微区设计及用于15氮分析的植物与土壤样品制备

摘要

本文描述了一种适用于多次生长季内植物和土壤取样事件的¹⁵N示踪研究的微区试验设计。同时提出了用于¹⁵N分析的土壤和植物样品采集与处理步骤，包括研磨和称重操作规程。

摘要

许多 氮肥研究通常评估处理措施对生长季末指标（如籽粒产量或氮素累积损失）的总体效应。要追踪并量化肥料来源氮（FDN）在土壤-作物系统中的去向，必须采用稳定同位素方法。本文旨在描述一种小块田间试验 采用非受限设计 ¹⁵两个生长季内用于多次土壤和植物取样的氮富集微区试验，以及总氮 ¹⁵氮素分析。本方法通过在美国明尼苏达州中南部开展的一项重复种植玉米的研究进行演示（玉米（Zea mays） L.）。每个处理包括六行玉米（行距76 cm），行长15.2 m，一端嵌入一个微型小区（2.4 m × 3.8 m）。施用肥料级尿素，氮素用量为135 kg N∙ha⁻¹。^-1 种植时，微区施用氮-15丰度为5原子百分比的尿素 ¹⁵在生长季节期间多次采集土壤和植物样品，所有操作过程中均使用独立工具，并将未富集与富集样品进行物理分离，以尽量减少交叉污染。土壤和植物样品经干燥后，先研磨至可通过2 mm筛网，再使用滚压研磨机进一步研磨至类似面粉的细度。示踪研究需要额外的规划、更长的样品处理时间与更多的人工投入，并会产生更高的成本 ¹⁵与传统的氮素研究相比，氮富集材料和样品分析能够提供更精确的信息。然而，通过质量平衡方法，结合生长季内多次取样事件的示踪研究，研究人员可估算肥料氮在土壤-作物系统中的分布，并估算系统中未被计入的肥料氮去向。

引言

氮肥（N）的使用对于满足全球不断增长人口对粮食、纤维、饲料和燃料的需求至关重要，但农田中氮素的流失可能对环境质量产生负面影响。由于氮素在土壤-作物系统中会经历多种转化过程，因此有必要更深入地了解氮素循环、作物对氮素的吸收利用以及肥料氮素的总体归趋，以改进管理措施，提高氮素利用效率，并最大限度减少氮素对环境的损失。传统的氮肥研究主要关注处理措施对季末指标的影响，例如作物产量、作物氮素吸收量相对于施氮量的比率（表观肥料利用率）以及土壤中残留的氮素含量。尽管这些研究能够量化整个系统的氮素输入、输出和利用效率，但无法识别或量化来源于肥料或土壤的氮素在土壤-作物系统中的具体去向。必须采用基于稳定同位素的不同方法，来追踪和量化来源于肥料的氮素（FDN）在土壤-作物系统中的归趋。

氮有两种稳定同位素， ¹⁴氮和 ¹⁵N，在自然界中以约272:1的相对恒定比例存在 ¹⁴N/¹⁵N¹ （浓度为 0.366 原子 %） ¹⁵N 或 3600 ppm ¹⁵N^2,3）。添加 ¹⁵氮富集肥料增加总产量 ¹⁵土壤系统中的氮含量。如 ¹⁵氮富集肥料与非富集土壤氮混合后，所测得的变化 ¹⁴N/¹⁵氮素比例使研究人员能够追踪土壤剖面中的固定态氮（FDN）及其向作物中的迁移^3,4. 可通过测量总质量来计算质量平衡 ¹⁵系统及其各部分中的氮示踪剂²。因为 ¹⁵氮富集肥料明显比常规肥料昂贵， ¹⁵氮富集微区通常嵌套于处理样地之内。本文旨在描述一种小样地研究方法 利用微区设计在玉米生长季内进行多次土壤和植株取样Zea mays L.) 及制备植物和土壤样品以测定全量元素的方案 ¹⁵氮素分析。这些结果可用于估算氮肥利用效率，并建立包含原状土壤和作物中固定态氮（FDN）的氮素部分收支平衡。

方案

1. 野外地点描述

注意：进行¹⁵N示踪田间试验时，所选试验地点应尽量减少因土壤、地形和物理特征引起的变异⁵。由于坡度、风力或水流导致的土壤侧向移动，或耕作活动可能引起交叉污染，而土壤氮素的垂直分布可能受到地下水流和暗管排水的影响⁶。

1. 描述实验田间地点，包括以往的管理措施（如前茬作物和耕作方式）、经纬度、土壤物理和化学性质（如土壤质地分析、初始肥力状况、pH值和土壤容重）。
2. 记录试验地点及田块四角的GPS坐标。
3. 描述生长季管理措施，包括病虫害管理（除草剂、杀虫剂或杀菌剂的使用）、土壤养分管理（包括施用量、养分来源、施肥位置和施用时间）、耕作、灌溉事件及灌溉量，以及残茬管理。
4. 由于作物生长和微生物介导的氮素转化受土壤水分、土壤温度和气温的影响，应记录气候信息，包括每日最高和最低气温、每日降水量，以及在多个深度测定的土壤水分和土壤温度，这些深度应与土壤采样深度相对应。

2. 实验设计

1. 种植六行玉米（约86,000株/公顷）^-1在76厘米行距下种植，最终小区尺寸为15.2米×4.6米。
   1. 在纵向长度的两端各设立1.5米的边界区域（0–1.5米，13.7–15.2米），并在取样区和收获区相邻处增设一个1.5米长的额外边界区域（9.8–11.3米）图1).
   2. 将第2行和第3行指定为当季植株和土壤采样区（1.5–9.8 m），将第4行和第5行指定为玉米籽粒产量收获区（1.5–9.8 m）。
   3. 建立一个面积为11.3–13.7 m²的小区，尺寸为2.4 m × 3.8 m，以宽度方向居中。收集所有 ¹⁵该区域的植物和土壤样品经过氮富集处理，长度和宽度方向均保留0.38米未取样边界，以尽量减少边缘效应（图2).
2. 使用不同颜色的标记旗标示处理小区和微区的角点。

3. 土壤和植物样品的注意事项

1. 为未富集和富集材料分别使用专用的设备和处理区域。富集材料对未富集材料（肥料、土壤或植物）的污染，或反之，会显著影响实验结果。
2. 按照预期¹⁵N富集度从低到高的顺序收集和处理¹⁵N富集的土壤和植物样品，以最大限度减少交叉污染。确保在处理每个样品之间彻底清洁工作台面、手套、工具和仪器，以最大限度降低样品残留带来的交叉污染。
3. 尽量减少微区内的人员走动，以防止未富集取样区域受到污染。进入微区时应穿戴防护鞋套，并在离开微区时将其移除。

4. ¹⁵N 标记肥料的制备与施用

1. 根据参考文献2中关于肥料¹⁵N利用效率（F¹⁵NUE）研究的指导原则，将10 atom % ¹⁵N标记的尿素稀释为5 atom % ¹⁵N标记的尿素，并溶于2 L去离子水中，以确保尿素肥料的均匀标记。
   注：所需¹⁵N标记肥料的浓度取决于农学研究的目标。若储备的¹⁵N标记肥料浓度过高，可使用以下公式³将其与常规未标记肥料混合稀释。
   X2 = [(C1/C2) - 1] × X1
   其中，X2为所需添加的常规未标记肥料质量，X1为示踪剂肥料质量，C1为原始示踪剂肥料的同位素浓度[以原子百分比过量表示（实测原子百分比减去自然本底浓度，通常取0.3663 atom %）]，C2为最终混合物的同位素浓度。例如，若使用100 g 10 atom %标记的尿素，要获得最终5 atom %的同位素浓度，则需加入92.7 g常规未标记肥料；
   X2 = {[(10 - 0.3663)/5] - 1} × 100。
2. 分析溶液中的¹⁵N浓度以验证标记效果。作者使用了加州大学戴维斯分校稳定同位素实验室提供的分析服务。
   注：土壤-植物-微生物体系对肥料施用的反应可能受肥料物理形态的影响。根据研究目标，尿素溶液可直接以液态施用，或脱水重结晶。结晶物可用Carver压片机在10,000 psi压力下压制成片，随后粉碎并过筛至所需粒径³。
3. 使用校准过的背负式CO₂喷雾器将¹⁵N标记的尿素溶液均匀施用于微区（图3A）。若使用多个氮素施用量或不同标记水平，建议为每种标记水平指定专用的CO₂喷雾器，或使用同一喷雾器时按从低到高标记浓度的顺序施用，以尽量减少处理间的交叉污染。
4. 在施肥后24小时内，通过轻度耕作、手工耙地或至少0.6 cm的灌溉将含尿素肥料混入土壤，以最大限度降低氨挥发损失的风险。
5. 在第二个生长季期间，不再向微区施用任何额外的¹⁵N标记尿素肥料。向整个试验区施用常规未标记尿素，以避免因氮素差异导致玉米生长产生非均一性响应。

5. 田间样品处理：地上部玉米生物量

1. 在每个采样阶段，从采样区域内采集一份由六株地上部玉米植株组成的混合样品（未富集¹⁵N），并从¹⁵N富集微区中采集另一份由六株地上部玉米植株组成的混合样品。每株采样植株之间应至少间隔两株植株，以避免显著改变植株生长动态。作者在玉米V8期和R1期生理发育阶段¹¹以及生理成熟期采集了植株样品（图2）。
2. 按照步骤3.1和3.2所述原则，将V8期和R1期的地上部生物量切碎（≤5 cm × ≤5 cm）；使用园林碎枝机是可接受的选择。将切碎的生物量放入标记好的布袋或纸袋中，并在60 °C的强制通风烘箱中烘干至恒重。记录生物量干重（图3B）。
3. 将生理成熟的玉米植株分为秸秆（包括叶片、苞叶和茎秆等所有营养组织）、籽粒和穗轴三部分。切碎后置于60 °C强制通风烘箱中烘干至恒重。记录各部分生物量干重。
4. 在微区内，将所有玉米茎秆在土壤表面处切断，捆扎成束，按小区编号标记后移出田间（图3C）。调整微区四角的标志旗，使其几乎与土壤表面齐平，以尽量降低收获或收获后耕作期间被联合收割机移除的风险。
5. 从收获区域收获籽粒，并以15.5%的水分含量报告产量¹²。使用小区联合收割机收获其余试验区域。
6. 将未富集的生物量从微区范围内耙出。将微区的地上部生物量切碎后重新施回原小区（图3D）。
7. 通过耕作将残茬混入土壤表层，注意尽量减少土壤和玉米残茬向微区内部或外部的转移。若因耕作导致微区四角标志旗被移除，应及时更换。
8. 在与第一年玉米相同的行距上种植第二年玉米。
9. 仅在生理成熟期采集第二年玉米的地上部生物量，并按照步骤5.3所述方法处理，如同第一年玉米样品。从微区中心区域（1.52 m × 0.76 m）采集微区样品，以避免耕作后可能发生的信号稀释（图2）。从收获区域收获籽粒，并以15.5%的水分含量报告产量。
10. 依据步骤3.1和3.2的原则，充分混合并研磨100至200 g干燥植物材料，使其通过2 mm筛孔。充分混合研磨后的材料，并将一部分子样品存入标记好的硬币信封中，用于后续处理。
    注：托马斯 Wiley 磨机适用于植物组织研磨，而Perten Laboratory Mill 3610适用于籽粒研磨。
    注意：研磨植物样品的人员应佩戴听力保护装置，并佩戴经美国国家职业安全卫生研究所（NIOSH）认证的N95颗粒物防护口罩，以防吸入粉尘。

6. 野外样品处理：土壤

1. 在种植后第8天采集第一年的土壤样品 ¹⁵氮肥施用时期为V8期、R1期及收获后翻耕前。在第二年种植前和收获后采集土壤样品。由于采样操作上的限制，作者在生长季内采集了0–15 cm、15–30 cm和30–60 cm深度的土壤样品，收获后采集了0–15 cm、15–30 cm、30–60 cm和60–90 cm深度的土壤样品，第二年种植前采集了0–30 cm、30–60 cm和60–120 cm深度的土壤样品。
   注意：若土壤取样器无法将土壤样品采集至目标最大深度作为单个土芯，则应从同一钻孔中采集更深层的土芯，同时弃去上层1厘米的土壤，以避免上层土壤掉落造成的污染。
   1. 使用手钻在V8和R1的未施肥采样区域采集四芯（直径1.8 cm）复合土壤样品。在玉米行内采集一个土芯，在玉米行间采集三个土芯。
   2. 在播种前和收获后，使用液压取样探针从未施肥的采样区域采集两芯（直径5厘米）复合土壤样品。
   3. 在微区试验田采集15个土芯（直径1.8厘米）组成的复合土壤样品，采样时间为处理后第8天 ¹⁵使用手持探针在V8期和R1期施用氮素富集肥料。在玉米行内采集3到4个土芯，在玉米行间采集11到12个土芯。
      注意：土壤具有高度异质性。从富集微区中采集的土芯数量越多，对真实情况的估计越准确 ¹⁵土壤氮的氮富集¹³.
   4. 在播种前和收获后，使用液压取样器从微区试验田采集三芯（直径5 cm）混合土壤样品。
   5. 将每个混合土壤样品在桶中均质化，并放入预先标记好的纸袋中。
2. 将土壤样品置于35 °C的强制通风烘箱中烘干至恒重。将每个样品研磨，使其通过2 mm筛。若能确保在每个样品之间彻底清洁，机械土壤研磨机亦可使用。
   注意：土样可通过将样品平铺在托盘上以薄层进行风干。托盘应置于不受外界氮源污染的区域。未富集样品与富集样品应物理分隔，以防止交叉污染。
   注意：研磨土壤样品的人员应佩戴护耳器，并佩戴经美国国家职业安全卫生研究所（NIOSH）认证的N95颗粒物防护口罩，以防止吸入粉尘。

7. 实验室样品处理：研磨土壤和植物样品

1. 将粉碎的植物样品（2 mm）置于60 °C的烘箱中过夜干燥。
2. 按照步骤3中所述原则，将干燥的植物样品或土壤材料研磨至细腻、类似面粉的质地。可使用滚筒研磨罐磨机，此为一种可行的选择。
   注意：作者所用的研磨罐磨机为自行设计的传送带系统，可同时处理54个滚筒研磨罐。
   1. 将每个滚筒研磨罐（250 mL硼硅酸盐玻璃罐，带螺口盖）装入10至20 g粉碎后的植物或土壤样品以及7根不锈钢棒（长8.5 cm，直径0.7 cm）。
   2. 以0.4 × g的转速滚动研磨罐6–24小时，或直至样品达到细腻、类似面粉的质地。
   3. 将研磨好的细粉转移至洁净并已标记的20 mL闪烁小瓶中。
   4. 每处理完一个样品后，需用肥皂和水清洗滚筒研磨罐、不锈钢棒和盖子，以去除任何残留物。
      1. 将滚筒研磨罐和盖子浸入5% HCl酸浴中（由36–38%浓盐酸配制而成）过夜¹⁴。
         警告：盐酸具有腐蚀性，可导致严重皮肤灼伤、眼睛损伤，吸入后有害。操作时务必穿戴防护服、手套及眼部和面部防护装备。若接触皮肤或眼睛，应立即用大量清水彻底冲洗。运输酸液时必须使用次级容器。配制时务必始终将酸缓慢加入水中，因该反应为放热反应。酸液泄漏时应立即用碳酸氢钠中和。
         注意：可配制大体积酸浴，例如在208 L塑料容器中配制100 L的5% HCl溶液。应在通风橱内分多次配制较小体积的溶液，再转移至塑料容器中。每三个月更换一次酸浴溶液。
      2. 用去离子水对滚筒研磨罐和盖子进行三次冲洗，并自然风干。
      3. 将不锈钢棒浸入0.05 M NaOH溶液中过夜¹⁴（通过将2 g NaOH溶于1 L去离子水中配制）。每天需配制新的0.05 M NaOH溶液。
         警告：氢氧化钠可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。操作时务必穿戴防护服和眼部防护装备。一旦衣物被污染，应立即脱去，并用大量清水冲洗皮肤或眼睛数分钟。
      4. 用流动的热水冲洗不锈钢棒5分钟。倾去废水后，再用去离子水冲洗三次。将不锈钢棒置于铺有纸巾的托盘上自然风干。

8. 称量研磨后的植物和土壤样品，用于总氮和¹⁵N分析

1. 分析若干具有代表性的植物和土壤样品的全氮含量（例如，燃烧法分析¹⁵）。根据分析仪的技术要求，计算可提供足够氮含量用于¹⁵N分析的样品质量。
   注意：作者使用了加州大学戴维斯分校稳定同位素设施提供的分析服务。富集样品的称样量优化为含20 µg氮，最大不超过100 µg氮。
2. 将样品按预期¹⁵N丰度从低到高排序。在每次运行中，每隔第八至第十二个样品设置一个重复样，以检查样品的精密度。每次运行至少包含一个检核样品¹⁶。
3. 标记一个洁净的96孔板及其配套盖子，并安装单个孔的防蒸发环。将一张洁净的索引卡裁剪至略小于盖子内径的尺寸，放入盖内，以防止运输过程中样品在孔间移动。
4. 佩戴腈手套，使用实验室擦拭纸和乙醇清洁微量天平、工作台面、刮勺和镊子。将清洁后的工具放置在实验台上的吸水纸上。
   注意：未富集和已富集的样品应使用独立的天平和工具处理，以避免交叉污染。
5. 用镊子将一个预先成型的5 mm × 9 mm锡胶囊置于洁净的工作表面上，例如带有5 mm × 8 mm凹槽的不锈钢块上。轻轻敲击胶囊使其落入凹槽，必要时重塑其圆柱形状并压平底部。
   注意：由于样品质量极小，样品污染风险较高。切勿用手套接触胶囊。若胶囊接触到除镊子、洁净工作面、天平称盘或96孔板以外的任何表面，应立即丢弃。
6. 用镊子轻轻将胶囊顶部约1 mm部分向外翻展，以便后续操作。为避免在去皮时损坏天平，将胶囊悬停于微量天平称盘上方1至2 mm处再释放。对胶囊去皮归零。用镊子将胶囊放回洁净的工作表面。
7. 使用刮勺小心地将所需质量的细磨样品加入胶囊中。避免将样品洒落在胶囊外表面或工作台上。
8. 用镊子缓慢压紧胶囊上部三分之一处，并折叠封口。继续用镊子将胶囊折叠并压成球形，注意不要刺穿或撕裂锡箔。
   注意：氮含量较低的样品可能需要超过5×9 mm胶囊容量的样品量。此时可使用更大的胶囊（例如9 mm × 10 mm）。
9. 用镊子将封装好的胶囊从1 cm高度多次轻摔在洁净的深色表面或镜面上，检查是否泄漏。若无粉尘出现，使用与步骤8.6所述相同的方法称量样品质量。记录样品重量。将胶囊放入96孔板中，并记录其所在孔位。
   1. 若在深色表面上出现粉尘，记录样品重量。将样品用第二个锡胶囊重新包裹，再次检查是否泄漏，并放入洁净的96孔板中。
      注意：若包裹后的胶囊过大无法放入96孔板，可使用24孔板或48孔板。
10. 在处理不同样品之间，使用乙醇和实验室擦拭纸清洁所有工具和表面，特别注意刮勺和镊子的边缘部分。
11. 用胶带将96孔板盖子固定，并将板子存放在干燥器中。

9. 计算

1. 使用以下公式计算植物或土壤样品中所含的氮质量（kg∙ha^-1）。
   
   
2. 计算植物和土壤样品的肥料氮比例（N_f）、肥料来源氮（FDN）和土壤来源氮（SDN）¹⁷。
   
   其中 A 为原子百分比 ¹⁵N富集度。
3. 
   
4. 计算肥料¹⁵N利用效率¹⁷。
   

结果

本文所展示的结果来自2015年在位于明尼苏达州威塞卡附近的明尼苏达大学南部推广与研究中心建立的野外试验点。该试验点在2015年之前采用玉米-大豆［Glycine max (L.) Merr］轮作制度，而在2015年和2016年生长季则改为连续玉米轮作。土壤类型为尼科尔特黏壤土（细质-混合型-强活性-中性湿润始雏土）与韦伯斯特黏壤土（细质-混合型-强活性-中性典型内质湿润始雏土）的复合体。除氮素（N¹⁸）外，土壤养分管理均按照大学推荐方案进行。多种氮肥处理采用随机完全区组设计，设置四个重复，但本文仅展示种植时施用尿素、氮素施用量为135 kg N∙ha^-1的处理结果。土壤容重通过原状土芯法测定¹⁹，在每个重复中，于0–15、15–30、30–60、60–90以及60–120 cm深度层次的中心位置采集两个5 cm深的样品进行测定。各深度层次的土壤容重在重复间取平均值，并假设在整个试验田中保持恒定。样地设置以及植株和土壤样品的采集与处理方法详...

讨论

稳定同位素研究是追踪和量化土壤-作物系统中固定氮（FDN）的有效工具。然而，氮示踪研究涉及三个主要假设，若这些假设被违背，则可能使采用该方法所得出的结论无效。这些假设是：1）示踪剂在整个系统中均匀分布；2）所研究过程的发生速率保持一致；3）从¹⁵N富集池中离开的氮不会重新返回³。由于本研究关注的是总固定氮在整个土壤-作物系统中的分布情况，因此假设2和假设3的影响极小²¹。

由于¹⁵N标记物质成本较高，通常会限制¹⁵N示踪研究的规模。因此，在开展氮素示踪研究之前，研究人员应仔细规划研究目标，需考虑以下因素：取样次数、研究持续时间（数天至数年）、氮肥施用量，以及在施用¹⁵N标记肥料后，由于与大量土壤氮的混合稀释，仍能从自然丰度（0.366 原子%）中检测出差异所需的¹⁵N富集浓度²。参考文献2中已报道了不同类型农学研究中常用的^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20 mL 闪烁瓶	ANY；Fisher Scientific 为一个示例	0334172C
250 mL 硼硅酸盐玻璃瓶	QORPAK	264047
48 孔板	EA Consumables	E2063
96 孔板	EA Consumables	E2079
布质零件袋（30×50 cm）	ANY	NA	用于玉米穗
CO2 背负式喷雾器	ANY；Bellspray Inc 为一个示例	Model T
硬币信封（6.4×10.8 cm）	ANY；ULINE 为一个示例	S-6285	用于 2 mm 研磨植物样品
玉米切碎机	ANY；DR Chipper Shredder 为一个示例	SKU:CS23030BMN0	用于切碎玉米生物量
玉米种子	ANY	NA	适合该地区的杂交品种
一次性鞋套	ANY；Boardwalk 为一个示例	BWK00031L
200 试验证乙醇	ANY；Decon Laboratories Inc. 为一个示例	2701TP
带抽绳的织物袋（90×60 cm）	ANY	NA	用于植物样品采集
尿素肥料（46-0-0）	ANY	NA	~0.366 原子% 15N
手耙	ANY；Fastenal Company 为一个示例	5098-63-107
手用镰刀	ANY；Home Depot 为一个示例	NJP150	用于植物样品采集
手持式土壤取样探针	ANY；AMS 为一个示例	401.01
液压土壤取样探针	ANY；Giddings 为一个示例	GSPS
盐酸，12N	Ricca Chemical	R37800001A
研磨罐磨机	ANY；Cole-Parmer 为一个示例	SI-04172-50
实验室磨粉机	Perten	3610	用于研磨谷物
精确至四位小数的微量天平	ANY；Mettler Toledo 为一个示例	XPR2
N95 颗粒物过滤式面罩呼吸器	ANY；ULINE 为一个示例	S-9632
氯丁橡胶或丁基橡胶手套	ANY	NA	用于盐酸浴操作
纸质五金袋（13.3×8.7×27.8 cm）	ANY；ULINE 为一个示例	S-8530	用于土壤样品和玉米籽粒
植物研磨机	ANY；Thomas Wiley Model 4 Mill 为一个示例	1188Y47-TS	用于将切碎的玉米生物量研磨至 2 mm 颗粒
塑料标签	ULINE	S-5544Y-PW	用于标记织物袋和微区茎秆捆
氢氧化钠颗粒，ACS 级	Spectrum Chemical	SPCM-S1295-07
土壤研磨机	ANY；AGVISE 不锈钢研磨机带电机为一个示例	NA	用于将土壤研磨并通过 2 mm 筛网
锡胶囊 5×9 mm	Costech Analytical Technologies Inc.	041061
锡胶囊 9×10 mm	Costech Analytical Technologies Inc.	041073
尿素（46-0-0）	MilliporeSigma	490970	10 原子% 15N