用于果蝇树突和神经肌肉接头突触微管动力学的无创体内分析的 3D 粒子跟踪

Summary

本研究提出了一种无创活体神经元成像策略与一种新的软件策略相结合，以实现对果蝇感觉树突和神经肌肉接头中体内微管 （MT） 正末端动力学的自动化、无偏倚跟踪和分析。

Abstract

微管 （MT） 在神经元发育中起着关键作用，但关于其调节和功能的分子机制仍然存在许多问题。此外，尽管在理解突触后 MT 方面取得了进展，但对突触前 MT 对神经元形态发生的贡献知之甚少。特别是，对果蝇感觉树突中体内 MT 动力学的研究对聚合物水平行为产生了重要的见解。然而，与苍蝇神经肌肉接头 （NMJ） 实时成像相关的技术和分析挑战限制了突触前 MT 动力学的可比研究。此外，虽然有许多高效的软件策略可用于体外和离体 MT 动力学的自动分析，但由于图像中的信噪比和复杂的细胞形态本身就较差，体内数据通常需要大量的作员输入或完全手动分析。 为了解决这个问题，本研究优化了一个新的软件平台，用于自动和无偏倚的体内颗粒检测。在果蝇幼虫的树突和 NMJ 中对 EB1-GFP 标记的 MTs 的实时延时共聚焦图像进行了多参数分析，发现 MT 行为存在显着差异。在敲低 MT 相关蛋白 （MAP） dTACC（果蝇突触发育的关键调节因子）后，进一步分析了 MT 动力学，并确定了与野生型相比 MT 动力学的统计学显着变化。这些结果表明，这种在聚合物水平上对突触前和突触后 MT 动力学进行自动多参数分析的新策略显着降低了人在环标准。该研究进一步显示了该方法在 dTACC 敲除后检测不同 MT 行为方面的效用，表明未来可能应用于体内调节 MT 动力学的因子的功能筛选。该方法的未来应用可能还侧重于阐明细胞类型和/或区室特异性 MT 行为，以及 EB1-GFP 与其他感兴趣的细胞和亚细胞标志物的多色相关成像。

Introduction

细胞通过形态发生协调细胞内和细胞间的变化而组织起来形成功能结构。形态发生的一个显着例子是高度专业化的神经元结构的发育。神经元表现出显着的极化，其中它们延伸了两种结构和功能上不同的过程，即树突和轴突¹，可以达到巨大的长度。神经元发育的复杂性不仅源于树突和轴突的庞大尺寸，还源于难以形成它们错综复杂的分支几何形状 ^2,3。神经元形态发生及其对学习和记忆的影响⁴ 促使对其遗传控制和潜在细胞生物学机制的持续研究。这些机制包括但不限于细胞内膜转运和神经元形态变化所需的许多细胞骨架重排 ^1,2,3。

对神经元形态发生的研究产生了各种先进的可视化技术。静态方法，如固定探针的电子显微镜或荧光显微镜，被广泛用于进行高分辨率的形态和结构分析。然而，除了任何保存方法都不可避免的伪影之外，静态可视化无法捕捉支撑形态发生的动态变化。因此，许多关键见解源于活组织的延时荧光显微镜检查。Lichtman 及其同事^....

Protocol

1. 果蝇标本的生成

1. 选择合适的 MT 正端标记。本研究利用了 GFP 标记的 EB1，这是一种特征明确的加末端标志物，具有强烈、清晰的信号^11,12。替代方案包括其他 +TIP，例如 EB3^10,13、CLASP/Orbit⁵³ 和 CLIP-170⁵⁴。
2. 在 UAS 启动子（例如 UAS-EB1-GFP）的控制下使用 MT 标记获得或生成果蝇。
3. 选择合适的组织特异性 Gal4 驱动程序。本研究使用泛神经元驱动 elaV-Gal4^58,59 驱动感觉树突和 NMJ 的表达，使用 221-Gal4^60,61 驱动树突特异性表达。
4. 使用标准的苍蝇饲养技术饲....

Results

果蝇从组成性表达 UAS-EB1-GFP 转基因的稳定储液中饲养出来 （elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP）^58,59 或感觉神经元 （221-Gal4;UAS-EB1-GFP）^60,61。本研究选择 EB1 是因为它特异性定位于生长末端，并在暂停和收缩时立即解离 ^14,15，并且已通过多项研究显示，包括果蝇 22,23,24,25,26,27,35

Discussion

本文讨论了一种在发育过程中对树突和 NMJ 中的 MT 动力学进行无创活体成像的方案。在实验步骤中需要人工输入，例如选择要成像的动物，并且可能会在数据收集过程中引入无法合理消除的偏差。因此，该协议的一个关键目标是通过使用新软件（第 5 节）进行自动分析来尽可能减少偏差，该软件经过优化以处理体内数据固有的低信噪比。重要的是，本研究中使用的算法允许基于机器的粒子检测、运动图生成和轨迹分析，与传统方法相比，减少了对人工输入的需求。无论如何，该软件的用户都应该评估结果并设置跟踪和检测参数以过滤掉假阳性（例如，聚集体或噪声）。这些修改必须根据每个用户的独特数据和使用情况进行经验调整。还值得注意的是，此处提供的分析并不完全等同于 plusTipTracker 可能实现的分析:虽然可以使用 plusTipTracker 推断收缩和救援事件，但当前软件中的算法无法执行此类测量。此外，由于每个成像系列都是在单个焦平面上采集的，因此使用当前协议无法完全捕获 EB1 彗星在 z 轴上的移动。尽管如此，尽管存在这些限制，但鉴于体内数据固有的数据质量存在相当大的限制，该方法在实现自动化、可重复的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	21008-959	样品制备
1000 µL TipOne 移液器吸头	USA Scientific	1111-2721	样品制备
200 &微量;L TipOne 移液器吸头	USA Scientific	1120-8710	样品制备
221-Gal4 果蝇	卢明顿果蝇库存中心（美国）	26259	果蝇遗传学/杂交
60 倍物镜	尼康	Plan Apo 60 倍油	画 图像采集
6 孔板	BD Falcon	353224	样品制备
琼脂	Moor琼脂	41084	果蝇食物
Aivia	DRVision LLC		作为本研究的一部分进行了优化
氯仿（用戊烯稳定）	Sigma-Aldrich	C2432	样品制备
CO2 吹尘枪（用于选择用于杂交的果蝇）	Genesee	54-104	果蝇遗传学/杂交
CO2 起泡器（用于选择用于杂交的果蝇）	Genesee	59-180	果蝇遗传学/杂交
制冷型 CCD 相机	滨松	ORCA-R2	图像采集
玉米面	Genesee	62-101	果蝇食品
蒸馏水			果蝇食品
双面胶带	苏格兰		威士忌 样品制备
果蝇小瓶	Genesee	32-109	果蝇食品
Droso-plugs（泡沫塞用于小瓶）	Genesee	59-200	果蝇食物
Dumont #5 Biologie Inox 镊子	精细科学工具	11252-20	样品制备
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 果蝇	梅丽莎·罗尔斯 （宾夕法尼亚州立大学） N	/A	果蝇遗传学/杂交
乙醇 （95%）	VWR	75811-022	果蝇食物
立体显微镜光纤照明器/光源	尼康	NI-150	样品制备
Flypad（用于杂交选择果蝇）	Genesee	59-172	果蝇遗传学/杂交
Forma 环境箱/培养箱	ThermoFisher	3940	果蝇遗传学/杂交
卤烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898	样品制备
浸油	Nikon	MXA22168	图像采集
Kimwipe 精致湿巾	Fisher Scientific	34120	样品制备
激光合并模块	光谱Applied Research	LMM-5	图像采集
共聚焦	Lumencor	SOLA 54-10021	图像采集
MetaMorph 显微镜自动化图像分析软件	分子设备		图像采集
微型盖板 眼镜，方形，1 1/2 号 （#1.5）	VWR	48366-205	样品制备
带完美对焦系统的电动倒置显微镜	尼康	TI-ND6-PFS-S	图像采集
电动载物台和快门	Prior	Proscan III	图像采集
多用途剪刀	苏格兰MMM1428		样品制备
指甲油	Sally Hansen	784179032016 074170382839	样品制备
光学滤光片	Chroma	ET480/40m	图像采集
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	样品制备
P200 Pipetman	Gilson	F123601	样品制备
PBS （10X） ph 7.4	ThermoFisher	70011044	样品制备
丙酸	Fisher	A258-500	果蝇食品
转盘共聚焦扫描仪单元	Yokagawa	CSU-X1	图像采集
立体显微镜	尼康	SMZ800N	样品制备
糖（蔗糖）	Genesee	62-112	果蝇食物
Superfrost 载玻片	VWR	48311-600	样品制备
Tegosept	Genesee	20-258	果蝇食物
UAS-dtacc-RNAi 果蝇	维也纳果蝇资源中心（奥地利维也纳）	VDRC-101439	果蝇遗传学/杂交
凡士林凡士	WB Mason	DVOCB311003	样品制备
温莎 &牛顿刷 Regency Gold 520，尺寸 0	订书钉	5012000	果蝇遗传学/杂交
酵母	VWR	圆酵母 酵母 IC90308580	果蝇食物
横河二向色分光器	Semrock	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	图像采集