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方法文章

Caenorhabditis elegans 中新生蛋白质合成速率的评估

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DOI：

10.3791/61170

⸱

2020年9月12日

 ,  , 
1Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, Greece, 2Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, Heraklion, 70013, Crete, Greece

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍并描述了一种非放射性、非侵入性的方法，用于在体内评估新生蛋白质的合成，该方法利用线虫Caenorhabditis elegans以及光漂白后荧光恢复技术（FRAP）。该方法可与遗传学和/或药理学筛选相结合，以鉴定蛋白质合成的新调控因子。

摘要

维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的一个显著特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。Caenorhabditis elegans具有透明的身体且易于进行遗传改造，因此是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新蛋白质合成的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光的恢复情况即可反映目标细胞和/或组织中新蛋白质的合成。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及对蛋白质合成速率的活体成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的分子机制。

引言

蛋白质的合成与降解对生物体的稳态至关重要。多种与年龄相关的疾病均由蛋白质生成缺陷所引发1,2。为了测量整体蛋白质翻译速率，目前已有诸如核糖体谱分析（ribosomal profiling）等生物化学技术，该方法通过对核糖体保护的mRNA片段进行深度测序，以监测基因表达及新合成蛋白质的情况3。然而，该方法仅能间接反映翻译速率，因为mRNA与核糖体结合的增加并不一定意味着翻译水平的提升，且存在技术上的局限性，例如成本高昂以及需要大量起始材料。另一方面，基于蛋白质组学的方法可通过脉冲式代谢标记结合质谱分析，实现对蛋白质的直接定量4,5。但该方法为半定量性质，时间分辨率有限，难以在活体中应用。此外，蛋白质标记在目标动物或组织中的分布可能不均。尤为重要的是，上述两种方法均可能掩盖整个动物或组织中蛋白质翻译速率的组织特异性或细胞特异性差异。

Caenorhabditis elegans 是一种易于使用的模式生物，可大规模培养6。此外，其遗传操作简便且身体透明，便于进行活体成像。本实验方案描述了利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术检测蛋白质合成速率的方法。我们利用转基因表达的荧光蛋白，可在整个生物体或特定组织/细胞中进行观察。转基因动物可利用广泛/全局表达的基因启动子驱动 GFP 表达，也可利用组织特异性启动子靶向特定细胞类型。该技术可进一步扩展至特定启动子，以研究特定蛋白质的合成速率。

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方案

注意：转录和翻译水平的荧光蛋白融合均可用于评估多种组织中的新合成蛋白质。可针对定位于不同细胞区室（包括细胞质、线粒体和细胞核）的多个蛋白质家族进行蛋白质合成速率的评估7。以下菌株用于监测整体及神经元的蛋白质合成速率：N2;Ex[pife-2GFP, pRF4]、ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]、N2;Ex[punc-119GFP, pRF4]、edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]、N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]

1. 用于监测从头蛋白质合成的转基因线虫的培养、同步化及制备

  1. 使用解剖体视显微镜评估野生型（wt）和突变型转基因线虫的发育阶段和生长情况。
  2. 第1天：使用线虫挑针挑选并转移10只携带目标荧光报告基因的野生型和突变型转基因L4期幼虫，至接种有大肠杆菌OP50的线虫生长培养基（NGM）平板上 大肠杆菌 大肠杆菌（OP50）（表1).
    1. 使用本生灯在玻璃巴斯德移液管锥形末端与铂金丝的接触处加热熔化，将铂金丝固定于其中，制成线虫挑取针。随后，利用任意工具（如镊子或小锤）将铂金丝末端压平成铲状。
    2. 接种单个菌落 E. coli （OP50）细菌接种至含有50 mL LB液体培养基的锥形瓶中，于37 °C摇床（200 rpm）中振荡培养10小时； 表1然后，用200 μL细菌培养物接种NGM平板。将接种后的平板在室温下孵育过夜，以形成细菌菌苔。
  3. 在20 °C的标准温度下孵育并培养线虫。
  4. 第5天：培养皿中含有转基因蠕虫的混合种群。挑选每种品系的15只L4期幼虫，转移至新接种OP50的大肠杆菌NGM培养皿中。
  5. 第6天：进行FRAP实验，并监测成虫第1天的蛋白质合成速率。
  6. 制备并使用含放线菌酮的NGM平板作为阳性对照：
    注意：通过将环己酰亚胺溶于水配制成 10 mg/mL 的储存液。将储存液保存于 4 °C。
    1. 通过紫外光（222 μW/cm²）照射接种后的NGM平板15分钟以杀灭细菌2 强度）
    2. 在细菌接种的平板上加入环己酰亚胺，使其在琼脂中的终浓度为 500 µg/mL。
    3. 让培养板在室温下干燥30分钟。
    4. 转移表达p的转基因线虫sod-3GFP 在含载体和环己酰亚胺的平板上。
    5. 在标准温度20 °C下孵育动物2小时。

2. 利用表达体细胞组织报告基因 pife-2GFP 和 psod-3GFP 的转基因动物进行 FRAP 检测

注意：监测整个动物体内全局蛋白质合成速率。这些转录报告基因表现出不同的表达水平，并在多种体细胞组织中广泛表达，包括肠道、咽部和体壁肌肉。

  1. 挑选并转移1日龄成虫转基因线虫至已接种OP50的NGM平板上，每板中央接种20 µL OP50。
  2. 移去平板盖，将每个平板置于落射荧光显微镜的20倍物镜下。
  3. 在光漂白前对样品进行调焦，并采集参考图像（光漂白前）。
  4. 对每个样品进行10分钟的光漂白。
    注意：当荧光信号强度降至光漂白前图像的30–50%时，停止光漂白。应根据具体的荧光染料、动物发育阶段以及所观察的细胞或组织，相应调整光照强度和漂白时间。不同样本达到适当光漂白程度所需的照射时间应通过实验确定。
  5. 光漂白后采集图像（漂白后）。
  6. 将线虫保留在单独的NGM平板中，使其恢复。
  7. 在荧光体视显微镜下，每隔1小时对每个荧光报告基因的恢复情况进行成像记录，持续至少6小时。
  8. 或者，可使用落射荧光显微镜（例如AxioImager Z2）进行荧光恢复评估。
  9. 在接下来的3天内，通过监测每条线虫的运动能力、触觉敏感性、繁殖能力和存活情况，仔细评估其健康寿命。光漂白后出现损伤迹象的线虫应排除在后续分析之外。

3. 使用表达泛神经元胞质GFP的转基因线虫 punc-119GFP 进行样品制备及FRAP实验

注意：通过在头部区域（神经环所在位置）进行靶向光漂白，监测全神经元蛋白质合成。

  1. 制备2%琼脂糖垫。
  2. 在琼脂糖垫中央加入10 µL M9缓冲液液滴。
  3. 将5条表达泛神经元胞质GFP的转基因线虫转移至M9缓冲液液滴中。
  4. 使用睫毛工具分散液体。
    注意：由于M9被琼脂吸收，线虫在2分钟内活动会减弱。
  5. 使用“睫毛”挑针调整线虫位置，避免重叠。
  6. 将样品置于落射荧光显微镜的40倍物镜下。
    注意：不要使用盖玻片。
  7. 调焦并采集参考图像（漂白前）。
  8. 对目标区域进行90秒的光漂白。
    注意：当荧光信号强度降至漂白前图像的30–50%时，停止光漂白。应根据具体的荧光染料、线虫发育阶段以及所检测的细胞或组织，相应调整光照强度和漂白时间。达到适当光漂白程度所需的照射时间应通过实验确定。
  9. 光漂白后采集图像（漂白后）。
  10. 在光漂白后的线虫上加入10 µL M9缓冲液液滴。
  11. 让线虫恢复5分钟。
  12. 使用“睫毛”挑针或移液器将线虫分别转移至中心接种有20 µL OP50菌液的NGM平板上。
  13. 每隔1小时在落射荧光体视显微镜下采集每个样品的图像。
    注意：以光漂白后的恢复时间作为t=0。

4. FRAP 实验过程中采集图像的数据分析

  1. 使用软件（例如 Fiji）分析获取的图像。
  2. 用软件打开图像。
  3. 通过 Image 和 Color 下拉菜单选择 Split Channels 命令。
    注意：保留绿色通道图像。
  4. 使用 Freehand Selection 工具手动设定感兴趣的荧光区域（例如整个身体、头部、肠道）。
  5. 通过 Analyze 下拉菜单选择 Measurement 命令，以测量每个时间点感兴趣区域的平均像素强度。
    注意：荧光恢复百分比通过光漂白后拍摄的参考图像进行计算。

5. 报告统计分析

  1. 每种菌株和/或条件下至少使用 20 – 25 条线虫。
    注意：应进行三次生物学重复实验。
  2. 执行学生 t-检验（两组间比较）或方差分析（多组间比较）用于统计分析 P < 使用统计分析软件将0.05作为显著性水平。

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结果

根据本文所述方法，利用表达以下体细胞报告基因的野生型和突变型转基因线虫：pife-2GFP、psod-3GFP 和 punc-119GFP，按照相应实验方案评估了蛋白质合成速率。具体而言，通过使用ife-2启动子驱动在体细胞组织中广泛表达胞质GFP的野生型和ife-2突变型线虫，在光漂白前、光漂白后即刻以及恢复5小时后进行了比较。代表性图像及定量分析显示，野生型个体能够完全恢复荧光，而ife-2突变型个体的恢复能力显著降低（图1A）。因此，野生型线虫在光漂白后可启动新的蛋白质生物合成，而缺乏mRNA翻译起始因子IFE-2的线虫则无法实现此过程，表明荧光恢复速率可反映体内蛋白质合成速率7。此外，环己酰亚胺（cycloheximide）作为一种特异性mRNA翻译抑制剂，可作为蛋白质翻译...

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讨论

蛋白质合成的调控对机体稳态至关重要。在衰老过程中，整体及特定蛋白质的合成均受到干扰。近期研究表明，蛋白质翻译平衡直接调控细胞衰老和机体衰老，并非仅仅是衰老过程的副产物。特别是翻译机制的核心组分，如真核起始因子4E（eIF4E），其在翻译起始过程中促进mRNA加帽，从而调控帽依赖性蛋白质翻译速率，可诱导氧化应激并加速衰老进程1。此外，神经元特异性的EDC-3蛋白可与mRNA加工小体（P小体）相互作用，并提高mRNA去帽速率，同样会加速衰老过程8。具体而言，抑制EDC-3可促使IFE-2被隔离至P小体中，最终降低蛋白质翻译水平，延缓神经元衰老9。

FRAP 是一种最初用于研究蛋白质动态、定位、相互作用和活性的技术，通过在活体中进行活细胞成像并使用非侵入性的荧光标记，使其成为实时研究蛋白质合成速率的有力工具8,10。然而，该实验过...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢 Chaniotakis M. 和 Kounakis K. 进行视频录制与编辑。K.P. 的研究由希腊研究与创新基金会（Hellenic Foundation for Research and Innovation，HFRI）和研究与技术总秘书处（General Secretariat for Research and Technology，GSRT）的资助项目支持。N.T. 的研究由欧洲研究理事会（European Research Council，ERC – GA695190 – MANNA）、欧盟委员会框架计划以及希腊教育与宗教事务部的资助项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Sigma-Aldrich5040
琼脂糖Biozym8,40,004
2% 琼脂糖垫
氯化钙二水合物（CaCl₂）2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
胆固醇SERVA Electrophoresis17101.01
环己酰亚胺Sigma-AldrichC-7698
解剖体视显微镜尼康公司SMZ645
edc-3(ok1427);Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在若干缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体壁且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映特定细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药理学干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。unc-119GFP，pRF4Tavernarakis 实验室在 20 ℃ 条件下培养动物 °C
落射荧光显微镜ZeissAxio Imager Z2
Escherichia coli OP50 菌株秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）
荧光解剖体视显微镜ZeissSteREO Lumar V12
Greiner 培养皿（60 × 15 mm）Sigma-AldrichP5237
ife-2(ok306);Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在若干缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体壁且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映特定细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药理学干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。ife-2GFP，pRF4Tavernarakis 实验室在 20 ℃ 培养动物 °C
图像分析软件Fijihttps://fiji.sc
KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
LB液体培养基
M9 缓冲液
硫酸镁（MgSO₄）4)Sigma-AldrichM7506
显微镜载玻片（75 × 25 × 1 mm）Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel 软件包Microsoft Corporation，雷德蒙德，美国
N2；Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍十分有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明的身体且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映目标细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。ife-2GFP；pRF4Tavernarakis 实验室在20℃下培养动物 °C
N2；Ex[蛋白组的稳态对细胞和生物体的内环境平衡至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的一个标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体和易于进行遗传改造的特点，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光恢复情况，即可反映目标细胞和/或组织中新蛋白质的合成。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及蛋白质合成速率的活体成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的机制。sod-3GFP；pRF4Tavernarakis 实验室在20℃下培养动物 °C
N2；Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍十分有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体壁且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映特定细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。unc-119GFP；pRF4Tavernarakis 实验室在20℃下培养动物 °C
Na2高通量筛选4EMD Millipore1,06,586
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板
制霉菌素储备液Sigma-AldrichN3503
蛋白胨BD，Bacto211677
磷酸盐缓冲液
氯化钠（NaCl）EMD Millipore1,06,40,41,000
制备琼脂平板的标准设备（高压灭菌器、培养皿等）
维持线虫培养的标准设备（铂金丝接种针、培养箱等）。
统计分析软件GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad Prism 软件包
链霉素Sigma-AldrichS6501
紫外交联仪Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
线虫挑取工具

参考文献

  1. Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
  2. Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
  3. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  4. Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
  5. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  7. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547(2009).
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  10. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
  11. Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).
  12. Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).
  13. Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).

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