本文介绍了两种优化的实验方案，用于分析中枢神经系统（包括脑、脊髓和脑膜）中的常驻免疫细胞及外周来源的免疫细胞。这些方案有助于确定在稳态和炎症条件下定位于这些解剖区域的细胞的功能与组成。
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摘要
摘要
中枢神经系统（CNS）由脑和脊髓组成，其外层被脑膜包裹。脑膜是一层膜状结构，作为外周与中枢神经系统之间的屏障。中枢神经系统是一个具有免疫特殊性的部位，在稳态条件下，免疫豁免特性在CNS实质中尤为明显。相比之下，脑膜中则含有多种常驻细胞，包括固有免疫细胞和适应性免疫细胞。在由中枢神经系统损伤、自身免疫、感染甚至神经退行性病变所引发的炎症状态下，外周来源的免疫细胞可能进入实质，并定植于脑膜中。这些细胞被认为在中枢神经系统疾病的发生过程中发挥着有益和有害的双重作用。尽管已有上述认识，但在分析中枢神经系统区室时，脑膜常常被忽视，因为传统的中枢神经系统组织提取方法通常忽略了脑膜层。本实验方案提供了两种不同的方法，用于快速分离小鼠中枢神经系统组织（即脑、脊髓和脑膜），适用于后续的单细胞技术、免疫组织化学以及原位杂交等分析方法。所述方法可实现对中枢神经系统组织的全面分析，适用于评估在稳态条件及疾病发生过程中占据中枢神经系统区室的细胞的表型、功能和定位。
引言
中枢神经系统（CNS）是一个具有免疫特殊性的部位。传统上认为，CNS 实质（不包括脑脊液空间、脑膜和脉管系统）属于免疫豁免部位1,2,3,4,5，在稳态条件下其免疫细胞相对匮乏2,6,7。相比之下，由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜组成的脑膜是 CNS 区室的关键组成部分，在疾病发生过程中的稳态免疫监视和炎症反应中发挥重要作用3,6,7,8。在稳态条件下，脑膜中存在大量免疫哨兵细胞，包括固有淋巴样细胞（ILC）、巨噬细胞、树突状细胞（DC）、肥大细胞、T 细胞，以及少量的 B 细胞9,
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方案
所有动物实验均采用达特茅斯盖泽尔医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查并批准的方案。
1. 脑和脊髓样本的脱钙处理
- 分离脑和脊髓样本
- 通过吸入 CO2 对小鼠实施安乐死。确保 CO2 气流速度每分钟置换笼内体积的 10%–30%。
- 使用镊子提起剑突，并用剪刀在肋骨下方沿侧向剪开腹壁，向上提起以避免剪破下方的血管或器官。沿侧向剪开膈肌。
- 沿肋骨两侧平行于肺部向上剪至锁骨处，剪开肋骨笼。用镊子提起胸骨，并用止血钳夹住胸骨。将止血钳越过头部，向上提起肋骨笼以暴露心脏。
- 用镊子夹住心脏心尖附近，于右心房做切口以提供流出通道。将连接有 10 mL 注射器的 25 G 针头插入左心室，缓慢注入 10 mL 冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），进行经心脏灌注。
注意：灌注应持续 4–5 分钟，直至肝脏血液排净。通常 10 mL 的 1× PBS 已足够完成灌注，必要时可增加用量。肝脏变透明通常表明灌注充分。 - 使用锋利的剪刀通过断头法切除头部（图 1；1）。沿中线剪开皮肤（图 1；2），将皮肤翻过眼睛以暴露颅骨。
- ....
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结果
本项代表性实验旨在定量分析B细胞和T细胞，并描述在稳态条件下以及小鼠进行性多发性硬化模型（即TMEV-IDD）中，脑膜和实质中枢神经系统区室中B细胞和T细胞的定位情况。TMEV-IDD模型通过向5周龄雌性SJL小鼠颅内接种5 × 106斑块形成单位（PFU）的TMEV BeAn病毒建立，具体方法如前所述29。
本研究在感染后第120天评估了慢性TMEV-IDD期间脑膜、脑和脊髓中的B细胞和T细胞。以年龄匹配的假手术处理小鼠作为对照。研究包括两个实验：第一个实验旨在获取单细胞悬液，用于流式细胞术分析，这是一种通过检测细胞表面和/或细胞内抗原来分析和定量细胞组成的成熟技术（假手术组n = 4；TMEV-IDD组n = 5）；第二个实验则利用脱钙处理的脑和脊髓组织进行免疫组织化学染色，以描述B细胞和T细胞在中枢神经系统（CNS）中的定位情况（假手术组n = 3；TMEV-IDD组n = 8）。
在分离脑、脊髓以及TMEV-IDD小鼠和假手术处理小鼠的汇集脑膜（脑和.......
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讨论
在稳态和疾病状态下评估中枢神经系统（CNS）区室中细胞组成的多种方法，对于理解CNS的生理与病理状态至关重要。然而，尽管脑膜在CNS中发挥着重要的屏障作用，并容纳了多种多样的免疫细胞，但由于许多传统的脑和脊髓组织提取方法无法保留这些膜结构，脑膜常常被排除在分析之外。这种遗漏严重限制了我们对脑膜细胞组成及其在稳态与炎症条件下功能的认知进展。近期研究表明，存在于脑膜区室中的常驻免疫细胞以及外周来源的免疫细胞，在维持CNS稳态以及驱动CNS疾病发病机制中均发挥着关键作用。这些研究强调了不仅需要分析实质区室，还必须同时分析周围脑膜层的重要性。本文所述的实验方案可实现脑和脊髓的快速分离，同时完整保留脑膜，从而最终能够利用组织学和单细胞分析技术对CNS区室进行全面的下游分析。代表性结果聚焦于评估CNS区室中的免疫细胞；然而，该方案也可根据需要调整，用于分析小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、周细胞、内皮细胞或其他CNS常驻细胞。
所述方法中的关键步骤是组织的精细提取，这对于从脑、脊髓和脑膜中分离出纯净的单细胞悬液，以及获取带有完整颅骨或脊柱的中枢神经系统组织至关重要，后者可实现高质量的组织形态学.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢达特茅斯比较医学与研究中心（CCMR）工作人员在本研究中对实验小鼠的精心照料。本研究由博恩斯坦研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝箔 | 任意 | N/A | |
| 牛血清白蛋白 | ThermoFisher Scientific | 37002D | |
| 离心机 | Beckman Coulter | Allegra X-12R 离心机 | |
| 胶原酶 I | Worthington | LS004196 | |
| 锥形管，15 mL | VWR | 525-1069 | |
| 锥形管，50 mL | VWR | 89039-658 | |
| 盖玻片 | Hauser Scientific | 5000 | |
| 冷冻模具 | VWR | 18000-128 | |
| 弯头镊子 | Fine Science Tools | 11003-14 | |
| 一次性聚苯乙烯管，14 mL | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| 一次性手术刀 | Fisher Scientific | NC0595256 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I | Worthington | LS002139 | |
| 干冰 | Airgas | N/A | |
| Durmont #7 镊子 | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Amresco | 0105-500g | |
| 乙醇，100% | 任意 | N/A | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30910.03 | |
| 带滤膜顶端的管，5 mL | VWR | 352235 | |
| 可固定的活力染料 780 | Becton Dickinson | 565388 | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | Gallios | |
| 葡萄糖 | Fisher Chemical | D16-500 | |
| 山羊抗小鼠 IgG（488 标记） | Jackson Immunoresearch | 115-546-146 | |
| 山羊抗小鼠 IgG（594 标记） | Jackson Immunoresearch | 115-586-146 | |
| 山羊抗兔 IgG 488 | Jackson Immunoresearch | 111-545-144 | |
| 山羊抗大鼠 594 | Jackson Immunoresearch | 112-585-167 | |
| 山羊抗大鼠 650 | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | |
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Corning | 21-020-CV | |
| 血细胞计数板 | Andwin Scientific | 02-671-51B | |
| 止血钳 | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸） | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| KCl | Fisher Chemical | BP366-500 | |
| KH2PO4（无水） | Sigma Aldrich | P5655-100G | |
| 液氮 | Airgas | N/A | |
| 小鼠 FC 封闭剂（CD16/32） | Becton Dickinson | 553141 | |
| Na2HP04（无水） | Fisher Chemical | S374-500 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-500 | |
| 针头，25 号 | Becton Dickinson | 305122 | |
| 正常小鼠血清 | ThermoFisher Scientific | 31881 | |
| 尼龙网筛 | VWR | 352350 | |
| OCT 包埋剂 | Sakura | 4583 | |
| 多聚甲醛，20% | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | 用 1× PBS 稀释至 4% |
| 巴斯德吸管，9 英寸，未堵塞 | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBS（1×） | Corning | 21-040-CV | |
| PE 标记大鼠抗小鼠 CD4 | Becton Dickinson | 553730 | |
| PE-CF594 标记大鼠抗小鼠 CD19 | Becton Dickinson | 562329 | |
| Percoll 密度梯度介质 | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PerCP-Cy5.5 标记大鼠抗小鼠 CD45 | Becton Dickinson | 550994 | |
| 培养皿，100 mm | VWR | 353003 | |
| pH 计 | Fisher Scientific | 13-636-AB150 | |
| 移液器辅助器 | Drummond Scientific Corporation | 4-000-101 | |
| 移液器，200 µl | Gilson | FA10005M | |
| 移液器吸头，1 mL | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 移液器吸头，200 µl | USA Scientific | 1111-1816 | |
| 移液器，1 mL | Gilson | FA10006M | |
| 含 DAPI 的 Prolong Diamond 封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36962 | |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32 | Becton Dickinson | 553141 | |
| 兔抗小鼠 CD3（SP7 克隆） | Abcam | ab16669 | |
| 兔抗小鼠层粘连蛋白 | Abcam | ab11575 | |
| 大鼠抗小鼠 ERT-R7 | Abcam | ab51824 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | |
| 血清移液管，1 mL | VWR | 357521 | |
| 血清移液管，10 mL | VWR | 357551 | |
| 血清移液管，5 mL | VWR | 357543 | |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | S318-100 | |
| 蔗糖 | Fisher Chemical | S5-500 | |
| 手术剪刀 | Fine Science Tools | 14001-16 | |
| 手术剪刀，超精细 | Roboz | RS-5882 | |
| 注射器，10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
| 注射器，5 mL | Becton Dickinson | 309646 | |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250-061 | |
| 真空过滤系统 | Millipore | 20207749 | |
| 真空瓶 | Thomas Scientific | 5340-2L | |
| 真空在线过滤器 | Pall Corporation | 4402 | |
| 真空管线 | Cole Palmer | EW-06414-20 | |
| 水浴锅 | ThermoFisher Scientific | Versa bath |
参考文献
- Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492(2019).
- Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Review....
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