本文介绍并描述了一种非放射性、非侵入性的方法，用于在体内评估新生蛋白质的合成，该方法利用线虫Caenorhabditis elegans以及光漂白后荧光恢复技术（FRAP）。该方法可与遗传学和/或药理学筛选相结合，以鉴定蛋白质合成的新调控因子。
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方法文章
Caenorhabditis elegans 中新生蛋白质合成速率的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的一个显著特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。Caenorhabditis elegans具有透明的身体且易于进行遗传改造，因此是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新蛋白质合成的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光的恢复情况即可反映目标细胞和/或组织中新蛋白质的合成。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及对蛋白质合成速率的活体成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的分子机制。
引言
蛋白质的合成与降解对生物体的稳态至关重要。多种与年龄相关的疾病均由蛋白质生成缺陷所引发1,2。为了测量整体蛋白质翻译速率，目前已有诸如核糖体谱分析（ribosomal profiling）等生物化学技术，该方法通过对核糖体保护的mRNA片段进行深度测序，以监测基因表达及新合成蛋白质的情况3。然而，该方法仅能间接反映翻译速率，因为mRNA与核糖体结合的增加并不一定意味着翻译水平的提升，且存在技术上的局限性，例如成本高昂以及需要大量起始材料。另一方面，基于蛋白质组学的方法可通过脉冲式代谢标记结合质谱分析，实现对蛋白质的直接定量4,5。但该方法为半定量性质，时间分辨率有限，难以在活体中应用。此外，蛋白质标记在目标动物或组织中的分布可能不均。尤为重要的是，上述两种方法均可能掩盖整个动物或组织中蛋白质翻译速率的组织特异性或细胞特异性差异。
Caenorhabditis elegans 是一种易于使用的模式生物，可大规模培养6。此外，其遗传操作简便且身体透明，便于进行活体成像。本实验方案描述了利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术检测蛋白质合成速....
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方案
注意：转录和翻译水平的荧光蛋白融合均可用于评估多种组织中的新合成蛋白质。可针对定位于不同细胞区室（包括细胞质、线粒体和细胞核）的多个蛋白质家族进行蛋白质合成速率的评估7。以下菌株用于监测整体及神经元的蛋白质合成速率：N2;Ex[pife-2GFP, pRF4]、ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]、N2;Ex[punc-119GFP, pRF4]、edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]、N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. 用于监测从头蛋白质合成的转基因线虫的培养、同步化及制备
- 使用解剖体视显微镜评估野生型（wt）和突变型转基因线虫的发育阶段和生长情况。
- 第1天：使用线虫挑针挑选并转移10只携带目标荧光报告基因的野生型和突变型转基因L4期幼虫，至接种有大肠杆菌OP50的线虫生长培养基（NGM）平板上 大肠杆菌 大肠杆菌（OP50）（表1
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结果
根据本文所述方法，利用表达以下体细胞报告基因的野生型和突变型转基因线虫：pife-2GFP、psod-3GFP 和 punc-119GFP，按照相应实验方案评估了蛋白质合成速率。具体而言，通过使用ife-2启动子驱动在体细胞组织中广泛表达胞质GFP的野生型和ife-2突变型线虫，在光漂白前、光漂白后即刻以及恢复5小时后进行了比较。代表性图像及定量分析显示，野生型个体能够完全恢复荧光，而ife-2突变型个体的恢复能力显著降低（图1A）。因此，野生型线虫在光漂白后可启动新的蛋白质生物合成，而缺乏mRNA翻译起始因子IFE-2的线虫则无法实现此过程，表明荧光恢复速率可反映体内蛋白质合成速率7。此外，环己酰亚胺（cycloheximide）作为一种特异性mRNA翻译抑制剂，可作为蛋白质翻译.......
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讨论
蛋白质合成的调控对机体稳态至关重要。在衰老过程中，整体及特定蛋白质的合成均受到干扰。近期研究表明，蛋白质翻译平衡直接调控细胞衰老和机体衰老，并非仅仅是衰老过程的副产物。特别是翻译机制的核心组分，如真核起始因子4E（eIF4E），其在翻译起始过程中促进mRNA加帽，从而调控帽依赖性蛋白质翻译速率，可诱导氧化应激并加速衰老进程1。此外，神经元特异性的EDC-3蛋白可与mRNA加工小体（P小体）相互作用，并提高mRNA去帽速率，同样会加速衰老过程8。具体而言，抑制EDC-3可促使IFE-2被隔离至P小体中，最终降低蛋白质翻译水平，延缓神经元衰老9。
FRAP 是一种最初用于研究蛋白质动态、定位、相互作用和活性的技术，通过在活体中进行活细胞成像并使用非侵入性的荧光标记，使其成为实时研究蛋白质合成速率的有力工具8,10。然而，该实验过.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
感谢 Chaniotakis M. 和 Kounakis K. 进行视频录制与编辑。K.P. 的研究由希腊研究与创新基金会（Hellenic Foundation for Research and Innovation，HFRI）和研究与技术总秘书处（General Secretariat for Research and Technology，GSRT）的资助项目支持。N.T. 的研究由欧洲研究理事会（European Research Council，ERC – GA695190 – MANNA）、欧盟委员会框架计划以及希腊教育与宗教事务部的资助项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| 琼脂糖 | Biozym | 8,40,004 | |
| 2% 琼脂糖垫 | |||
| 氯化钙二水合物（CaCl₂）2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| 胆固醇 | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| 环己酰亚胺 | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| 解剖体视显微镜 | 尼康公司 | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在若干缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体壁且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映特定细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药理学干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。unc-119GFP，pRF4 | Tavernarakis 实验室 | 在 20 ℃ 条件下培养动物 °C | |
| 落射荧光显微镜 | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 菌株 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC） | ||
| 荧光解剖体视显微镜 | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner 培养皿（60 × 15 mm） | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在若干缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体壁且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映特定细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药理学干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。ife-2GFP，pRF4 | Tavernarakis 实验室 | 在 20 ℃ 培养动物 °C | |
| 图像分析软件 | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB液体培养基 | |||
| M9 缓冲液 | |||
| 硫酸镁（MgSO₄）4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| 显微镜载玻片（75 × 25 × 1 mm） | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel 软件包 | Microsoft Corporation，雷德蒙德，美国 | ||
| N2；Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍十分有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明的身体且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映目标细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。ife-2GFP；pRF4 | Tavernarakis 实验室 | 在20℃下培养动物 °C | |
| N2；Ex[蛋白组的稳态对细胞和生物体的内环境平衡至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的一个标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍然有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体和易于进行遗传改造的特点，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光恢复情况，即可反映目标细胞和/或组织中新蛋白质的合成。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及蛋白质合成速率的活体成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的机制。sod-3GFP；pRF4 | Tavernarakis 实验室 | 在20℃下培养动物 °C | |
| N2；Ex维持健康的蛋白质组对于细胞和生物体的稳态至关重要。蛋白质翻译调控与降解之间的平衡一旦受到干扰，便会引发多种与年龄相关的疾病。蛋白质稳态质量控制机制的衰退是衰老的标志性特征。目前用于检测新合成蛋白质的生化方法仍十分有限，存在多个缺点，且无法在活细胞或活体动物中进行。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有透明体壁且易于进行遗传改造，是利用成像技术监测蛋白质合成速率的理想模型。本文介绍并描述了一种利用光漂白后荧光恢复（FRAP）技术在体内测量新合成蛋白质的方法。通过强光源照射表达荧光蛋白的转基因动物，使其发生荧光光漂白；随后，通过检测荧光信号的恢复情况，即可反映特定细胞和/或组织中新蛋白质的合成水平。因此，结合转基因线虫、遗传和/或药物干预手段以及活体蛋白质合成速率成像，有助于揭示介导年龄依赖性蛋白质稳态崩溃的潜在机制。unc-119GFP；pRF4 | Tavernarakis 实验室 | 在20℃下培养动物 °C | |
| Na2高通量筛选4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| 线虫生长培养基（NGM）琼脂平板 | |||
| 制霉菌素储备液 | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| 蛋白胨 | BD，Bacto | 211677 | |
| 磷酸盐缓冲液 | |||
| 氯化钠（NaCl） | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| 制备琼脂平板的标准设备（高压灭菌器、培养皿等） | |||
| 维持线虫培养的标准设备（铂金丝接种针、培养箱等）。 | |||
| 统计分析软件 | GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | GraphPad Prism 软件包 | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| 紫外交联仪 | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| 线虫挑取工具 |
参考文献
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quali....
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