介绍了一种通过手术缝合输入淋巴管以阻断淋巴液流动的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
淋巴管在维持组织液平衡和通过将抗原、细胞因子及细胞转运至引流淋巴结（LNs）以优化免疫保护方面具有关键作用。在研究淋巴管功能时，中断淋巴液流动是一种重要的方法。从小鼠足垫通向腘窝淋巴结（pLNs）的传入淋巴管被明确定义为淋巴液引流进入pLNs的唯一通路。结扎这些传入淋巴管可选择性地阻断淋巴液向pLNs的流动。该方法可在最大程度减少对引流pLN中的淋巴管内皮细胞、传入淋巴管以及周围其他淋巴管损伤的前提下，实现对淋巴流动的干预。该技术已被用于研究淋巴液如何影响淋巴结中高内皮微静脉（HEV）和趋化因子的表达，以及在缺乏功能性淋巴管的情况下，淋巴液如何流经淋巴结周围脂肪组织。随着人们对淋巴管功能重要性认识的不断加深，该方法将在进一步揭示淋巴管在调控淋巴结微环境和免疫应答中的作用方面具有更广泛的应用前景。
引言
淋巴系统的空间结构为有效清除细胞外液以及将抗原和抗原呈递细胞（APCs）运输至引流淋巴结（LNs）提供了结构和功能支持。初始淋巴管（也称为淋巴毛细管）由于其不连续的细胞间连接而具有高度通透性，这有助于从周围细胞外空间有效收集液体、细胞及其他物质1。初始淋巴管汇合成集合淋巴管，后者具有紧密的细胞间连接、连续的基底膜以及淋巴管平滑肌覆盖。集合淋巴管负责将收集的淋巴液输送至引流淋巴结，并最终将其返回循环系统2,3。将淋巴液推进至引流淋巴结的集合淋巴管称为传入淋巴管4,5,6,7。阻断传入淋巴管可阻止淋巴液流入淋巴结，这一技术在研究淋巴流动功能时具有重要应用价值。
既往研究表明，淋巴液流动在抗原和抗原提呈细胞（APC）的运输以及维持淋巴结（LN）稳态中发挥着重要作用。目前公认，来源于组织的抗原提呈细胞（通常为活化的迁移性树突状细胞（DCs））通过输入性淋巴管迁移至淋巴结，以激活T细胞8。过去十年中，游离形式的抗原（如微生物或可溶性抗原）随淋巴液被动运输至淋巴结，进而激活淋巴结内驻留的抗原提呈细胞这一观点已逐渐被接受9,10,11,12。游离抗原随淋巴液迁移至淋巴结仅需数分钟即可完成，淋巴结内驻留细胞的激活可能在刺激后20分钟内发生，这远快于迁移性树突状细胞的激活过程——后者需要超过8小时才能进入引流淋巴结9。除了运输抗原以启动免疫保护外，淋巴液还携带细胞因子和树突状细胞至淋巴结，以维持其微环境并支持免疫细胞的稳态13,14。此前通过结扎输入性淋巴管以阻断淋巴液流动的研究表明，淋巴液对于维持高内皮微静脉（HEV）表型至关重要，而该表型是支持T细胞和B细胞稳态性归巢至淋巴结所必需的15,16,17。CCL21是一种关键的趋化因子，可引导树突状细胞和T细胞在淋巴结内的定位8,18。阻断淋巴液流动会中断淋巴结内CCL21的表达，从而可能干扰树突状细胞和T细胞在淋巴结内的定位和/或相互作用19。因此，阻断淋巴液流动可通过破坏调控淋巴结内免疫应答的微环境，直接或间接地阻止抗原/树突状细胞进入引流淋巴结。为了更深入地研究淋巴液流动的功能，本文提出了一种实验方案（图1），通过结扎小鼠足垫至近端淋巴结（pLN）的输入性淋巴管来阻断淋巴液流动。该方法可成为未来研究健康与疾病状态下淋巴系统功能的重要技术手段。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均需获得机构和政府伦理及动物管理委员会的批准。 本实验为非存活手术。
1. 材料准备
- 通过将 70 mL 的 100% 乙醇与 30 mL 无菌水混合，配制 100 mL 的 70% 乙醇。手术前对所有手术器械进行高压灭菌，并在手术前和手术过程中将器械保存在 70% 乙醇中以维持无菌状态。
- 准备注射装置。
- 剪取约 30 cm 长的聚乙烯管（直径 0.28 mm）。将一支 30 G × ½ 针头（针头 A）的尖端连接到聚乙烯管的一端。小心地折断另一支 30 G × ½ 针头（针头 B），并将折断的一端连接到聚乙烯管的另一端。
- 将针头 A 连接到 1 mL 结核菌素注射器上。
注：对于该聚乙烯管，管内 1.6 cm 长的液柱相当于 1 μL20。
- 用生理盐水（含抑菌剂的 0.9% [w/v] 氯化钠溶液）配制 10:1 的氯胺酮/赛拉嗪混合液（10 mg/mL 氯胺酮和 1 mg/mL 赛拉嗪）。使用前新鲜配制该溶液。
2. 手术动物的准备
注意：使用 6−10 周龄的小鼠。雌性和雄性小鼠均可使用。本研究中使用了 6−10 周龄的 C57BL/6 雌性小鼠。该方法可适用于其他品系的小鼠。
- 通过腹腔注射250 μL的氯胺酮/赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。等待小鼠完全入睡，通过脚趾夹捏测试确认小鼠无反应，以确保达到充分麻醉状态。
- 使用毛发推剪剃除腿部周围的毛发。
- 在腿部周围涂抹脱毛膏，静置5分钟。用湿润的纸巾擦去残留的毛发和脱毛膏，并用无菌水清洁腿部。在腿部周围喷洒70%乙醇以消毒手术区域，乙醇仅限用于切口部位。
3. 传入淋巴管的外科缝合
注意：右后肢进行淋巴管缝合，左后肢作为假手术对照。淋巴管缝合操作步骤（3.1−3.8）耗时20−30分钟。
- 将小鼠保持俯卧位，并用手术胶带固定，以暴露右后肢的手术区域。
- 在足垫皮内注射 5 µL 1% 伊文思蓝染料，或注射装置导管中的 9 cm 液柱。轻轻按摩足垫，以促进伊文思蓝进入淋巴管。
注意：胰岛素注射器难以精确控制小体积注射，使用注射装置可更准确地控制注射体积。皮肤下的淋巴管可通过蓝色染料显影。经过大量训练后，可在解剖显微镜下肉眼观察到两条传入淋巴管，其为脂肪组织中与隐静脉平行的透明管状结构。经过充分训练后，在担心染料可能造成干扰的情况下，也可不使用伊文思蓝染料而直接进行血管缝合。 - 在解剖显微镜下，选择腘窝下缘上方 5 mm 处作为切口位置。用剪刀在皮肤上做一个约 5 mm 的小切口。使用精细手术镊子撑开切口，暴露集合淋巴管（图 1A）。
注意：如有必要，可切除一小片皮肤以充分暴露淋巴管。 - 在解剖显微镜下辨认通向腘淋巴结（pLN）的两条传入淋巴管（图 1B）。
注意：从足垫至腘淋巴结有两条传入淋巴管，必须将两者均缝合，以完全阻断淋巴液流动。 - 使用持针器，小心地将缝合针（0.7 公制或更小）插入传入淋巴管与隐静脉之间的间隙，并轻柔地将针从传入淋巴管周围引出。轻轻拉紧缝线，留出约 2 cm 的线尾。使用持针器辅助，以外科结方式紧密打结，完成一条淋巴管的缝合（图 1C）。
注意：切口下方的组织在长时间暴露于空气中后可能干燥。应尽量缩小切口并快速完成缝合（即在 5 分钟内），以防止组织干燥。可用棉签滴加少量生理盐水以维持组织湿润。 - 轻轻按摩足垫，确认伊文思蓝染料未通过缝合部位，然后用剪刀剪除多余的缝线。
- 对另一条传入淋巴管执行相同的缝合步骤（即步骤 3.5 和 3.6）（图 1D）。使用步骤 3.5 中缝合血管所用的同一缝线关闭皮肤切口（图 1E）。
- 对于假手术对照组，在左侧足垫皮内注射 5 µL 1% 伊文思蓝染料，并按摩足垫以显影淋巴管。切开皮肤后立即缝合伤口，但不缝扎淋巴管（图 1F）。
- 可选择性地对术后小鼠进行 2−4 小时的监测。缝合侧肢体应出现水肿，且伊文思蓝扩散至大腿部位，而对照侧肢体的伊文思蓝染料应局限于足垫内。 若小鼠 苏醒，需追加注射氯胺酮/赛拉嗪 混合物，以维持麻醉状态直至实施安乐死。
4. 淋巴流的追踪
- 手术后立即在对照组和淋巴管结扎侧后肢的足垫皮内注射 10 µL 的 2% 异硫氰酸荧光素（FITC）。
- 当小鼠完全麻醉后，使用 400 μL 的氯胺酮/赛拉嗪混合液实施安乐死，并进行颈椎脱位。
- 在注射 FITC 后 2、6 和 12 小时，从小鼠腘窝处收集腘淋巴结（pLNs），并在解剖显微镜下仔细去除淋巴结周围的包膜脂肪组织。
- 将 pLNs 包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，确保其髓质窦区域朝向冷冻模具的一侧（图 1G,H）。
- 使用冷冻切片机制备 20 µm 的冷冻切片。
- 在共聚焦显微镜下观察冷冻切片，以确定 FITC 的分布情况。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
淋巴管缝合技术已在先前的研究中被使用15,16,17,19，当时该技术作为研究淋巴流动功能的重要工具，早于对淋巴管分子生物学的深入理解。阻断淋巴流动会破坏淋巴结（LN）的稳态，导致高内皮微静脉（HEVs）丧失维持淋巴细胞向淋巴结归巢所需的关键基因表达15,16,17。此后，又经过了二十年的研究才证明，随淋巴液迁移的树突状细胞（DCs）在维持HEV基因表达谱以及淋巴细胞向淋巴结归巢过程中起着关键作用13。淋巴流动所提供的剪切应力对于刺激淋巴结内趋化因子的表达至关重要。阻断淋巴流动会抑制淋巴结内趋化因子CCL21的表达1...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
阻断淋巴流动在调控抗原向淋巴结递送方面具有广泛的应用前景，可用于健康和疾病状态下的研究。利用该方法可控制抗原递送的时间，从而研究持续的淋巴流动如何调节引流淋巴结中的免疫应答。这种淋巴流动中断的方法还可用于研究淋巴液对淋巴结内细胞区室化、细胞活化、细胞迁移以及细胞间相互作用的影响。
已培育出在淋巴管内皮细胞中特异性表达人类白喉毒素受体（DTR）的小鼠（Flt4-cre-dtr）；这些小鼠可用于特异性清除淋巴管，以研究淋巴系统功能22。给予白喉毒素（DT）可杀死淋巴管壁及淋巴结（LN）中的淋巴管内皮细胞。通过清除淋巴管内皮细胞，可局部或全身性完全阻断淋巴液流动，从而研究淋巴功能。该方法会导致组织中出现显著的液体积聚，是研究淋巴水肿和淋巴功能的理想模型。
与淋巴管内皮细胞特异性表达DTR的模型相比，淋巴管缝合法的优势在于其可在对局部淋巴管内皮细胞及周围其他淋巴管造成最小损伤的情况下阻断淋巴液流动。该干预措施不会直接影响引流淋巴结（LN）中的细胞，因此对LN微环境或免疫...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 Ava Zardynezhad 对手稿的校对。本研究得到加拿大卫生研究院（CIHR, PJT-156035）、加拿大创新基金会（SL, 32930）以及国家自然科学基金（林玉佳，81901576）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>0.9% 氯化钠生理盐水 | 巴克斯特 | JB1323 | |
| <强>100% 乙醇 | Greenfield Global | 卡尔加里大学分发服务 UN1170 | |
| <强>脱毛膏 | Nair | Nair 敏感配方脱毛霜è甜杏仁油和婴儿油，200 毫升。或类似产品。 | |
| <强>伊文思蓝染料 | Sigma生命科学 | E2129-10G | 对于1 ml伊文思蓝染料，将0.1 g伊文思蓝加入10 ml PBS中。伊文思蓝溶液需经0.22 mm滤器过滤，并以1 ml分装保存，保持无菌。 |
| <强>异硫氰酸荧光素异构体 I（FITC） | Sigma生命科学 | F7250-1G | |
| <强>Dumont #3 镊子 | WPI | 500337 | |
| <强>Dumont #5 镊子 | WPI | 500233 | |
| <强>注射装置 | 将聚乙烯管的一端连接至30G × ½ 针头。将1 ml TB 注射器连接到针头上。从另一支30G针头的针管上取下针头 × ½ 针头。将30G钝端插入 × ½ 将针管插入管路的另一端。该管路的内径为0.28 mm，因此管路中1.6 cm长的液柱体积为1 μl. | ||
| <强>胰岛素注射器 | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| <强>IRIS 直头镊 | WPI | 15914 | |
| <强>IRIS 剪刀 | WPI | 14218-G | |
| <强>氯胺酮 | Narketan | DIN 02374994 | 氯胺酮和赛拉嗪的供应商通常受到机构和政府的监管。 |
| <强>针头（26G×3/8） | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| <强>针头（30G×1/2） | 贝克顿·迪金森公司（BD） | 305106 | |
| <强>帕顿持针器 | ROBOZ | RS6403 | 直型，无锁；带锯齿 |
| <强>磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma生命科学 | P4417-100TAB | |
| <强>聚乙烯管 | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| <强>外科胶带（1.25 cm × 9.1 m） | Transpore | 1527-0 | |
| <强>手术胶带（2.5 cm × 9.1 m） | Transpore | 1527-1 | |
| <强>缝合 | Davis 和 Geck CYANAMID 加拿大公司 | 11/04 | 0.7 号单丝聚丙烯缝线 |
| <强>1 ml 注射器 | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| <强>VANNAS 剪刀 | 世界精密仪器公司（WPI） | 14122-G | |
| <强>赛拉嗪 | Rompun | DIN02169606 | 氯胺酮和赛拉嗪的供应商通常受到机构和政府的监管。 |
| <强>仪器设备 | |||
| <强>解剖显微镜 | Olympus | 奥林巴斯 S261 (522-STS OH141791)，光源：奥林巴斯 Highlight 3100 | |
| <强>共聚焦显微镜 | Leica | SP8 |
参考文献
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
