介绍了一种通过手术缝合输入淋巴管以阻断淋巴液流动的实验方案。
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摘要
摘要
淋巴管在维持组织液平衡和通过将抗原、细胞因子及细胞转运至引流淋巴结（LNs）以优化免疫保护方面具有关键作用。在研究淋巴管功能时，中断淋巴液流动是一种重要的方法。从小鼠足垫通向腘窝淋巴结（pLNs）的传入淋巴管被明确定义为淋巴液引流进入pLNs的唯一通路。结扎这些传入淋巴管可选择性地阻断淋巴液向pLNs的流动。该方法可在最大程度减少对引流pLN中的淋巴管内皮细胞、传入淋巴管以及周围其他淋巴管损伤的前提下，实现对淋巴流动的干预。该技术已被用于研究淋巴液如何影响淋巴结中高内皮微静脉（HEV）和趋化因子的表达，以及在缺乏功能性淋巴管的情况下，淋巴液如何流经淋巴结周围脂肪组织。随着人们对淋巴管功能重要性认识的不断加深，该方法将在进一步揭示淋巴管在调控淋巴结微环境和免疫应答中的作用方面具有更广泛的应用前景。
引言
淋巴系统的空间结构为有效清除细胞外液以及将抗原和抗原呈递细胞（APCs）运输至引流淋巴结（LNs）提供了结构和功能支持。初始淋巴管（也称为淋巴毛细管）由于其不连续的细胞间连接而具有高度通透性，这有助于从周围细胞外空间有效收集液体、细胞及其他物质1。初始淋巴管汇合成集合淋巴管，后者具有紧密的细胞间连接、连续的基底膜以及淋巴管平滑肌覆盖。集合淋巴管负责将收集的淋巴液输送至引流淋巴结，并最终将其返回循环系统2,3。将淋巴液推进至引流淋巴结的集合淋巴管称为传入淋巴管4,5,6,7。阻断传入淋巴管可阻止淋巴液流入淋巴结，这一技术在研究淋巴流动功能时具有重要应用价值。
既往研究表明，淋巴液流动在抗原和抗原提呈细胞（APC）的运输以及维持淋巴结（LN）稳态中发挥着重要作用。目前公认，来源于组织的抗原提呈细胞（通常为活化的迁移性树突状细胞（DCs））通过输入性淋巴管迁移至淋巴结，以激活T细胞8。过去十年中，游离形式的抗原（如微生....
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方案
所有动物实验均需获得机构和政府伦理及动物管理委员会的批准。 本实验为非存活手术。
1. 材料准备
- 通过将 70 mL 的 100% 乙醇与 30 mL 无菌水混合，配制 100 mL 的 70% 乙醇。手术前对所有手术器械进行高压灭菌，并在手术前和手术过程中将器械保存在 70% 乙醇中以维持无菌状态。
- 准备注射装置。
- 剪取约 30 cm 长的聚乙烯管（直径 0.28 mm）。将一支 30 G × ½ 针头（针头 A）的尖端连接到聚乙烯管的一端。小心地折断另一支 30 G × ½ 针头（针头 B），并将折断的一端连接到聚乙烯管的另一端。
- 将针头 A 连接到 1 mL 结核菌素注射器上。
注：对于该聚乙烯管，管内 1.6 cm 长的液柱相当于 1 μL20。
- 用生理盐水（含抑菌剂的 0.9% [w/v] 氯化钠溶液）配制 10:1 的氯胺酮/赛拉嗪混合液（10 mg/mL 氯胺酮和 1 mg/mL 赛拉嗪）。使用前新鲜配制该溶液。
2. 手术动物的准备
注意：使用 6−10 周龄的小鼠。雌性和雄性小鼠均可使用。本研究中使用了 6−10 周....
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结果
淋巴管缝合技术已在先前的研究中被使用15,16,17,19，当时该技术作为研究淋巴流动功能的重要工具，早于对淋巴管分子生物学的深入理解。阻断淋巴流动会破坏淋巴结（LN）的稳态，导致高内皮微静脉（HEVs）丧失维持淋巴细胞向淋巴结归巢所需的关键基因表达15,16,17。此后，又经过了二十年的研究才证明，随淋巴液迁移的树突状细胞（DCs）在维持HEV基因表达谱以及淋巴细胞向淋巴结归巢过程中起着关键作用13。淋巴流动所提供的剪切应力对于刺激淋巴结内趋化因子的表达至关重要。阻断淋巴流动会抑制淋巴结内趋化因子CCL21的表达1.......
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讨论
阻断淋巴流动在调控抗原向淋巴结递送方面具有广泛的应用前景，可用于健康和疾病状态下的研究。利用该方法可控制抗原递送的时间，从而研究持续的淋巴流动如何调节引流淋巴结中的免疫应答。这种淋巴流动中断的方法还可用于研究淋巴液对淋巴结内细胞区室化、细胞活化、细胞迁移以及细胞间相互作用的影响。
已培育出在淋巴管内皮细胞中特异性表达人类白喉毒素受体（DTR）的小鼠（Flt4-cre-dtr）；这些小鼠可用于特异性清除淋巴管，以研究淋巴系统功能22。给予白喉毒素（DT）可杀死淋巴管壁及淋巴结（LN）中的淋巴管内皮细胞。通过清除淋巴管内皮细胞，可局部或全身性完全阻断淋巴液流动，从而研究淋巴功能。该方法会导致组织中出现显著的液体积聚，是研究淋巴水肿和淋巴功能的理想模型。
与淋巴管内皮细胞特异性表达DTR的模型相比，淋巴管缝合法的优势在于其可在对局部淋巴管内皮细胞及周围其他淋巴管造成最小损伤的情况下阻断淋巴液流动。该干预措施不会直接影响引流淋巴结（LN）中的细胞，因此对LN微环境或免疫.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 Ava Zardynezhad 对手稿的校对。本研究得到加拿大卫生研究院（CIHR, PJT-156035）、加拿大创新基金会（SL, 32930）以及国家自然科学基金（林玉佳，81901576）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>0.9% 氯化钠生理盐水 | 巴克斯特 | JB1323 | |
| <强>100% 乙醇 | Greenfield Global | 卡尔加里大学分发服务 UN1170 | |
| <强>脱毛膏 | Nair | Nair 敏感配方脱毛霜è甜杏仁油和婴儿油，200 毫升。或类似产品。 | |
| <强>伊文思蓝染料 | Sigma生命科学 | E2129-10G | 对于1 ml伊文思蓝染料，将0.1 g伊文思蓝加入10 ml PBS中。伊文思蓝溶液需经0.22 mm滤器过滤，并以1 ml分装保存，保持无菌。 |
| <强>异硫氰酸荧光素异构体 I（FITC） | Sigma生命科学 | F7250-1G | |
| <强>Dumont #3 镊子 | WPI | 500337 | |
| <强>Dumont #5 镊子 | WPI | 500233 | |
| <强>注射装置 | 将聚乙烯管的一端连接至30G × ½ 针头。将1 ml TB 注射器连接到针头上。从另一支30G针头的针管上取下针头 × ½ 针头。将30G钝端插入 × ½ 将针管插入管路的另一端。该管路的内径为0.28 mm，因此管路中1.6 cm长的液柱体积为1 μl. | ||
| <强>胰岛素注射器 | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| <强>IRIS 直头镊 | WPI | 15914 | |
| <强>IRIS 剪刀 | WPI | 14218-G | |
| <强>氯胺酮 | Narketan | DIN 02374994 | 氯胺酮和赛拉嗪的供应商通常受到机构和政府的监管。 |
| <强>针头（26G×3/8） | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| <强>针头（30G×1/2） | 贝克顿·迪金森公司（BD） | 305106 | |
| <强>帕顿持针器 | ROBOZ | RS6403 | 直型，无锁；带锯齿 |
| <强>磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma生命科学 | P4417-100TAB | |
| <强>聚乙烯管 | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| <强>外科胶带（1.25 cm × 9.1 m） | Transpore | 1527-0 | |
| <强>手术胶带（2.5 cm × 9.1 m） | Transpore | 1527-1 | |
| <强>缝合 | Davis 和 Geck CYANAMID 加拿大公司 | 11/04 | 0.7 号单丝聚丙烯缝线 |
| <强>1 ml 注射器 | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| <强>VANNAS 剪刀 | 世界精密仪器公司（WPI） | 14122-G | |
| <强>赛拉嗪 | Rompun | DIN02169606 | 氯胺酮和赛拉嗪的供应商通常受到机构和政府的监管。 |
| <强>仪器设备 | |||
| <强>解剖显微镜 | Olympus | 奥林巴斯 S261 (522-STS OH141791)，光源：奥林巴斯 Highlight 3100 | |
| <强>共聚焦显微镜 | Leica | SP8 |
参考文献
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70
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重印与许可
