利用三维粒子追踪技术对果蝇树突及神经肌肉接头中突触微管动态进行非侵入性活体分析

摘要

本研究提出了一种非侵入性的活体神经元成像策略，并结合一种新开发的软件策略，以实现对果蝇感觉树突和神经肌肉接头中活体微管（MT）正端动态的自动化、无偏倚追踪与分析.

摘要

微管（MTs）在神经元发育中发挥着关键作用，但关于其调控和功能的分子机制仍有许多问题尚待阐明。此外，尽管在理解突触后微管方面已取得进展，但突触前微管在神经元形态发生中的作用却知之甚少。特别是对果蝇感觉树突中活体微管动态的研究，已为聚合物水平的行为提供了重要见解。然而，由于果蝇神经肌肉接头（NMJ）活体成像存在技术和分析上的挑战，导致对突触前微管动态的类似研究受到限制。此外，尽管已有多种高效软件策略可用于体外和离体条件下微管动态的自动化分析，但由于活体图像信噪比较低以及细胞形态复杂，活体数据通常仍需大量人工干预或完全依赖手动分析。 为解决这一问题，本研究优化了一种新的软件平台，用于实现活体条件下颗粒的自动化且无偏倚的检测。该方法对果蝇幼虫树突和神经肌肉接头中EB1-GFP标记的微管进行活体延时共聚焦图像的多参数分析，发现两者在微管行为上存在显著差异。此外，在敲低微管相关蛋白（MAP）dTACC——一种果蝇突触发育的关键调控因子——后，进一步分析显示微管动态相较于野生型出现了具有统计学意义的变化。这些结果表明，这种新型的、针对突触前和突触后微管动态在聚合物水平上的多参数自动化分析策略，可显著减少人为干预标准。本研究还展示了该方法在检测dTACC敲低后微管行为差异方面的实用性，提示其未来可能应用于调控活体微管动态因子的功能筛选。该方法的后续应用还可聚焦于解析特定细胞类型和/或特定区室的微管行为，并结合EB1-GFP与其他感兴趣的细胞及亚细胞标记物进行多色相关成像。 

引言

细胞通过形态发生过程中细胞内和细胞间变化的协调，组织形成具有功能的结构。神经元这一高度特化结构的发育是形态发生的一个显著例子。神经元表现出显著的极性，能够延伸出两种在结构和功能上截然不同的突起——树突和轴突¹，这些突起可达到极大的长度。神经元发育的复杂性不仅源于树突和轴突的巨大尺寸，还源于形成其复杂分支几何结构的困难^2,3。神经元形态发生及其在学习与记忆中的作用⁴，推动着人们对调控该过程的遗传机制以及相关细胞生物学机制的持续研究。这些机制包括但不限于细胞内膜运输，以及神经元形态改变所需的多种细胞骨架重排过程^1,2,3。

神经元形态发生的研究已催生出多种先进的可视化技术。静态方法，如电子显微镜或对固定样本进行的荧光显微镜观察，被广泛用于高分辨率的形态学和结构分析。然而，除了任何固定方法不可避免会引入的假象外，静态可视化无法捕捉形态发生过程中潜在的动态变化。因此，许多关键性发现来源于对活体组织进行的时间序列荧光显微成像。Lichtman 及其同事的早期工作^5,6,7利用活体成像技术研究了哺乳动物神经系统的轴突再生与退化、突触组分的组织结构以及长距离轴突运输。此外，对初级神经元外植体的开创性研究对于确立微管（MT）动力学在轴突延伸和运动中的重要性至关重要^8,9。尤为关键的是，早期的神经元外植体研究确立了使用荧光标记的末端结合蛋白家族（EBs）来深入理解发育中神经元内单个微管聚合物水平上的微管正端动力学¹⁰。这些研究源于观察到EB家族成员EB1在酿酒酵母（S. cerevisiae）¹²和培养细胞¹³中优先定位于微管正端¹¹。自此以后，EB1及其他正端追踪蛋白（+TIPs）^14,15被广泛应用于活体中微管动态不稳定性研究¹⁶，包括在神经元发育背景下的研究¹⁷。

果蝇是研究神经元发育过程中微管（MT）动态的有力体内成像模型，这得益于果蝇研究中丰富的遗传学和成像工具^18,19，以及果蝇与脊椎动物神经元在结构和功能上的相似性¹。一项早期针对果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）的研究，通过完整活体动物半透明的表皮对荧光膜标记物进行重复无创成像，记录了突触前终末的形态发生过程²⁰。采用类似方法对完整活体果蝇幼虫进行成像，首次实现了对轴突中运动蛋白 cargo 过程性运动的亚细胞、颗粒水平分析²¹。近年来，Rolls 及其同事在完整果蝇幼虫的感觉树突中开展了细致的研究^{22,23,24,25,26,27}，通过追踪和分析绿色荧光蛋白（GFP）标记的EB1，表征了突触后微管正端的动态行为。这些在果蝇^{22,23,24,25,26,27}及其他系统^{28,29,30,31,32}中的研究，显著推动了人们对发育中神经元树突内微管正端单聚合物行为的理解³³。

尽管已有大量关于突触后微管（MT）动态的出色体内研究^{22,23,24,25,26,27,28,29,30,31}，但针对发育中轴突末梢突触前微管动态的可比研究却少得多。果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）处的微管动态已通过荧光散斑显微技术（FSM）和光漂白后荧光恢复技术（FRAP）进行了研究³⁴。这些方法可评估整体微管蛋白动力学，但无法反映单个微管正端的行为。截至目前，仅有一项研究针对果蝇NMJ处单个微管正端进行了探索：该研究结合活细胞时间推移成像与明可夫图（kymograph）的手动分析，鉴定出一类动态的、由EB1-GFP标记的"先锋微管"，其行为特征明显区别于更广泛的稳定微管群体³⁵。对突触前微管动态研究的匮乏，部分原因可能在于解剖结构：由于树突靠近幼虫体壁，成像相对容易；而神经肌肉接头则被其他组织遮挡，难以获得足够信噪比的图像以进行单颗粒水平的分析。然而，考虑到突触前微管在突触形态发生与稳定性中的重要作用³⁶，以及其与神经发育和神经退行性疾病之间的关联³⁷，填补突触前与突触后微管认知之间的这一空白，有望带来极为宝贵的科学见解。 

与体外或离体分析相比，体内微管（MT）动态分析面临的一个额外挑战是，可用于从体内数据中提取动态参数的自动化软件工具十分有限。目前，用于分析标记了+TIP的微管正端的最流行且功能强大的技术之一是plusTipTracker^38,39，这是一种基于MATLAB的软件，可实现对多个动态参数的自动追踪与分析。值得注意的是，plusTipTracker不仅能测量微管的生长，还能算法推断出其缩短速率和恢复事件：尽管EB1-GFP等+TIP标记物仅与正在生长的正端结合，plusTipTracker仍可通过算法推断出缩短和恢复过程。然而，尽管plusTipTracker已在多种研究场景中成功应用（包括此前对果蝇S2细胞中离体微管动态的多参数分析⁴⁰），但由于体内数据信噪比较低，该软件并不适用于体内数据的分析。因此，目前对果蝇树突^{22,23,24,25,26,27}和神经肌肉接头（NMJ）³⁵处微管正端动态的研究，主要依赖于使用ImageJ⁴¹等软件手动生成和分析明暗图（kymograph），或采用包含大量人工干预环节的半自动化策略。

本研究提出了一种实验与分析流程，可显著降低对果蝇三龄幼虫感觉树突及运动轴突末梢中突触前微管（MT）动态进行非侵入性聚合物水平分析所需的实验与分析负担。该方案采用固定但完整的幼虫，从而避免了可能引发应激反应或其他非生理状态的损伤，这些因素可能干扰体内微管动态。为标记动态微管正端，利用Gal4/UAS系统在全神经元中表达EB1-GFP⁴²，仅需一个驱动系即可实现对树突和神经肌肉接头（NMJ）处微管的可视化。尽管早期部分步骤不可避免地依赖人为判断，例如动物样本的选择和成像区域的确定，但数据采集之后的步骤基本实现了自动化。关键的是，通过优化一款新软件，实现了无需人为偏倚的自动化分析，且所需人工干预极少。尽管其他粒子追踪方法已有报道^43,44,45，本研究采用专有软件，因其算法特别适用于应对本数据集特有的挑战。目前该软件已向用户开放，可用于多种应用场景。具体而言，采用相干性增强扩散滤波⁴⁶对于实现自动化的图像分割与背景去除至关重要，并且专门开发了定制算法以实现粒子检测与追踪的自动化。该策略能有效应对本研究数据中固有的低信噪比问题，以及其他挑战，例如EB1-GFP彗星斑点在不同焦平面间的移动。尽管无法全面测试该软件与其他所有粒子分析软件的性能对比，但本方法的表现达到或接近人工分析的标准水平。此外，据作者所知，尚无其他软件专门针对感觉树突和突触前末梢的体内数据进行过训练。鉴于图像分析算法的性能通常高度依赖于其设计所针对的数据类型，而通用计算机视觉尚未实现，因此将所述软件针对特定的体内研究数据进行训练，被认为是最具算法合理性的方法。

鉴于已有大量关于树突微管（MTs）的研究^{22,23,24,25,26,27}，以及该系统能够获得数据的一致高质量，本研究首先在果蝇感觉神经元树突中验证了图像采集与软件分析策略。重要的是，在树突中发现，即使在其他方面完全相同的野生型遗传背景下，使用不同的神经元Gal4驱动子也会因遗传背景的差异而导致EB1-GFP动态特性的显著不同，这强调了为获得一致结果应使用单一Gal4驱动子的重要性。随后，该策略被用于对神经肌肉接头（NMJ）突触前终末处EB1-GFP动态进行多参数分析。为进一步展示该方法的科研价值，本研究利用此成像与软件分析方法，在敲低dTACC（即高度保守的TACC（transforming acidic coiled coil）家族的果蝇同源蛋白）后，评估了突触前和突触后EB1-GFP的动态变化^47,48。先前在果蝇S2细胞中的研究⁴⁰，以及Lowery及其同事在非洲爪蟾（Xenopus）生长锥中的工作^49,50,51均表明，TACC家族成员可调控微管（MT）正端动态。此外，最近基于共聚焦显微镜和超分辨率免疫荧光成像的研究证据表明，dTACC是神经元形态发生过程中突触前微管的关键调控因子⁵²，由此引出一个问题：dTACC是否调控活体微管的动态行为？本报告展示了一种能够检测到敲低dTACC后活体微管行为差异的方法。因此，本研究提出了一种活体（in vivo）方法，可有效识别并表征发育中神经元内微管动态的关键调控因子，尤其适用于突触前区室的研究。 

方案

1. 果蝇样本的制备

1. 选择合适的微管（MT）正端标记物。本研究使用了GFP标记的EB1，这是一种特征明确的正端标记物，具有强而清晰的信号^11,12。其他可选方案包括其他+TIPs，如EB3^10,13、CLASP/Orbit⁵³和CLIP-170⁵⁴。
2. 获取或构建在UAS启动子控制下表达微管标记物的果蝇（例如，UAS-EB1-GFP）。
3. 选择适当的组织特异性Gal4驱动系。本研究使用了泛神经元驱动系elaV-Gal4^58,59，以在感觉树突和神经肌肉接头（NMJ）中驱动表达，以及使用221-Gal4^60,61实现树突特异性表达。
4. 采用标准的果蝇饲养技术进行果蝇培养^55,56。建议将果蝇置于25 °C的加湿培养箱中，以获得最佳的Gal4/UAS表达效果。
5. 采用标准的果蝇遗传学技术^55,56，进行杂交以获得在目标细胞/组织中表达微管正端标记物的果蝇。
   注：对于任何Gal4驱动系与转基因组合，实验设计中应包括概念验证和验证实验，以表征该系统并避免因过表达导致的人为假象。

2. 仪器设备设置

1. 在共聚焦显微镜附近（即同一房间内）设置一个工作台，包括果蝇、麻醉试剂、载玻片制备材料、体视显微镜和照明光源，以尽量缩短样品制备与成像之间的时间，延长幼虫的健康和存活时间。
2. 通过在1.5 mL微量离心管中混合9%氯仿溶液（0.1 mL氯仿和1.0 mL卤代烃油）来制备麻醉剂。为避免分层，在每次制备新载玻片前应将管子颠倒混匀。
3. 准备玻璃载玻片：裁剪四条双面胶带（约15 mm宽）。将其中两条并排贴在载玻片上，胶带之间留出约5 mm的间隙。再将剩余两条胶带分别叠加在前两条之上，使胶带厚度加倍（图1C）。
4. 在胶带之间的5 mm间隙中加入一大滴氯仿/油混合液（约100 µL）至载玻片上（图1C）。

3. 成像用幼虫样本的制备

1. 将容器（例如6孔板）中加入1×PBS。
2. 收集 3^rd 使用镊子或类似工具从果蝇培养瓶中取出龄期幼虫。通过幼虫的爬行行为以及其具有9–12个显著锯齿状口钩的特征，鉴定其所属的正确龄期。借助体视显微镜辅助进行幼虫龄期的判定。图1D).
3. 将幼虫放入磷酸盐缓冲液（PBS）中，轻轻移动以洗去食物残渣或其他碎屑。用柔软的纸巾轻轻吸干幼虫表面液体。
4. 将幼虫放入载玻片上步骤2中的氯仿/油滴中以进行麻醉图1C).
   注意：幼虫的背腹方向并不关键，因为无论标本朝向如何，均可通过调节显微镜焦平面至适当位置，透过半透明的角质层观察到感觉神经元和运动神经元。
5. 将一块 #1.5 盖玻片置于其上。轻轻按压使盖玻片粘附于胶带，从而在不损伤幼虫的情况下将其固定图1C).
6. 用凡士林或指甲油密封腔室。

4. 活体样本的延时共聚焦成像

1. 准备共聚焦显微镜及60倍油浸物镜。将样品放置于载物台上（图1A，B）。
2. 使用采集软件配置实验。
   注意：本研究中，每个成像序列均在单一焦平面上采集，而非z轴层扫。
   1. 设置时间间隔为2秒，时程持续30秒，共采集16帧图像。
   2. 调节激光曝光时间和强度，以确保获得足够信号，同时避免信号饱和和光漂白。
   3. 对于EB1-GFP成像，488 nm激光的曝光时间设为100 ms，强度设为30%。这些参数可能因本方案的不同应用而有所差异，应根据实际情况进行经验性调整。
3. 使用显微镜目镜在宽场绿色照明下定位幼虫。通过缓慢调节载物台位置找到树突或神经肌肉接头（NMJs）。避免幼虫暴露于照明（宽场或共聚焦）的时间超过必要时长。
   1. 树突表现为细长、亮绿色的网状神经结构，易于与粗长的轴突束相区分（图1E）。
   2. 神经肌肉接头表现为直径约5 µm的亮绿色单个突触小泡簇，位于从神经索分出的粗长轴突束末端（图1F）。
4. 利用实时相机画面，使用488 nm照明快速对目标区域进行聚焦。一旦达到合适焦平面，立即停止照明，以避免光毒性。
5. 启动图像采集。EB1彗星状信号表现为明亮且可运动的点状结构，易于识别。
6. 有关荧光活体成像的更多细节和指导，请参考已发表的文献⁵⁷。

5. 基于软件的图像处理与分析

1. 逐个分析每个视频文件。在软件中（用户界面如图所示） 图2），选择 文件 | 导入 | 图像序列 将TIF文件拖入弹出的框中。预览视频。
2. 在……之下 检测参数 菜单中，调整软件参数以确保仅检测清晰可见的点状结构，避免检测到虚假对象。例如，降低颗粒强度会提高软件对点状结构的敏感性，但可能增加假阳性。参数的具体数值需根据实验经验进行调整。 检测与追踪参数的详细说明可向作者索取。
3. 应用 神经元颗粒追踪 使用以下方案分析图像 从开始 按钮（蓝色箭头， 图2B）。软件将输出所列追踪参数的结果 表1 到 结果电子表格 （绿色方框， 图 2B）。为便于后续分析与解释，可将结果存储于电子表格软件中，使用 导出 功能发现于 结果电子表格 部分
4. 导航 的 将光标移至前一步骤中检测到的斑点 左键单击 可选择或取消选择。可同时选择多个点状结构 同时使用 Ctrl + 左键单击.
   注意：根据项目目标和应用需求，可采用其他启发式方法对点状结构进行筛选。例如，持续时间少于8–10秒（4–5帧）的点状结构可能因无法充分反映完整的生长过程而被排除。此类启发式方法的应用需根据实验情况具体确定。有关软件功能的更多细节，可向作者索取。

结果

果蝇来自稳定品系，这些品系组成型表达UAS-EB1-GFP转基因，分别在全部神经元中（elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP）^58,59或在感觉神经元中（221-Gal4; UAS-EB1-GFP）^60,61。本研究选择EB1，因为它特异性地定位于微管生长末端，并在暂停或收缩时立即解离^14,15，并且已有包括在黑腹果蝇（Drosophila）中的多项研究表明^22,23,24,25,

讨论

本文介绍了一种在发育过程中对树突和神经肌肉接头（NMJ）处微管（MT）动态进行无创活体成像的实验方案。实验步骤中需要人工参与，例如选择用于成像的动物，这可能在数据收集过程中引入难以避免的偏差。因此，该方案的一个关键目标是尽可能减少偏差，通过使用一种新开发的软件（第5节）进行自动化分析，该软件已针对体内数据固有的低信噪比进行了优化。重要的是，本研究中使用的算法能够实现基于机器的颗粒检测、明场图生成和轨迹分析，相比传统方法显著减少了对人工干预的需求。尽管如此，软件使用者仍需评估分析结果，并设置追踪和检测参数以过滤假阳性信号（例如聚集体或噪声）。这些参数的调整需根据每位用户自身数据的特点和具体应用进行经验性优化。还需注意的是，此处介绍的分析方法与plusTipTracker所能实现的分析并不完全等同：虽然使用plusTipTracker可以推断微管的缩短和恢复事件，但当前软件中的算法尚无法完成此类测量。此外，由于每组成像数据均在单一焦平面上采集，当前方案无法完整捕捉EB1彗星在z轴方向的运动。尽管存在这些局限性，考虑到活体数据本身在数据质量方面存在诸多限制，该方法在实现自动化、可重复的活体数据分析方面已取得重要进展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	21008-959	样品制备
1000 µL TipOne 吸头	USA Scientific	1111-2721	样品制备
200 µL TipOne 吸头	USA Scientific	1120-8710	样品制备
221-Gal4 果蝇	布卢明顿果蝇资源中心（美国）	26259	果蝇遗传学/杂交
60倍物镜	尼康	Plan Apo 60x 油镜	图像采集
6孔板	BD Falcon	353224	样品制备
琼脂	MoorAgar	41084	果蝇食物
Aivia	DRVision LLC		本研究优化部分
氯仿（以戊烯稳定）	Sigma-Aldrich	C2432	样品制备
CO2 吹枪（用于杂交果蝇筛选）	杰内西	54-104	果蝇遗传学/杂交
CO2 麻醉装置（用于杂交果蝇筛选）	杰内西	59-180	果蝇遗传学/杂交
冷却CCD相机	滨松	ORCA-R2	图像采集
玉米粉	杰内西	62-101	果蝇食物
蒸馏水			果蝇食物
双面胶带	透明胶带		样品制备
果蝇培养管	杰内西	32-109	果蝇食物
果蝇培养瓶用泡沫塞（Droso-plugs）	杰内西	59-200	果蝇食物
Dumont #5 生物不锈钢镊子	Fine Science Tools	11252-20	样品制备
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 果蝇	梅丽莎·罗尔斯（宾夕法尼亚州立大学）惠赠	N/A	果蝇遗传学/杂交
乙醇（95%）	VWR	75811-022	果蝇食物
体视显微镜用光纤照明器/光源	尼康	NI-150	样品制备
Flypad（用于筛选杂交果蝇）	杰内西	59-172	果蝇遗传学/杂交
Forma 环境培养箱/培养孵育器	ThermoFisher	3940	果蝇遗传学/杂交
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898	样品制备
浸油	尼康	MXA22168	图像采集
Kimwipe 细密擦拭纸	Fisher Scientific	34120	样品制备
激光融合模块	光谱应用研究	LMM-5	图像采集
共聚焦显微镜光源	Lumencor	SOLA 54-10021	图像采集
MetaMorph 显微镜自动化 &和图像分析软件	Molecular Devices		图像采集
方形显微盖玻片，1.5号（#1.5）	VWR	48366-205	样品制备
配备完美聚焦系统的电动倒置显微镜	尼康	TI-ND6-PFS-S	图像采集
电动载物台和快门	之前	Proscan III	图像采集
多功能剪刀	透明胶带	MMM1428	样品制备
指甲油	Sally Hansen	784179032016 074170382839	样品制备
光学滤光片	染色	ET480/40m	图像采集
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	样品制备
P200 Pipetman	Gilson	F123601	样品制备
PBS（10倍浓度），pH 7.4	ThermoFisher	70011044	样品制备
丙酸	Fisher	A258-500	果蝇食物
旋转盘共聚焦扫描仪单元	横川	CSU-X1	图像采集
体视显微镜	尼康	SMZ800N	样品制备
糖（蔗糖）	杰内西	62-112	果蝇食物
Superfrost 载玻片	VWR	48311-600	样品制备
Tegosept	杰内西	20-258	果蝇食物
UAS-dtacc-RNAi 果蝇	维也纳果蝇资源中心（奥地利维也纳）	VDRC-101439	果蝇遗传学/杂交
凡士林石油冻	WB Mason	DVOCB311003	样品制备
Winsor && Newton Brush Regency Gold 520，0号	订书钉	5012000	果蝇遗传学/杂交
酵母	VWR	Torula 酵母 IC90308580	果蝇食物
横河二向色分光镜	Semrock	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	图像采集