利用三维粒子追踪技术对果蝇树突及神经肌肉接头中突触微管动态进行非侵入性活体分析

摘要

本研究提出了一种非侵入性的活体神经元成像策略，并结合一种新开发的软件策略，以实现对果蝇感觉树突和神经肌肉接头中活体微管（MT）正端动态的自动化、无偏倚追踪与分析.

摘要

微管（MTs）在神经元发育中发挥着关键作用，但关于其调控和功能的分子机制仍有许多问题尚待阐明。此外，尽管在理解突触后微管方面已取得进展，但突触前微管在神经元形态发生中的作用却知之甚少。特别是对果蝇感觉树突中活体微管动态的研究，已为聚合物水平的行为提供了重要见解。然而，由于果蝇神经肌肉接头（NMJ）活体成像存在技术和分析上的挑战，导致对突触前微管动态的类似研究受到限制。此外，尽管已有多种高效软件策略可用于体外和离体条件下微管动态的自动化分析，但由于活体图像信噪比较低以及细胞形态复杂，活体数据通常仍需大量人工干预或完全依赖手动分析。 为解决这一问题，本研究优化了一种新的软件平台，用于实现活体条件下颗粒的自动化且无偏倚的检测。该方法对果蝇幼虫树突和神经肌肉接头中EB1-GFP标记的微管进行活体延时共聚焦图像的多参数分析，发现两者在微管行为上存在显著差异。此外，在敲低微管相关蛋白（MAP）dTACC——一种果蝇突触发育的关键调控因子——后，进一步分析显示微管动态相较于野生型出现了具有统计学意义的变化。这些结果表明，这种新型的、针对突触前和突触后微管动态在聚合物水平上的多参数自动化分析策略，可显著减少人为干预标准。本研究还展示了该方法在检测dTACC敲低后微管行为差异方面的实用性，提示其未来可能应用于调控活体微管动态因子的功能筛选。该方法的后续应用还可聚焦于解析特定细胞类型和/或特定区室的微管行为，并结合EB1-GFP与其他感兴趣的细胞及亚细胞标记物进行多色相关成像。 

引言

细胞通过形态发生过程中细胞内和细胞间变化的协调，组织形成具有功能的结构。神经元这一高度特化结构的发育是形态发生的一个显著例子。神经元表现出显著的极性，能够延伸出两种在结构和功能上截然不同的突起——树突和轴突¹，这些突起可达到极大的长度。神经元发育的复杂性不仅源于树突和轴突的巨大尺寸，还源于形成其复杂分支几何结构的困难^2,3。神经元形态发生及其在学习与记忆中的作用⁴，推动着人们对调控该过程的遗传机制以及相关细胞生物学机制的持续研究。这些机制包括但不限于细胞内膜运输，以及神经元形态改变所需的多种细胞骨架重排过程^1,2,3。

神经元形态发生的研究已催生出多种先进的可视化技术。静态方法，如电子显微镜或对固定样本进行的荧光显微镜观察，被广泛用于高分辨率的形态学和结构分析。然而，除了任何固定方法不可避免会引入的假象外，静态可视化无法捕捉形态发生过程中潜在的动态变化。因此，许多关键性发现来源于对活体组织进行的时间序列荧光显微成像。Lichtman 及其同事的早期工作

方案

1. 果蝇样本的制备

1. 选择合适的微管（MT）正端标记物。本研究使用了GFP标记的EB1，这是一种特征明确的正端标记物，具有强而清晰的信号^11,12。其他可选方案包括其他+TIPs，如EB3^10,13、CLASP/Orbit⁵³和CLIP-170⁵⁴。
2. 获取或构建在UAS启动子控制下表达微管标记物的果蝇（例如，UAS-EB1-GFP）。
3. 选择适当的组织特异性Gal4驱动系。本研究使用了泛神经元驱动系elaV-Gal4^58,59，以在感觉树突和神经肌肉接头（NMJ）中驱动表达，以及使用221-Gal4^60,61实现树突特异性表达。
4. 采用标准的果蝇饲养技术进行果蝇培养⁵⁵

结果

果蝇来自稳定品系，这些品系组成型表达UAS-EB1-GFP转基因，分别在全部神经元中（elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP）^58,59或在感觉神经元中（221-Gal4; UAS-EB1-GFP）^60,61。本研究选择EB1，因为它特异性地定位于微管生长末端，并在暂停或收缩时立即解离^14,15，并且已有包括在黑腹果蝇（Drosophila）中的多项研究表明^22,23,24,25,

讨论

本文介绍了一种在发育过程中对树突和神经肌肉接头（NMJ）处微管（MT）动态进行无创活体成像的实验方案。实验步骤中需要人工参与，例如选择用于成像的动物，这可能在数据收集过程中引入难以避免的偏差。因此，该方案的一个关键目标是尽可能减少偏差，通过使用一种新开发的软件（第5节）进行自动化分析，该软件已针对体内数据固有的低信噪比进行了优化。重要的是，本研究中使用的算法能够实现基于机器的颗粒检测、明场图生成和轨迹分析，相比传统方法显著减少了对人工干预的需求。尽管如此，软件使用者仍需评估分析结果，并设置追踪和检测参数以过滤假阳性信号（例如聚集体或噪声）。这些参数的调整需根据每位用户自身数据的特点和具体应用进行经验性优化。还需注意的是，此处介绍的分析方法与plusTipTracker所能实现的分析并不完全等同：虽然使用plusTipTracker可以推断微管的缩短和恢复事件，但当前软件中的算法尚无法完成此类测量。此外，由于每组成像数据均在单一焦平面上采集，当前方案无法完整捕捉EB1彗星在z轴方向的运动。尽管存在这些局限性，考虑到活体数据本身在数据质量方面存在诸多限制，该方法在实现自动化、可重复的活体数据分析方面已取得重要进展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	21008-959	样品制备
1000 µL TipOne 吸头	USA Scientific	1111-2721	样品制备
200 µL TipOne 吸头	USA Scientific	1120-8710	样品制备
221-Gal4 果蝇	布卢明顿果蝇资源中心（美国）	26259	果蝇遗传学/杂交
60倍物镜	尼康	Plan Apo 60x 油镜	图像采集
6孔板	BD Falcon	353224	样品制备
琼脂	MoorAgar	41084	果蝇食物
Aivia	DRVision LLC		本研究优化部分
氯仿（以戊烯稳定）	Sigma-Aldrich	C2432	样品制备
CO2 吹枪（用于杂交果蝇筛选）	杰内西	54-104	果蝇遗传学/杂交
CO2 麻醉装置（用于杂交果蝇筛选）	杰内西	59-180	果蝇遗传学/杂交
冷却CCD相机	滨松	ORCA-R2	图像采集
玉米粉	杰内西	62-101	果蝇食物
蒸馏水			果蝇食物
双面胶带	透明胶带		样品制备
果蝇培养管	杰内西	32-109	果蝇食物
果蝇培养瓶用泡沫塞（Droso-plugs）	杰内西	59-200	果蝇食物
Dumont #5 生物不锈钢镊子	Fine Science Tools	11252-20	样品制备
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 果蝇	梅丽莎·罗尔斯（宾夕法尼亚州立大学）惠赠	N/A	果蝇遗传学/杂交
乙醇（95%）	VWR	75811-022	果蝇食物
体视显微镜用光纤照明器/光源	尼康	NI-150	样品制备
Flypad（用于筛选杂交果蝇）	杰内西	59-172	果蝇遗传学/杂交
Forma 环境培养箱/培养孵育器	ThermoFisher	3940	果蝇遗传学/杂交
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898	样品制备
浸油	尼康	MXA22168	图像采集
Kimwipe 细密擦拭纸	Fisher Scientific	34120	样品制备
激光融合模块	光谱应用研究	LMM-5	图像采集
共聚焦显微镜光源	Lumencor	SOLA 54-10021	图像采集
MetaMorph 显微镜自动化 &和图像分析软件	Molecular Devices		图像采集
方形显微盖玻片，1.5号（#1.5）	VWR	48366-205	样品制备
配备完美聚焦系统的电动倒置显微镜	尼康	TI-ND6-PFS-S	图像采集
电动载物台和快门	之前	Proscan III	图像采集
多功能剪刀	透明胶带	MMM1428	样品制备
指甲油	Sally Hansen	784179032016 074170382839	样品制备
光学滤光片	染色	ET480/40m	图像采集
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	样品制备
P200 Pipetman	Gilson	F123601	样品制备
PBS（10倍浓度），pH 7.4	ThermoFisher	70011044	样品制备
丙酸	Fisher	A258-500	果蝇食物
旋转盘共聚焦扫描仪单元	横川	CSU-X1	图像采集
体视显微镜	尼康	SMZ800N	样品制备
糖（蔗糖）	杰内西	62-112	果蝇食物
Superfrost 载玻片	VWR	48311-600	样品制备
Tegosept	杰内西	20-258	果蝇食物
UAS-dtacc-RNAi 果蝇	维也纳果蝇资源中心（奥地利维也纳）	VDRC-101439	果蝇遗传学/杂交
凡士林石油冻	WB Mason	DVOCB311003	样品制备
Winsor && Newton Brush Regency Gold 520，0号	订书钉	5012000	果蝇遗传学/杂交
酵母	VWR	Torula 酵母 IC90308580	果蝇食物
横河二向色分光镜	Semrock	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	图像采集