一种高通量电化学发光7重联检方法同步筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病

Xiaofan Jia; Ling He; Yong Gu; Hilary High; Liping Yu

doi:10.3791/61160

方法文章

一种高通量电化学发光7重联检方法同步筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病

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DOI：

10.3791/61160

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2020年5月29日

Xiaofan Jia^*¹^,² , Ling He^*¹^,³ , Yong Gu¹ , Hilary High¹ , Liping Yu¹

¹Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, ²Department of Endocrinology, Beijing Hospital, National Center of Gerontology; Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, ³Department of endocrinology, Guangzhou First People's Hospital, School of Medicine, South China University of Technology

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们建立了一种简单的多重电化学发光（ECL）检测方法，可将7种自身抗体检测整合在一起。该检测能够同时筛查1型糖尿病（T1D）以及多种其他自身免疫性疾病，包括乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病和自身免疫性多腺体综合征1型。

摘要

胰岛自身抗体（IAbs）广泛应用于1型糖尿病（T1D）的诊断与预测。针对胰岛素（IAA）、谷氨酸脱羧酶-65（GADA）、胰岛瘤抗原-2（IA-2A）和锌转运蛋白-8（ZnT8A）的四种主要IAbs在疾病预测中具有同等重要性。目前，高达40%被诊断为T1D的患者后续会发展出其他自身免疫性疾病。然而，现有的筛查方法通常仅检测单一自身抗体，操作繁琐，难以适用于大规模筛查研究。我们近期开发了一种简便的多重电化学发光（ECL）检测方法，以解决上述问题。该检测方法将全部7种自身抗体检测整合至一个孔中。每个孔包含三种IAbs（IAA、GADA和IA-2A），以及用于检测自身免疫性甲状腺疾病的甲状腺过氧化物酶抗体（TPOA）和甲状腺球蛋白抗体（ThGA）、用于乳糜泻的组织转谷氨酰胺酶抗体（TGA）和用于自身免疫性多腺体综合征-1（APS-1）的干扰素α抗体（IFNαA）；从而可同时筛查T1D及其他相关自身免疫性疾病。该多重ECL检测基于单重ECL检测平台，但采用多重检测板，可将多达10种自身抗体检测整合至单个孔中。与单重ECL检测的主要区别在于，液体相中形成的每种抗体-抗原复合物通过多重板上的连接系统被固定在孔内的特定位置。本研究中的7重ECL检测使用大量新确诊T1D患者及年龄匹配的健康对照者样本，与标准放射性结合检测（RBA）和单重ECL检测进行比对验证，表现出优异的检测灵敏度和特异性。

引言

1型糖尿病（T1D）是一种严重的慢性疾病，多见于儿童时期。目前，美国约有140万人患有T1D；值得注意的是，全球范围内T1D的发病率正以每年3-5%的速度持续上升，在过去二十年中已翻倍，尤其在幼儿中更为显著¹^,²。血液循环中的胰岛自身抗体（IAbs）是目前最可靠的生物标志物。这些自身抗体可能在临床T1D发病前数年就已出现³。目前，广泛用于T1D诊断和风险筛查的四种主要IAbs包括：抗胰岛素自身抗体（IAA）、抗谷氨酸脱羧酶-65自身抗体（GADA）、抗胰岛瘤相关抗原-2自身抗体（IA-2A）以及抗锌转运蛋白-8自身抗体（ZnT8A）。这四种IAbs在预测T1D发生方面具有同等重要性。最近，T1D的分类已被重新定义：在血糖代谢正常的情况下，若存在上述4种IAbs中的至少2种，即为疾病1期⁴。

在青少年糖尿病自身免疫研究（DAISY）中发现，每四位有T1D风险的儿童中就有一位可能进展为胰岛、乳糜泻、甲状腺或类风湿自身免疫；更引人注目的是，约40%已被诊断为T1D的患者最终会发展出另一种自身免疫性疾病⁵^,⁶^,⁷. 自身抗体的鉴定对于这些自身免疫性疾病的预测和诊断至关重要，应能为患者提供更佳的临床诊疗。目前尚无简便且经济的方法用于筛查这些多种自身免疫性疾病。现有的筛查方法采用标准放射性结合试验（RBA），每次仅检测单一自身抗体，对于大规模筛查而言操作繁琐且效率低下。

本文将介绍一种新开发的简易多重电化学发光（ECL）检测方法，该方法已在单重ECL检测平台的基础上进行了验证⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹。该多重ECL检测法仅需15 µL血清，即可在单个孔中同时完成7种自身抗体的检测，能够同步筛查1型糖尿病（T1D）以及多种相关自身免疫性疾病，包括乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病和APS-1。由于在本研究进行时尚未建立ZnT8A的ECL检测方法，因此该抗体未被纳入多重检测体系。该多重ECL检测法为在普通人群中大规模筛查T1D及多种自身免疫性疾病提供了高效且可靠的工具。

方案

本研究方案已获科罗拉多州多个机构审查委员会批准。

1. 缓冲液配制

配制标记缓冲液（2x PBS，pH 7.9）。取400 mL去离子蒸馏水，加入100 mL 10x PBS。用NaOH调节溶液pH至7.9。
将1 mg生物素溶解于溶液中，配制成3 mM生物素 588 µL 先前配制的标记缓冲液。通过将150 nmol的Ru Sulfo-NHS溶解于缓冲液中制备3 mM的Ru Sulfo-NHS。 50 µL 标记缓冲液的量。
取500 mL 1×PBS，加入5 g牛血清白蛋白（BSA），配制抗原缓冲液（1% BSA）。配制0.5 M乙酸溶液。使用Trizma Base配制1 M Tris-HCl缓冲液，并将pH值调节至9.0。
对于包被缓冲液（3% 封闭剂 A），取 500 mL 1x PBS 并加入 15 g 封闭剂 A。通过将 5000 mL 1x PBS 与 2.5 mL Tween 20 混合制备洗涤缓冲液（0.05% Tween 20，PBST）。通过加入 500 mL 去离子水和 500 mL 4x 含表面活性剂读取缓冲液制备读取缓冲液（2x 含表面活性剂读取缓冲液 T）。
注意：为了保持各检测之间的一致性，生物素和Ru Sulfo-NHS溶液必须在标记步骤前 freshly 配制，不得提前配制并储存以供后续使用。

2. 分别用生物素和Ru Sulfo-NHS标记每种抗原蛋白

注意：为了获得更有效的标记反应，请使用浓度≥0.5 mg/mL的抗原蛋白。

计算每种抗原蛋白的摩尔数以及生物素和Ru Sulfo-NHS的摩尔数。根据抗原蛋白与生物素或Ru Sulfo-NHS的摩尔比，向抗原蛋白中加入适量的生物素或Ru Sulfo-NHS进行标记反应。
1. 对于分子量较小（≤10 kDa）的抗原，如胰岛素原蛋白，使用1:5（抗原:生物素和Ru Sulfo-NHS）的摩尔比；对于分子量较大（>50 kDa）的抗原，如GAD蛋白，使用1:20的摩尔比；对于分子量中等（10–50 kDa）的抗原，使用介于1:5至1:20之间的摩尔比进行调整。
对于生物素和Ru Sulfo-NHS，将每种抗原的质量除以其相应的分子量，得到各自的抗原摩尔数；再将摩尔数除以浓度，计算出所需生物素的体积。对Ru Sulfo-NHS重复相同步骤。
按照步骤2.2中确定的适当摩尔比，将抗原蛋白与生物素混合，然后对Ru Sulfo-NHS进行同样的操作。
注意：为了提高标记反应效率，缓冲体系中任何还原性化学物质（如Tris或甘氨酸）需通过尺寸排阻离心柱更换为2x PBS缓冲液（pH 7.9）。生物素和Ru Sulfo-NHS的标记方案完全相同。
用铝箔包裹反应管，并在室温（RT）下孵育1小时。使用铝箔包裹的原因是生物素和Ru Sulfo-NHS试剂均对光敏感。
在反应管孵育的同时，对2 mL或5 mL离心柱进行预处理（离心柱的规格由上样体积决定）。向离心柱中加入2x PBS缓冲液，每次以1,000 × g 离心2分钟，共重复三次。
反应管孵育结束后终止标记反应。通过将标记后的抗原蛋白溶液一次性通过预处理过的离心柱进行纯化，从而终止反应，随后以1,000 × g 离心2分钟。
通过将存在的抗原蛋白量除以最终体积，计算总的标记抗原浓度。将纯化后的标记抗原蛋白按每管50 µL分装，并于-80 °C长期保存。
注意：需注意的是，每次抗原蛋白通过离心柱时，回收率约为90–95%。

3. 确定检测中两种标记抗原的最佳浓度和比例（棋盘式滴定实验）

注意：由于本7重检测中的ECL-IAA检测需要对血清样本进行酸处理，因此每种抗原的棋盘式检测都必须在与标记抗原混合物孵育之前完成此步骤。

在运行多重检测之前，需对每种抗原分别进行棋盘式滴定实验。步骤 3.2–3.6 以 GAD65 为例进行说明。
计算标记的 GAD65 蛋白的稀释度。建议生物素标记的 GAD65 第一混合液的目标浓度为 2000 ng/mL，Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 为 1000 ng/mL。如果生物素标记和 Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 储存液浓度均为 1.0 µg/µL，则在 560 µL 工作液中所需生物素标记 GAD65 的体积为 1.12 µL，在 700 µL 工作液中所需 Ru Sulfo-NHS 标记 GAD65 的体积为 0.7 µL。
在一个离心管中加入 1.12 µL 生物素标记的 GAD65 蛋白、240 µL 链霉亲和素偶联的连接子 1 和 160 µL 1% BSA，混匀。室温孵育 30 分钟。向管中加入 160 µL 终止液，再于室温孵育 30 分钟。
进行系列稀释。取 280 µL 上述混合液加入新管，加入 280 µL 终止液，制成 1:2 稀释液。准备多个新管，重复此步骤，对生物素标记的 GAD65 抗原进行横向系列稀释（参见先前发表的研究¹²）。
将 0.7 µL Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 蛋白（1 µg/µL）与 700 µL 终止液混合。取 350 µL 该混合液加入新管，加入 350 µL 终止液，制成 1:2 稀释液。准备多个新管，重复此步骤，对 Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 抗原进行纵向系列稀释。
准备两份血清样本，一份为 GADA 高度阳性，另一份为 GADA 阴性，每份体积为 0.75 mL。将 15 µL 阳性血清加入 96 孔 PCR 板左侧每一孔中，将 15 µL 阴性血清加入右侧每一孔中。
向每孔中加入 18 µL 0.5 M 乙酸并混匀。室温孵育 45 分钟。准备一个新的 96 孔 PCR 板，根据系列稀释方案，向每孔中加入 17.5 µL 生物素标记抗原和 17.5 µL Ru Sulfo-NHS 标记抗原（参见先前发表的研究¹²）。
继续执行步骤 5.2 至 9.1 中描述的其余检测步骤。
计算强阳性样本信号与相应阴性样本信号的比值。通过确定阳性信号与阴性信号比值最高或接近最高的点，选择生物素标记抗原和 Ru Sulfo-NHS 标记抗原的最佳浓度。在计算该比值时，应考虑阴性样本产生的低背景信号。
注意：棋盘式滴定实验确定的 Ru Sulfo-NHS 和生物素标记抗原蛋白的最优浓度如下：GAD65 为 30 ng/mL 和 200 ng/mL，胰岛素原为 120 ng/mL 和 120 ng/mL，IA-2 为 10 ng/mL 和 42 ng/mL，TG 为 80 ng/mL 和 80 ng/mL，TPO 为 8 ng/mL 和 16 ng/mL，ThG 为 31 ng/mL 和 31 ng/mL，IFNα 为 12 ng/mL 和 12 ng/mL。

4. 配制混合连接剂偶联抗原溶液

根据棋盘式实验确定每种抗原的最佳浓度。将生物素和Ru Sulfo-NHS标记的抗原稀释至合理的使用浓度。
将不同的连接子分别与各特异性生物素标记的抗原蛋白结合。对于一个96孔板检测，将4 µL生物素标记的GAD65、TPO、tTG、ThG、胰岛素原、IFN-α和IA-2蛋白分别与240 µL链霉亲和素偶联的连接子1、2、3、4、8、9和10加入不同的离心管中（图1）。然后每管加入156 µL PBS/1% BSA。室温孵育30分钟。
每管加入160 µL终止液，再于室温孵育30分钟。从每管中取400 µL连接子偶联的抗原，将全部7种抗原混合在一起。加入1.2 mL终止液，然后向混合液中加入4 µL Ru Sulfo-NHS标记的GAD65、TPO、tTG、ThG、胰岛素原、IFN-α和IA-2抗原。此时抗原溶液已准备好，可用于检测。

5. 将血清样本与标记的抗原孵育

注意：由于本7重检测中的ECL-IAA检测需要对血清样本进行酸处理，因此每份血清在与标记抗原混合物孵育前，均需先进行酸处理步骤。

在96孔PCR板中，每孔分装15 µL血清。每孔加入18 µL 0.5 M乙酸，混匀。室温孵育45分钟。另取一个新的96孔PCR板，每孔分装35 µL抗原溶液。
在板子孵育期间，向抗原板的每孔中加入13 µL 1 M Tris pH 9.0缓冲液。将缓冲液加至每孔侧壁，以减少Tris缓冲液与抗原的混合。孵育结束后，取25 µL酸处理后的血清，立即移入抗原板的每孔中。轻轻振荡混匀，并用PCR密封膜封板，避免光照。
室温下将板子置于摇床上，低速振荡1小时。随后将板子置于4 °C，继续孵育18–24小时。

6. 准备多重检测板

从 4 °C 冰箱中取出一块多重检测板，使其升至室温。当多重检测板达到室温后，向每孔加入 150 µL 3% 封闭剂 A。用密封膜覆盖多重检测板，在 4 °C 冰箱中孵育过夜。
注意：第 1 天实验步骤包括步骤 4 至步骤 6。

7. 将血清/抗原孵育液转移至多重检测板

次日，将纸巾铺在实验台上，从冰箱中取出正在孵育的多重检测板。将板内所有缓冲液倒出。具体操作为：将板倒置，轻拍于准备好的纸巾上，直至各孔中无残留缓冲液。
通过向每孔加入 150 µL PBST 对多重检测板进行洗涤。弃去缓冲液（如步骤 7.1 所述），重复此步骤三次。向多重检测板的每孔中加入 30 µL 血清/抗原孵育液。用铝箔覆盖该板，以减少光照暴露。将板置于平板摇床，室温下低速振荡孵育 1 小时。

8. 洗涤平板并加入读板缓冲液

将多重检测板倒置，轻弹去除血清/抗原孵育液。向所有孔中加入150 µL PBST，再次将板倒置并轻弹去除洗涤液。重复此步骤三次。第三次洗涤完成后，向每孔中加入150 µL读取缓冲液。
注意：气泡会影响酶标仪准确分析结果，应尽可能避免。

9. 读取酶标板并分析数据

使用酶标仪读取已准备好的反应板，读取所有以每秒计数（CPS）为单位的数值。
根据酶标仪获得的抗体水平，使用以下公式计算检测的相对指数：
指数值 = [CPS（样本） - CPS（阴性标准品）] / [CPS（阳性标准品） - CPS（阴性标准品）]。
根据已建立的临界值判断各抗体结果为阴性或阳性。
注：检测第2天包括步骤7至步骤9。

结果

检测结果的分析见表 1、表 2和表 3。读数来源于同一孔内10个位点的数据。各样本的指数值根据检测方案中所述，以其相应的内部阳性和阴性对照进行计算。表 1中展示了重复性差的示例，导致了表 3中最终指数计算的误差。所有原始计数值均需进行核查，以避免出现任何假阳性或假阴性结果。

7重电化学发光（ECL）检测通过包含1026例新诊断1型糖尿病（T1D）患者和1022例年龄与性别匹配的健康对照个体的大样本队列进行了验证。1026例T1D患者的7重ECL检测自身抗体水平与各对应的已建立的单重ECL检测结果进行了比较，如图所示。图2 以及来自每个相应的单标准 RBA 和 ELISA，如图所示图3. 将检测特异性均设定为99^th 除甲状腺自身抗体（使用第95百分位数）外，其余所有自身抗体检测均采用1022名健康对照者的第97.5百分位数，涵盖所列全部三种检测方法（7-plex ECL、单重ECL、RBA或ELISA） 表4. GADA、IA-2A、IAA、TPOA、ThGA、TGA 和 IFN 的批间变异系数α分别为 6.4%、4.5%、9.1%、4.9%、5.7%、11.3% 和 5.9%。

在每种检测方法的临界值附近，发现每种7种自身抗体中有少量样本结果不一致（图2 和图3）。在对照组样本中，有11例（11/1022，1.1%）仅在7重检测中显示多种自身抗体阳性，而在相应的单项检测中均为阴性。在1型糖尿病患者中也有类似情况，共9例（9/1026，0.9%）。此外，在患者队列中，有10例甲状腺过氧化物酶抗体（TPOA）高阳性样本和1例促甲状腺激素受体抗体（ThGA）样本在单项ECL检测和放射结合分析（RBA）中均为阳性，但在7重检测中呈阴性。当对这些样本进行进一步稀释后，7重检测结果转为阳性。总体而言，单项ECL检测或RBA中所有阳性样本在7重ECL检测中均被检出，阳性覆盖率达到100%，且检测特异性相同，如表4所示。

figure-results-1
图1：多重电化学发光（ECL）检测示意图。
血清中的自身抗体将Ru Sulfo-NHS标记的抗原与生物素标记的抗原连接起来，并通过特异性连接子形成抗原-抗体-抗原-连接子复合物。这些复合物被捕获到微孔板上，并通过各自的特异性连接子固定在特定位置。图中展示了针对7种不同抗原蛋白的特异性连接子编号。抗体信号的检测采用Ru Sulfo-NHS标记的抗原并结合电化学发光技术完成。该图来自Gu, Y. 等人¹³。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-2
图2：1026例T1D新发患者中7种自身抗体水平在单重ECL检测与7重ECL检测间的比较
图 a、b、c、d、e、f 和 g 分别显示了 GADA、IA-2A、IAA、TGA、TPOA、ThGA 和 IFN 自身抗体水平的比较αA，分别表示。虚线代表每种自身抗体检测的检测阈值。阈值设定为第99百分位数^th 百分位数基于每项检测的1022例年龄匹配的健康对照（TPOAb和ThGA除外，其设定为95^th 百分位数），如图所示表4，来自1022名年龄匹配的健康对照者，用于单重和多重ECL检测。红色实心菱形标记在7重ECL检测中被标识为“假”阳性 <研究队列中有1%的样本被单重ECL和RBA验证为阴性。在7重ECL检测中，由于“前带”现象（主要出现在TPOA检测中）导致的“假”阴性结果以红色实心方块标示 <研究队列的1%。这些假阳性和假阴性结果均在讨论部分进行了讨论。该图来自Gu, Y. et al.¹³. 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-3
图3：1026例T1D新发患者中7种自身抗体水平在RBA（IFNαA采用ELISA）与7-Plex ECL检测法之间的比较。
图a、b、c、d、e、f和g分别展示了GADA、IA-2A、IAA、TGA、TPOA、ThGA和IFNαA的自身抗体水平比较结果。虚线表示每种自身抗体检测的临界值，该临界值在RBA和7-Plex ECL检测中具有相同的特异性，基于来自1022例年龄匹配的健康对照个体的数据，如表4所示。红色实心菱形和方形分别代表在7-Plex ECL检测中出现的“假”阳性与“假”阴性结果，这在图2中也有展示。该图引自Gu, Y. 等人¹³。请点击此处查看该图的放大版本。

	1	2	3	4	5	6
A	5580	5674	105	117	125	139	linker-1
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B	324	337	147	148	5426	5366	linker-1
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C	110	110	87	81	2114	2365	linker-1
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D	98	88	92	84	136	127	linker-1
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E	101	114	101	106	532	548	linker-1
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	72	78	82	74	486	503	linker-8
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F	119	120	133	118	112	96	linker-1
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	406	395	111	123	2127	101	linker-3
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G	90	95	85	82	105	107	linker-1
	99	86	77	76	1250	1174	linker-2
	119	123	120	118	112	108	linker-3
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	73	73	71	82	84	75	linker-6
	5210	5173	72	69	76	85	linker-7
	80	81	79	82	100	101	linker-8
	96	97	89	83	65	83	linker-9
	98	103	86	88	1933	1979	linker-10

H	114	124	81	86	299	295	linker-1
	107	92	69	72	4256	4388	linker-2
	114	123	125	129	501	536	linker-3
	77	70	67	64	74	62	linker-4
	92	110	81	84	77	71	linker-5
	87	79	72	76	83	81	linker-6
	328	341	84	80	88	97	linker-7
	75	84	75	90	74	83	linker-8
	73	79	78	76	84	70	linker-9
	113	120	81	76	2372	2350	linker-10

表1：7重ECL检测分析：原始CPS计数（板的左半部分）。 原始CPS计数来自检测板（板的左半部分），每个样本均设复孔。在板的每一行（A-H）下方，有10行读数，代表同一孔内10个点位的数据，对应于各连接子编号（linker number）的标记位置。重复性差的复孔示例以灰色高亮显示，如F行-连接子3-第5和第6列所示。

表1A行	表1A列		linker 1	linker 2	linker 3	linker 7	linker 8	linker 9	linker 10
A	1-2	GADA PC	5627	104	120	88	71	101	110
B	1-2	GADA Low PC	331	102	115	103	83	88	81
C	1-2	TPOA PC	110	5603	123	82	80	80	109
D	1-2	TPOA Low PC	93	290	105	88	73	72	92
E	1-2	TGA PC	108	99	6002	90	75	87	109
F	1-2	TG Low PC	120	96	401	101	77	78	131
G	1-2	ThGA PC	93	93	121	5192	81	97	101
H	1-2	ThGA Low PC	119	100	119	335	80	76	117
A	3-4	IAA PC	111	102	112	82	1611	78	96
B	3-4	IAA Low PC	148	91	121	99	197	71	91
C	3-4	IFNaA PC	84	79	69	78	80	4994	83
D	3-4	IFNaA Low PC	88	86	74	82	66	330	78
E	3-4	IA-2A PC	104	107	125	68	78	87	5770
F	3-4	IA-2A Low PC	126	98	117	95	86	98	361
G	3-4	NC	84	77	119	71	81	86	87
H	3-4	NC	84	71	127	82	78	77	79
A	5-6	sample1	132	3851	119	2217	82	77	106
B	5-6	sample2	5396	80	69	950	94	80	4844
C	5-6	sample3	2240	90	3305	130	66	87	119
D	5-6	sample4	132	561	134	848	93	2520	128
E	5-6	sample5	540	679	100	233	495	61	256
F	5-6	sample6	104	89	1114	61	72	77	89
G	5-6	sample7	106	1212	110	81	101	74	1957
H	5-6	sample8	297	4322	519	93	79	77	2361

表2：7重ECL检测分析：表1数据的重新排列，标记为7种连接子。 来自表1的数据经过重新整理，删除了未使用的连接子4至6，并基于表1中的每个重复读数计算了平均值。每种自身抗体检测对应的内标高值和低值阳性对照的数值（由特定连接子限定）以深色加粗显示。PC，阳性对照；NC，正常对照。

	GAD指数	TPOA指数	TGA指数	ThGA指数	IAA指数	IFNaA指数	IA-2A指数
GADA阳性对照	1.000	0.005	0.000	0.003	-0.006	0.003	0.004
GADA低阳性对照	0.045	0.005	-0.001	0.006	0.002	0.000	-0.001
IAA阳性对照	0.005	1.000	0.001	0.002	-0.001	-0.001	0.004
IAA低阳性对照	0.002	0.039	-0.002	0.003	-0.005	-0.003	0.001
IA-2A阳性对照	0.004	0.004	1.000	0.004	-0.004	0.000	0.004
IA-2A低阳性对照	0.007	0.004	0.048	0.006	-0.002	-0.002	0.008
TGA阳性对照	0.002	0.003	0.000	1.000	0.000	0.002	0.002
TG低阳性对照	0.006	0.004	0.000	0.052	-0.001	-0.002	0.005
TPOA阳性对照	0.005	0.005	-0.001	0.002	1.000	-0.002	0.001
TPOA低阳性对照	0.012	0.003	0.000	0.006	0.076	-0.003	0.001
ThGA阳性对照	0.000	0.000	-0.008	0.001	0.000	1.000	-0.001
ThGA低阳性对照	0.001	0.002	-0.008	0.002	-0.009	0.050	-0.002
IFNaA阳性对照	0.004	0.006	0.001	0.000	-0.002	0.000	1.000
IFNaA低阳性对照	0.008	0.004	0.000	0.005	0.004	0.002	0.048
阴性对照	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
阴性对照	0.000	-0.001	0.001	0.002	-0.002	-0.002	-0.001
样本1	0.009	0.683	0.000	0.419	0.001	-0.002	0.003
样本2	0.958	0.001	-0.008	0.172	0.009	-0.001	0.837
样本3	0.389	0.002	0.542	0.012	-0.009	0.000	0.006
样本4	0.009	0.088	0.003	0.152	0.008	0.496	0.007
样本5	0.082	0.109	-0.003	0.032	0.271	-0.005	0.030
样本6	0.004	0.002	0.169	-0.002	-0.006	-0.002	0.000
样本7	0.004	0.205	-0.002	0.002	0.013	-0.002	0.329
样本8	0.039	0.768	0.068	0.004	-0.001	-0.002	0.400

表3：7重ECL检测分析：指数值结果。 每个样本在全部7种自身抗体检测中的指数值均根据检测方案中所述，相对于相应的内部阳性和阴性对照进行计算。任何高于临界值的指数值均被定义为阳性结果，以深色粗体显示。样本6的TGA指数值以灰色突出显示，因其为重复性差导致的错误结果，如表1中F-linker 3行第5和第6列所示。

	GADA		IA-2A		IAA		TGA		TPOA		ThGA		IFNαA*
	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性	灵敏度	特异性
RBA	73.4%	98.5%	75.2%	99.0%	47.7%	99.1%	12.9%	99.0%	23.9%	95.2%	19.3%	94.7%	1.0%	99.6%
单重ECL	71.6%	99.1%	73.6%	99.3%	48.3%	99.7%	16.0%	98.9%	26.3%	94.9%	20.6%	95.1%	0.8%	99.2%
7重ECL	71.2%	98.9%	77.3%	98.9%	49.5%	98.9%	16.5%	98.7%	26.1%	94.7%	21.1%	94.7%	1.7%	99.1%

表4：在1026例1型糖尿病患者和1022例年龄与性别匹配的对照者中，采用7重ECL检测法测定的检测灵敏度和特异性，与相应的单重ECL检测法以及RBA或ELISA*相比。为每种自身抗体设置了三种不同的检测方法（RBA、单重ECL和7重ECL），使用1022例年龄和性别匹配的健康对照样本使各检测方法达到相近的特异性。在对照队列中，TPOA和ThGA的特异性设定约为95%，其余5种检测的特异性设定为99%。*星号标记IFNα一种用于ELISA的检测方法，而其他为RBA。

讨论

在多项针对1型糖尿病的国家级和国际级临床试验中，单重电化学发光（ECL）检测法在检测胰岛自身抗体以及乳糜泻相关的转谷氨酰胺酶自身抗体（TGA）方面的性能已得到充分验证⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹。在这些试验中，与现有的“金标准”放射性结合检测法（RBA）相比，该检测法在自身抗原检测方面的灵敏度和特异性均有所提高。在区分高亲和力、高风险胰岛自身抗体与低风险、低亲和力信号方面，单重ECL检测法相较于RBA展现出更高的疾病特异性¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷。在单重ECL检测法的基础上，我们提出了一种新型高通量多重ECL自身抗体检测方法，可同时实现对1型糖尿病及多种相关自身免疫性疾病的联合筛查。

多重ECL检测利用多重检测板，可将多达10种自身抗体检测合并至单个孔中。在本研究中，共合并了7种自身抗体检测。这些自身抗体包括3种胰岛自身抗体（IAA、GADA和IA-2A）、2种自身免疫性甲状腺疾病自身抗体（TPOA和ThGA）、乳糜泻自身抗体（TGA），以及针对干扰素α的APS-1自身抗体（IFNαA）。该检测的基本原理总体上基于此前已发表的单重ECL检测方法⁹^,¹⁰^,¹²^,¹⁸，并进行了部分改进。多重ECL检测与单重ECL检测的主要区别在于，在液相中形成的每种抗体-抗原复合物会通过特定的连接系统被固定在孔内的特定位置（图1）。生物素标记的抗原与链霉亲和素偶联物（一种用于形成特定抗原-连接物复合物的连接物）共同孵育。在与患者血清孵育后形成抗体-抗原免疫复合物，并通过多重板各孔中的特异性连接系统被捕获至特定位置。同时，由抗体捕获的Ru Sulfo-NHS标记抗原产生电化学发光信号。酶标仪可从每个孔内的不同信号源位置检测多达10种不同的信号。为了在不同检测板之间以及长期研究过程中保持自身抗体检测的一致性，我们建议使用相同的连接物。

在建立多重电化学发光（ECL）检测方法之前，需先分别将每种自身抗体的单重ECL检测优化至多重检测板上，并使用常规ECL板上的放射性结合检测（RBA）和单重ECL检测进行验证。为了优化棋盘式滴定实验，在多重检测板上针对相应的自身抗体检测，分别使用了强阳性患者样本和阴性患者样本。在完成棋盘式滴定实验后，计算出7种自身抗体检测中每种检测对应的Ru Sulfo-NHS和生物素标记抗原的最佳浓度：GAD65为30 ng/mL和200 ng/mL，胰岛素原为120 ng/mL和120 ng/mL，IA-2为10 ng/mL和42 ng/mL，TG为80 ng/mL和80 ng/mL，TPO为8 ng/mL和16 ng/mL，ThG为31 ng/mL和31 ng/mL，IFNα¹³分别为12 ng/mL和12 ng/mL。在将所有检测合并为完整的多重检测后，根据实际检测结果，部分抗原在棋盘式滴定实验中确定的浓度可能需要进一步调整。

由于本研究中的多重 ECL 检测包含了 IAA，因此在将血清样本与抗原孵育之前，必须对血清样本进行酸处理，如先前研究所述¹²。通常情况下，当向多重检测中添加额外的自身抗体时，检测背景会受到影响，某一检测点产生的极高信号可能会通过串扰干扰同一孔中邻近检测点的结果。因此，对于信号最强的阳性样本，每种自身抗体的最大 CPS 需限制在 20,000 计数或更低。根据我们的经验，为了减少串扰的影响，在设计点阵图时，应将背景信号较低的自身抗体检测点与计数频率较高的检测点相隔较远。

每次实验均使用高阳性与阴性对照，以准确计算待测样本的指数。为准确评估和监测实验的灵敏度，还使用了接近实验上限的低阳性对照。这些标准的阳性和阴性对照被大量制备后分装，长期保存于 -20 °C 或更低温度下，以确保不同实验间的一致性。出于质量控制目的，每个样本在每次实验中均重复检测两次，且所有阳性结果均需在次日通过新的电化学发光实验重新检测并确认。若首次实验与第二次确认实验结果不一致，则需进行第三次实验。在三次实验中，以两次结果一致（例如，+，+ 或 -，-）的结果作为样本的最终结果（阳性或阴性）。

近十年来，许多研究团队一直在寻求一种高通量的检测方法，利用多重技术将多种自身抗体检测整合到一个孔中，以实现对大规模人群的筛查。已有少数研究采用不同技术平台开展多重自身抗体检测¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²，但在研究1型糖尿病（T1D）时，这些检测方法均未与当前的“金标准”放射性结合检测法（RBA）在敏感性和特异性方面进行过比较。这些不同的检测平台尚未通过国际胰岛自身抗体标准化项目（IASP）研讨会验证，也未在大规模临床试验队列中得到验证。在德国最近一项基于普通人群的筛查中，正在使用Kronus公司提供的高通量联合检测试剂盒3 Screen ICATM ELISA作为一线筛查工具，用于检测三种胰岛自身抗体（GADA、IA-2A和ZnT8A），以实现儿童T1D的早期诊断²³。3-Screen ELISA检测可在三个独立孔中分别检测三种自身抗体，但会消耗大量血清；也可在单个孔中混合进行三项检测。若3-Screen ELISA检测中某一孔结果为阳性，则无法区分是哪一种自身抗体呈阳性。该检测最大的缺点是无法包含对IAA的检测。所有基于ELISA方法检测IAA的结果，如IASP研讨会所证实，均缺乏可接受的敏感性和特异性²⁴。IAA通常是最早出现的胰岛自身抗体，在年幼儿童中具有很高的阳性率。对于儿童而言，包含IAA的自身抗体筛查是必要的，若不检测IAA，则不能被接受作为社区中评估T1D风险的筛查手段。此外，目前尚无已发表的研究或数据表明Kronus公司的胰岛自身抗体试剂盒在T1D疾病特异性方面更优，或能够有效区分高风险与低风险的自身抗体。本研究中的7重ECL检测已使用大量新确诊T1D患者队列进行了验证¹³。与当前标准RBA及成熟的单重ECL检测相比，7重ECL检测能够保持100%的阳性检出率，同时具有相同的检测特异性（表4）。目前，4重ECL检测正与标准RBA平行应用于一项正在进行的大规模临床试验：儿童自身免疫筛查（ASK）研究。该试验对美国丹佛大都会区普通人群中的儿童进行T1D和乳糜泻的筛查。与ASK研究中使用的标准RBA相比，多重ECL检测显示出优异的敏感性和更高的疾病特异性，结果与我们此前使用单重ECL检测的研究报告一致²⁵。此外，与相应的4种单重ECL和RBA检测相比，我们的4重ECL检测在人力、成本和血清用量方面均显著降低了70%。通过使用多重ECL检测，我们可以根据特定临床需求，定制每个孔中包含的不同数量的检测项目（最多可达10项），以检测与特定临床场景相关的不同自身免疫性疾病。

在本研究中观察到，使用多重孔板的多重电化学发光（ECL）检测方法存在一些局限性。血清与抗原孵育后的最终稀释度无法针对单孔中组合的每种自身抗体检测均调整至最优条件。在1型糖尿病（T1D）患者中，有9份样本（9/1026）在特定自身抗体检测中出现假阴性结果。在7重ECL检测中，这7例假阴性中有7例为甲状腺过氧化物酶自身抗体（TPOA），2例为甲状腺球蛋白自身抗体（ThGA），但在单重ECL检测和放射性结合检测（RBA）中均显示强阳性结果（图2 & 3）。对这9份样本进一步稀释后，在多重孔板上检测转为阳性。该现象由我们称为“前带效应”（prozone）所致，即因抗体滴度过高而影响抗原-抗体晶格结构的形成，从而导致样本呈现假阴性结果。在建立多重检测时，建议对每种组合的自身抗体中具有极高滴度的样本预先进行预实验，以确定抗原孵育时血清的最佳稀释比例。或者，应选择具有相似最优化条件的自身抗体检测组合，以实现每种自身抗体检测的最佳灵敏度和特异性。在本研究中，来自健康对照者的7份样本（7/1022）在7重ECL检测中表现为多种自身抗体的假阳性，但在进行单重ECL检测和RBA检测后（图2 & 3），这些自身抗体在两种检测中均被确认为阴性。目前尚不清楚在多重孔板上出现此类假阳性结果的具体原因。针对当前多重ECL检测的应用，所有阳性样本均需通过相应的单重ECL检测重复验证以确认阳性结果，从而消除多重ECL检测中的假阳性误差。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DK32083，以及青少年糖尿病研究基金会（JDRF）资助项目2-SRA-2015-51-Q-R和2-SRA-2018-533-S-B支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
4 °C 冰箱
–80 °C 和 -20 °C 冰箱
96孔板摇床	Wallac - Delfi
96孔圆底板	Fisher	8408220
乙酸溶液	Fisher
铝箔
抗原蛋白
人GAD65全长蛋白	Diamyd
人甲状腺球蛋白全长蛋白	BioMart
人甲状腺过氧化物酶全长蛋白	BioMart
IA-2 胞内结构域蛋白	BioMart
IFN-α 蛋白	Abcam
胰岛素原蛋白	AmideBio
tTG 蛋白	DiaRect
生物素	Sigma
500 mL 瓶顶滤器单元	Fisher	0974064A 或 B
牛血清白蛋白	Sigma	A-7906
去离子蒸馏水（DD 水）
HCl	Fisher
制冰机
冰盒
MSD 赛道	Perkin-Elmer
多通道移液器
NaOH
纸塔
PBS
pH计
Pipette-Aid
移液器/吸头
Ru Sulfo-NHS	MSD (R91AN)
Trizma Base	Fisher	BP152-5
Tween 20	Sigma	P-1379
Uplex 开发套件	MSD
96孔UPlex板	MSD
阻断剂 A	MSD	R93AA
连接素-链霉亲和素	MSD
读取缓冲液	MSD	R92TC
终止液	MSD
涡旋混合器
ZeBa 柱	Pierce	89892

参考文献

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一种高通量电化学发光7重联检方法同步筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病

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