通过在小鼠中吸液性淋巴血管阻止淋巴流

淋巴系统的空间组织提供结构和功能支持，以有效地去除细胞外液体，将抗原和抗原呈现细胞（APC）运送到排出的LNs。最初的淋巴血管（也称为淋巴毛细血管）由于其不连续的细胞间结，便于从周围的细胞外空间1有效地收集液体、细胞和其他材料， 因此具有高度渗透^性。最初的淋巴血管合并成收集淋巴血管，这些血管有紧密的细胞间结，连续的地下室膜和淋巴肌肉覆盖。收集淋巴血管负责运输收集的淋巴到排水的LNs，并最终返回淋巴循环^2，3。将淋巴推进到排水的LN的收集淋巴血管是发性淋巴血管^{4，5，6，7。}淋巴血管的阻塞可以阻止淋巴流进入LNs，这是研究淋巴流动功能时有用的技术。

先前的研究表明，淋巴流动在运输抗原和药水，以及维持LN平衡方面起着重要作用。众所周知，组织衍生的APCs，通常激活的迁移树突状细胞（DCs），通过发源淋巴血管前往LN激活T细胞⁸。自由形式的抗原，如微生物或可溶性抗原，被动地与淋巴流动到LN激活LN居民APC的想法在过去十年中得到了接受^{9，10，11，12。}与淋巴一起携带的自由形式抗原在感染后需要几分钟时间才能到达 LN，LN-驻留细胞活化可能在刺激后 20 分钟内发生。这比迁移 DC 的激活要快得多，迁移 DC 进入排空 LN 9 需要 8^小时多。除了运输抗原以启动免疫保护外，淋巴还携带细胞因子和DC到LN，以维持其微环境，并支持免疫细胞平衡^13，14。此前，通过阻断淋巴血管来阻断淋巴流动表明，淋巴需要维持支持恒流T细胞所需的HV表型，B细胞向LN^{15、16、17定位}。CCL21是一种关键的化学素，它指导直流和T细胞在LN^{8，18中的定位}。阻塞淋巴流会中断 LN 中的 CCL21 表达，并可能中断 LN¹⁹中的直流和 T 细胞定位和/或相互作用。因此，阻断淋巴流动可以通过破坏调节 LN 免疫反应的 LN 微环境，直接或间接地消除抗原/直流对排干 LN 的访问。为了更好地研究淋巴流动的功能，提出了一个实验方案（图1），通过将支脚的淋巴血管从脚垫到pLN的吸血，来阻止小鼠的淋巴流动。该方法是今后在健康和患病条件下研究淋巴功能的重要技术。

所有动物工作都需要得到机构和政府伦理及动物处理委员会的批准。 这是一个非生存手术。

1. 材料准备

1. 通过将 70 mL 的 100% 乙醇与 30 mL 的无菌水混合，准备 100 mL 的 70% 乙醇。手术前将所有手术工具绝育，并在手术前和手术期间将工具保持为 70% 乙醇，以保持灭菌。
2. 准备注射装置。
   1. 切割 ±30 厘米聚乙烯管（直径 0.28 毫米）。将 30 G x 1/2 针（针 A）的尖端连接到聚乙烯管的一端。小心地将另一根 30 G x 1/2 针（针 B）断开，然后将断裂侧连接到聚乙烯管的另一端。
   2. 将针头 A 连接到 1 mL 结核素注射器。
      注:对于这种聚乙烯管，1.6厘米的流体在管内对应于1μL²⁰。
3. 在盐水中准备 10:1 氯胺酮/锡胺混合物（10 毫克/mL 氯胺酮和 1 mg/mL xyl xyl 汀）中（细菌静态 0.9% [w/v] 氯化钠）。使用前请重新准备溶液。

2. 动物手术准备

注:使用6~10周的小鼠。雌性小鼠和雄性小鼠均可以使用。在这项研究中，使用了6~10周大的C57BL/6只雌性小鼠。这种方法可以适用于其他小鼠菌株。

1. 通过注射250μL的氯胺酮/西拉辛混合物，麻醉小鼠。等到鼠标完全入睡。确保鼠标不会对手趾捏做出反应，以检测完全麻醉。
2. 用剪发器在腿上剃毛皮。
3. 在腿部周围涂抹脱毛霜，等待5分钟。用湿润的纸巾擦去残留的毛皮和脱毛霜，用无菌水清洁腿部。在腿部周围喷洒 70% 乙醇，对操作区域进行消毒。乙醇被限制在切口部位。

3. 手术性淋巴血管

注:右腿被缝合，左腿用作假控件。淋巴缝合方案（步骤3.1~3.8）需要20~30分钟。

1. 将鼠标保持在易发位置，用手术胶带将其固定，以露出右腿的手术区域。
2. 在贸易中将 5 μL 的 1% Evans 蓝色染料或 9 厘米的注射装置的液体管插入脚垫。轻轻按摩足垫，帮助埃文斯蓝进入淋巴血管。
   注:胰岛素注射器不容易控制小体积注射。使用注射装置可以更准确地控制音量。淋巴血管在皮肤下被蓝色染料可视化。通过广泛的训练，两个发源淋巴血管都可以看到肉眼作为透明血管在脂肪组织中，平行于Saphenous动脉。通过广泛的培训，可以缝合容器，而无需注射埃文斯蓝染料的情况下，有潜在的干扰从染料。
3. 在解剖显微镜下，从波莱特叶的下边缘选择一个切口位点 5 mm。用剪刀在皮肤上做一个小切口（±5毫米）。使用精细的操作钳，拉伸切口，并暴露收集的淋巴血管（图1A）。
   注:如有必要，可以去除一个小皮肤碎片，以暴露淋巴血管。
4. 在解剖显微镜下识别导致pLAN的两个发性淋巴血管（图1B）。
   注:从脚垫到 pLN 有两个发性淋巴血管。两者都需要被缝合，以完全阻止淋巴流动。
5. 使用针架，小心地将缝合针（0.7公制或更小）插入到支点淋巴血管和Saphenous动脉之间，然后轻轻地将针头拉到支用淋巴血管周围。轻轻拉缝合线，留下约2厘米的缝合线。使用针架帮助将绳子紧紧系住，用外科医生的结缝合一个淋巴血管（图1C）。
   注:切口下面的组织可能会干燥，长时间暴露在空气中。使切口尽可能小，并快速执行缝合（即，在5分钟内）将防止组织干燥。用棉签涂抹少量盐水，以保持组织水分。
6. 轻轻按摩脚垫，以确保没有埃文斯蓝染料通过缝合现场，然后用剪刀切割多余的字符串。
7. 在其他一个发淋巴容器上执行相同的缝合步骤（即步骤3.5和3.6）（图1D）。用步骤 3.5 中用于缝合血管的相同缝合切口关闭皮肤切口 （图 1E）.
8. 对于假控制，在左脚垫上注射5μL的1%埃文斯蓝色染料，并按摩脚垫以可视化淋巴血管。用切除打开皮肤，然后闭合伤口而不使血管破裂（图1F）。
9. 可选地，监测手术小鼠2~4小时。腿的缝合侧应该显示水肿与埃文斯蓝蔓延到大腿， 而控制腿将显示限制埃文斯蓝色染料在脚垫。如果小鼠醒来，将注射额外的氯胺酮/锡胺混合物，以保持麻醉，直到安乐死。

4. 淋巴流的跟踪

1. 手术后，在控制部位和淋巴缝合腿的足垫中立即注射10微升2%氟辛同位素（FITC）。
2. 用400μL的氯胺酮/西拉辛混合物对小鼠进行安乐死，当小鼠完全麻醉时，进行宫颈脱位。
3. 从流行果细胞中收集pLAN，并在 FITC 注射后 2、6 和 12 小时在解剖显微镜下小心地去除 pLAN 周围的佩里诺达尔脂肪组织。
4. 在最佳切割温度 （OCT） 化合物中，将 pLUN 与面向低温的金丝窦区域嵌入（图 1G，H）。
5. 使用低温表示，准备 20 μm 冷冻部分。
6. 在共声显微镜下成像低温，以确定 FITC 分布。

淋巴细胞缝合在以前的研究中已经使用15，16，17，19，作为一个重要的工具，研究淋巴流的功能之前，淋巴细胞的分子生物学被更好地理解。阻塞淋巴流中断LN平衡，这导致 HEV 失去最佳淋巴细胞宿主到 LN15、16、 17所需的关键基因表达。从那时起，又花了20年的时间证明，携带淋巴旅行的DC对于维持 HEV 基因表达特征和淋巴细胞与 LN13 的定位至关重要。淋巴流提供的剪切应力对刺激 LN 中的化疗表达至关重要。阻塞淋巴流会中断LN19中的化疗CCL21表达，这对于引导直流和T细胞在LN中的定位至关重要。因此，中断的流量可能会损害DC和T单元在LN8、18中的定位。

手术后，一个小分子量荧光示踪剂，FITC，被用来跟踪淋巴流动。FITC（10 μL的2%FITC）被注射在假对照和淋巴缝合腿的脚垫中。排水 pLNs 在 2、6 和 12 小时后收集。排放的 pLN 嵌入在 OCT 中，并准备了 20 μm 冷冻部分。共和图像显示缝合后PLAN中的 FITC 积累大大减少。pLNS 中的残留 FITC 优先积聚在 LN 鼻窦中（图 2）。

使用淋巴缝合线对淋巴如何流过 LN 周围的脂肪组织进行了调查。导致pLAN的淋巴血管被缝合以阻止淋巴流动，并被确定为，当淋巴血管被阻断时，周生脂肪组织可以支持少量的淋巴流动。淋巴流经脂肪组织到LN胶囊被映射;它似乎喂入 Ln 鼻窦。随着时间的推移，少量的淋巴可能流入LN鼻窦（图3）。

图1:波莱特LN（pLN）的淋巴细胞缝合的步骤。简言之，在老鼠用氯胺酮和西拉辛混合物麻醉后，它们的腿被剃光，残留的皮毛被脱毛霜去除。右腿用于缝合，左腿是假控制。脚垫的右侧被非贸易注入 5 μL 的 1% 埃文斯蓝色染料在 PBS 中制备。（A） 通过轻轻按摩脚垫，埃文斯蓝染料填充了发淋巴血管。（B） 在远离pLN的地方进行一个小的皮肤切割，以暴露淋巴血管，这两个白色箭头表示。（C，D）两个发性淋巴血管都缝合了。（E） 皮肤切除被缝合封。（F） 控制腿接受埃文斯蓝色注射，皮肤切除，缝合关闭，而不缝合淋巴血管。（G） 淋巴流量阻塞的成功是由埃文斯蓝色染料表示的，它进入控制腿的pLN，而不是缝合的腿。 （H，I） 收集的pLN嵌入在 OCT 化合物中，其中亚帽鼻窦 （SCS） 和三角窦 （MS） 面对低温的一侧，然后捕捉到液体氮气中的卡。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:在假腿或缝合腿的排水 pLN 中，FITC 分布。FITC 注射后收集的 pLAN 的共合图像显示，缝合后 PLAN 中的 FITC 积累量大大减少。pLN 中的残留 FITC 优先在 LN 鼻窦中发现。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:FITC分布于周生脂肪组织（PAT），围绕假腿或缝合腿的排水pLAN。PAT 和 LN 的共合图像显示，FITC 进入 PAT 和 LN 鼻窦，但当淋巴血管阻塞时，在整个 LN 中未有效分布。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有利益冲突要披露。