小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

摘要

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。

摘要

小鼠胚胎干细胞（mESCs）的神经分化是阐明神经发生关键机制并可能促进再生医学研究的有力工具。本文建立了一种高效且低成本的小鼠胚胎干细胞体外神经元分化方法。, 采用组合筛选策略。在本方案所定义的条件下，经过2天的拟胚体形成和6天的视黄酸诱导，可实现小鼠胚胎干细胞（mESCs）向神经前体细胞（NPCs）的快速高效分化，表现为形成结构紧密、具有神经突样形态且Nestin阳性的A2lox和129系衍生物。拟胚体的健康状态、视黄酸（RA）处理的时间点以及RA浓度均对分化过程至关重要。在后续由NPCs向神经元的分化过程中，N2B27培养基II（添加Neurobasal培养基）更有利于神经元细胞的长期维持与成熟。该方法效率高、成本低、操作简便，可成为神经生物学与发育生物学研究的有力工具。

引言

胚胎干细胞（ESCs）具有多能性，在特定条件下可分化为神经前体细胞（NPCs），并进一步分化为神经元¹基于ESC的神经发生为模拟神经发生过程提供了最佳平台，因此可作为一种有效的工具 发育生物学研究，并可能助力再生医学^2,3在过去的几十年中，已有多种诱导胚胎神经发生的方法被报道，例如转基因方法⁴，使用小分子⁵，使用三维基质微环境⁶，以及共培养技术⁷然而，这些方案大多受限于特定条件或操作难度较高，因此不适合在大多数实验室中使用。

为了寻找一种操作简便且成本低廉的方法，以实现从小鼠胚胎干细胞（mESCs）高效地进行神经分化，本研究采用了组合筛选策略。如图1所示，将整个胚胎神经发生过程分为两个阶段。第一阶段（Phase I）指mESCs向神经前体细胞（NPCs）分化的过程，第二阶段（Phase II）则涉及NPCs进一步向神经元的后续分化。根据操作简便、成本低、材料易得以及高分化效率的原则，分别在第一阶段筛选了七种方案，在第二阶段筛选了三种方案，这些方案基于传统的贴壁单层培养体系或类胚体形成体系^8,9。通过细胞形态学观察和免疫荧光检测，对两个阶段中各方案的分化效率进行了评估。通过组合各阶段中最高效的方案，我们建立了优化的小鼠胚胎干细胞神经分化方法。

方案

1. 小鼠胚胎干细胞培养

1. 制备0.1%明胶包被的细胞培养皿或培养板。
   1. 向60 mm细胞培养皿中加入2 mL灭菌的0.1%明胶溶液（0.1% w/v，溶于水），轻轻摇晃培养皿以确保表面均匀包被。
   2. 将培养皿放入5% CO₂培养箱中₂ 37 °C 培养箱中孵育 1 小时以完成包被。
   3. 在接种细胞前，移除0.1%明胶溶液。
      注意：去除明胶后，无需干燥或洗涤包被的培养皿。
2. 小鼠胚胎干细胞（A2lox 和 129）培养
   1. 将mESCs（A2lox和129）细胞接种于经0.1%明胶包被的60 mm细胞培养皿中，加入mESC生长培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 培养箱中分别培养。mESC生长培养基由85%的Knock-out DMEM/F12、15% Knock-out血清替代物（KSR）、0.1 mM β-巯基乙醇（2ME）、2 mM GlutaMAX、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、10 nM CHIR-99021（GSK-3抑制剂）和0.33 nM PD0325901（MEK抑制剂）组成。
      注意：β-mercaptoethanol 具有可燃性，且吸入有毒。使用时应远离火源，并佩戴口罩以避免吸入。
   2. 每天更换mESC培养基，以促进A2lox和129细胞的更好生长。
   3. 当细胞达到80%融合度时，移除培养基并向培养皿中加入1 mL 0.1%胰蛋白酶。轻轻晃动30秒，确保胰蛋白酶均匀覆盖所有细胞。
   4. 将细胞静置约1分钟 胰蛋白酶用1 mL移液器吸出并去除胰蛋白酶。
   5. 向培养皿中加入 2 mL mESC 生长培养基，用移液器上下吹打数次，制成单细胞悬液。
   6. 使用血细胞计数板尽可能准确地测定悬浮液中细胞的密度。
   7. 将细胞分为7组，并使用所示的不同方案诱导分化 表1.

2. 从小鼠胚胎干细胞分化为神经前体细胞（第一阶段）

1. 制备0.1%明胶包被的细胞培养板或盖玻片。
   1. 使用前，按照步骤1.1制备0.1%明胶包被的6孔板或盖玻片。
2. 使用方案1进行第一阶段分化（表1)
   1. 接种约 2 × 10⁴ 将mESCs以每孔2 mL基础分化培养基I接种于0.1%明胶包被的6孔板中。在显微镜下检查细胞密度。
   2. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞₂ 孵育6小时以促进贴壁。
   3. 贴壁后，从培养箱中取出细胞，用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。
   4. 加入2 mL基础分化培养基I（表1向每个孔中加入）并将细胞放回培养箱中。
   5. 将细胞培养8天以诱导分化。每2天更换一次基础分化培养基I。
3. 使用方案2进行第一阶段分化（表1)
   1. 加入 1.5 x 10⁶ 将mESCs置于10 mL基础分化培养基I中，在非黏附性细菌培养皿内于37 °C、5% CO₂条件下培养，以诱导胚状体形成₂ 培养箱
   2. 2天后，将细胞聚集体转移至15 mL离心管中，静置沉降。
   3. 移除上清液，加入10 mL新鲜的基础分化培养基I，重悬拟胚体。将其重新接种至新的非黏附性细菌培养皿中，继续分化培养2天。
   4. 在显微镜下观察类胚体的形成情况（图2A).
   5. 按照步骤2.3.2-2.3.3所述收集拟胚体。将约50个拟胚体接种至每孔2 mL基础分化培养基I中，接种于经0.1%明胶包被的6孔板中。
   6. 配制1 mM全反式维甲酸（all-trans RA）储备液（溶于DMSO），分装后避光保存于-80 °C冰箱中。
      注意：RA 不稳定，在制备 RA 原液时应注意避光并减少与空气接触。
   7. 为诱导RA，向每孔中加入2 µL RA储备液，使终浓度为1 µM。
   8. 将培养板放入5% CO₂培养箱中₂ 37 °C 培养箱中继续培养并分化 4 天。
   9. 每2天更换一次全部2 mL基础分化培养基I（含1 µM RA）。
4. 使用方案3的I期分化表1)
   1. 植物 1.5 × 10⁶ 将mESCs置于10 mL基础分化培养基I中，接种于非黏附性细菌培养皿，于37 °C、5% CO₂条件下培养2天以形成拟胚体。₂ 培养箱
   2. 在显微镜下观察拟胚体的形成情况图2B).
   3. 将细胞聚集体转移至15 mL离心管中，静置沉降。
   4. 小心移除上清液，加入10 mL新鲜的基础分化培养基I重悬细胞。
   5. 将约50个类胚体接种至每孔2 mL基础分化培养基I中，接种于经0.1%明胶包被的6孔板中。
   6. 为诱导RA，向每孔中加入2 µL RA储备液，使终浓度为1 µM。
   7. 将培养板放入5% CO₂培养箱中₂ 在37 °C培养箱中继续培养并分化6天。每2天更换一次完全的I型基础分化培养基（含1 µM RA）。
5. 使用方案4的I期分化表1)
   1. 种子接种量约为 2 x 10⁴ 将mESCs以每孔2 mL基础分化培养基I接种至经0.1%明胶包被的6孔板中。将培养板置于5% CO₂培养箱中。₂ 在37 °C培养箱中孵育6小时，以促进细胞贴壁。
   2. 贴壁后，用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 2 mL 基础分化培养基 I，在 5% CO₂₂ 37 °C 培养箱
   3. 为诱导视黄酸（RA），向每孔加入2 µL全反式RA储备液（工作浓度为1 µM），继续诱导分化4天。
   4. 在整个过程中，每2天更换一次全部培养基。
6. 使用方案5的I期分化表1)
   1. 接种约 2 × 10⁴ 将mESCs加入2 mL基础分化培养基I中，每孔接种于0.1%明胶包被的6孔板。将培养板置于5% CO₂培养箱中₂ 在37 °C培养箱中孵育6小时，以促进贴壁。
   2. 用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 2 mL 基础分化培养基 I，在 5% CO₂ 条件下培养 2 天以诱导分化。₂ 37 °C 培养箱
   3. 对于后续的视黄酸（RA）诱导，向每孔中加入2 µL RA储备液，使终浓度为1 µM。将培养板置于5% CO₂培养箱中。₂ 在37 °C培养箱中继续诱导分化6天。
   4. 在整个过程中，每2天更换一次全部培养基。
7. 使用方案6的I期分化表1)
   1. 植物 1.5 × 10⁶ mESCs 接种于10 mL N2B27 培养基 II 的非黏附性细菌培养皿中（表1以促进拟胚体的形成。
   2. 第2天^nd 第天，按照步骤 2.3.2–2.3.3 所述收集细胞聚集体，并用 10 mL 新鲜 N2B27 培养基 II 重悬拟胚体。
   3. 将它们重新接种到新的无黏附性细菌培养皿中，并在5% CO₂条件下继续分化2天。₂ 在37 °C培养箱中孵育。在显微镜下观察类胚体的形成情况。
   4. 第4天^th 第几天，收集拟胚体。将约50个拟胚体每孔接种至经0.1%明胶包被的6孔板中，每孔加入2 mL N2B27培养基II。
   5. 向每个孔中加入 2 µL 全反式 RA 储存液，继续诱导分化 4 天。每两天更换一次全部培养基（含 1 µM RA 的 N2B27 培养基 II）。
8. 使用方案7的I期分化表1)
   1. 接种约 2 × 10⁴ 将mESCs加入2 mL基础分化培养基I中，每孔接种于0.1%明胶包被的6孔板。将培养板置于5% CO₂培养箱中。₂ 在37 °C培养箱中孵育6小时，以促进贴壁。
   2. 用 PBS 洗涤细胞两次。随后，向每孔加入 2 mL N2B27 培养基 II，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 8 天以诱导分化。₂ 培养箱
   3. 每2天更换一次全部N2B27培养基II。

3. 细胞形态观察

1. 每天在倒置相差显微镜下观察上述7组细胞的分化状态。
2. 在第8天随机选取至少12个视野拍照，记录每组细胞的形态学变化。

4. 免疫荧光染色

1. 样品制备：将种子mESCs接种于0.1%明胶包被的盖玻片上，按照步骤2中所述方案进行8天分化培养。
2. 洗涤：第8天^th 第几天，从培养箱中取出样本，吸去分化培养基。用1 mL PBS轻轻冲洗细胞一次，持续5分钟。
3. 固定：向每个样品中加入1 mL 4%多聚甲醛，在室温（RT）下固定细胞20分钟。
4. 洗涤：固定后，用 1 mL PBS 轻柔地洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
5. 透化：向每个样本中加入1 mL含0.2% TritonX-100的PBS溶液，室温孵育8分钟。
6. 洗涤：通透化后，用1 mL PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟。
7. 封闭：向每个样本中加入1 mL含10%胎牛山羊血清的PBS溶液，室温孵育1小时，以阻断非特异性结合。
8. 一抗孵育
   1. 使用含5%正常山羊血清的PBS缓冲液按1:100比例稀释抗Nestin抗体。
   2. 向不同样品中加入500 µL稀释的抗体，于4 °C孵育过夜。
9. 洗涤：移除抗体，用1 mL PBS轻轻洗涤样品，每次8分钟，共洗涤3次。
10. 孵育二抗
    1. 使用含5%正常山羊血清的PBS缓冲液将Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG按1:500比例稀释。
    2. 向不同样品中加入500 µL稀释的抗体，在室温下避光孵育2小时。
       注意：使用荧光二抗后，所有后续步骤均需避光操作，以防止荧光淬灭。
11. 洗涤：移除二抗，用1 mL PBS轻轻洗涤样品，每次8分钟，共洗涤3次。
12. 细胞核染色与封片
    1. 在干净的载玻片上滴加一滴DAPI封片剂。
    2. 小心地将样品从培养板中取出，将细胞面朝下置于DAPI封片剂上。室温下避光放置5分钟。
    3. 用吸水纸吸去多余的 DAPI 封片剂。
13. 荧光显微镜观察
    1. 将样本置于荧光显微镜下，使用适当的滤光片检测 DAPI 和 Alexa Fluor 488 的信号。
    2. 为每个样本均匀且随机地选取10-15个不同的视野，使用CCD相机记录图像。

5. 从神经前体细胞向神经元的分化（第二阶段）

1. 按照步骤 2.4 中详述的方案 3（8 天，表 1）进行 mESC 衍生细胞的 I 期分化，该方案的分化效率最高（见 图 3）。
   注意：I 期分化后，应通过上述的细胞形态学观察和免疫荧光检测进行质量控制，以确保获得健康且高产量的神经前体细胞（NPCs）。
2. 将约 5 × 10⁵ 个 mESC 衍生细胞接种于 2 mL 基础分化培养基 I 中，每孔接种至经 0.1% 明胶包被的 6 孔板中。将 mESC 衍生细胞随机分为 3 组，分别对应 II 期方案 1、方案 2 和方案 3。
3. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 6 小时，使细胞贴壁，随后用 2 mL PBS 洗涤两次。
4. 分别向上述各组的每孔中加入 2 mL 基础分化培养基 I、N2B27 培养基 I 和 N2B27 培养基 II（表 2）。
5. 将培养板放回培养箱中，继续分化 10 天，每 2 天更换相应的培养基。
6. 检查分化状态，并记录如步骤 3 中所述的形态学变化。
7. 在第 18 天，评估神经元（β-Tubulin III 阳性）的生成情况，并利用步骤 4 中的方法确定三种方案的分化效率。

结果

2天类胚体形成+6天视黄酸诱导在指导mESCs向NPCs分化（I期）方面效果最佳。为确定最有利于mESCs向NPCs分化（I期）的最优方案，共在A2lox和129两种mESCs上测试了7种方案（表1），并通过光学显微镜监测各组的分化状态。如图3A所示，在“2天类胚体形成+6天视黄酸诱导”处理（I期方案3）下的大多数A2lox和129细胞衍生物呈现出排列紧密且具有神经突样形态，表明已形成NPCs。然而，接受“4天类胚体形成+4天视黄酸诱导”处理（I期方案2）的细胞则表现出较差的生长状态并出现凋亡现象，这可能是由于类胚体内营养不足所致。单层培养结合视黄酸诱导（I期方案4和5）也可引导mESCs分化，但神经突样细胞的比例不及I期方案3。同时，I期方案6和7中的大多数A2lox和129细胞衍生物细胞体较小，并倾向于发生凋亡，提示N2B27培养基II不能有效支持胚胎神经发生。

为了进一步确认神经前体细胞（NPCs）的形成，采用免疫荧光检测各组中Nestin阳性细胞（NPCs的标志物）所占的百分比。<...

讨论

在本研究中，我们建立了一种简单且高效的从小鼠胚胎干细胞（mESCs）向神经元分化的诱导方法，该方法成本低且所需材料易于获取。该方法中，先进行2天的拟胚体形成，随后进行6天的视黄酸（RA）诱导，可有效促进mESCs向神经前体细胞（NPCs）分化（I阶段-方案3）。在II阶段分化中，N2B27培养基II（II阶段-方案3）对NPCs向神经元的分化诱导效果最佳。为确保实验成功，需特别关注若干关键步骤。

首先，类胚体的健康状态是整个分化过程的关键。三维类胚体的形成通常用于引导胚胎干细胞的分化⁸。在本研究中，我们探讨了类胚体悬浮培养的合适时间。如图2所示，在该条件下悬浮培养2天后，形成了具有明亮核心的圆形类胚体。然而，当培养4天时，许多类胚体相互黏连，且其核心变暗，表明核心细胞发生了凋亡。后续的分化结果进一步证实了延长类胚体形成时间所带来的不良影响。在一些已有报道的研究中，类胚体的悬浮培养时间可长达10天，但所用培养基中胎牛血清（FBS）浓度较低或不含FBS

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗巢蛋白抗体 [大鼠-401]	Abcam	Ab11306	保存于 -80 °C，避免反复冻融
兔源抗β-微管蛋白 III 抗体	Sigma Aldrich	T2200	保存于 -80 °C，避免反复冻融
Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠 IgG	Beyotime	A0428	保存于 -20 °C，并避光
B-27 补充剂（50X），无血清	Gibco	17504044	保存于 -20 °C，并避光
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	保存于 -20 °C
盖玻片	NEST	801007
Cy3 标记山羊抗兔 IgG	Beyotime	A0516	保存于 -20 °C，并避光
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	保存于 4 °C
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	保存于 -20 °C，避免反复冻融
荧光显微镜	Olympus	CKX53
明胶	Gibco	CM0635B	室温保存
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050061	保存于 4 °C
免疫染色一抗稀释缓冲液	Beyotime	P0103	保存于 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	保存于 4 °C
KnockOut 血清替代物	Gibco	10828028	保存于 -20 °C，避免反复冻融
人白血病抑制因子	Sigma	L5283	保存于 -20 °C
含 DAPI 的水性封片剂（Fluoroshield）	Abcam	ab104139	保存于 4 °C，并避光
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140076	保存于 4 °C
N-2 补充剂 (100X)	Gibco	17502048	保存于 -20 °C，并避光
正常山羊血清	Jackson	005-000-121	保存于 -20 °C
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	保存于 4 °C
非粘附性细菌培养皿	Corning	3262
磷酸盐缓冲液 (1X)	HyClone	SH30256.01B	保存于 4 °C
青霉素/链霉素溶液	HyClone	SV30010	保存于 4 °C
PD0325901（Mirdametinib）	Selleck	S1036	保存于 -20 °C
视黄酸	Sigma	R2625	保存于 -80 °C，并避光
129 品系小鼠胚胎干细胞	Cyagen	MUAES-01001	维持于无饲养层培养体系中
干细胞冻存液（无 DMSO）	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	保存于 -20 °C，避免反复冻融
0.25% 胰蛋白酶 (1X) 溶液	HyClone	SH30042.01	保存于 4 °C
吐温 X-100	Sigma	T8787
2-巯基乙醇	Gibco	21985023	保存于 4 °C，并避光
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0098	保存于 -20 °C
6 孔板	Corning	3516
60 mm 细胞培养皿	Corning	430166
15 ml 离心管	NUNC	339650