的重要性或功能。可在SVE中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国农业部国家食品与农业研究所资助项目（编号：2017-67013-26520）支持。Tracy Debenport 和 Claire Fogan 提供了技术支持，Ruby Ye 和 Casey Cosetta 对本稿件的早期版本提出了有益的修改意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管VWR20170-650
15 mL 圆锥形离心管Falcon352096
7 孔托盘Sigma MagentaT8654
琥珀色圆形波士顿玻璃瓶GPS 712OZSPPK12BR从 Amazon.com 上不同供应商处订购
篮式咖啡滤纸If you care（未漂白纸）购自 Wholefoods
漂白剂（无汞）Austin's50-010-45
硼硅酸盐玻璃管VWR47729-586
煅烧黏土TurfaceMVP从 Root Naturally 购买 6 夸脱袋装产品，Amazon.com 上订购。粒径约为 3–5 mm
美膳雅搅拌机CuisinartCuisinart Mini-Prep Plus 食品加工机，3 杯容量
解剖剪刀7-389-AAmerican Educational ProductsAmazon.com 上订购
乙醇VWR89125-172
镊子Aven18434Amazon.com 上订购
甘油Fisher Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
大型塑料容器RubbermaidAmazon.com 上订购
光照培养架Gardner's Supply39-357全光谱 T5 荧光灯管
Magenta™ 2 孔盖Millipore SigmaC1934
Man、Rogosa 和 Sharpe 培养基Fisher ScientificDF0881-17-5该培养基用于液体培养，添加 15 g 琼脂以制备平板
微型 pH 探针Thermo Scientific8220BNWP
微型研磨棒Carolina215828也称为沉淀研磨棒
MS 营养肉汤Millipore SigmaM5519Murashige 和 Skoog 基础培养基
NaClSigma AldrichS9888
大白菜种子Johnny's Select Seeds2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
培养皿（100 mm × 15 mm）FisherFB0875712用于制备琼脂平板
磷酸盐缓冲液Fisher Scientific50-842-941Teknova
植物组织培养盒SigmaMagenta GA-7
血清移液管VWR89130-900
无菌棉签棒Puritan10805-018使用前需高压灭菌
0.2 µm 过滤灭菌滤器Nalgene974103
胰蛋白酶大豆琼脂Fisher ScientificDF0370-17-3该培养基用于液体培养，添加 15 g 琼脂以制备平板
宽口移液器吸头Rainin17007102
酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖Fisher ScientificDF0428-17-5该培养基适用，也可自行配制含酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖的培养基，制备平板时添加 15 g 琼脂

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