微区设计及用于15氮分析的植物与土壤样品制备

摘要

本文描述了一种适用于多次生长季内植物和土壤取样事件的¹⁵N示踪研究的微区试验设计。同时提出了用于¹⁵N分析的土壤和植物样品采集与处理步骤，包括研磨和称重操作规程。

摘要

许多 氮肥研究通常评估处理措施对生长季末指标（如籽粒产量或氮素累积损失）的总体效应。要追踪并量化肥料来源氮（FDN）在土壤-作物系统中的去向，必须采用稳定同位素方法。本文旨在描述一种小块田间试验 采用非受限设计 ¹⁵两个生长季内用于多次土壤和植物取样的氮富集微区试验，以及总氮 ¹⁵氮素分析。本方法通过在美国明尼苏达州中南部开展的一项重复种植玉米的研究进行演示（玉米（Zea mays） L.）。每个处理包括六行玉米（行距76 cm），行长15.2 m，一端嵌入一个微型小区（2.4 m × 3.8 m）。施用肥料级尿素，氮素用量为135 kg N∙ha⁻¹。^-1 种植时，微区施用氮-15丰度为5原子百分比的尿素 ¹⁵在生长季节期间多次采集土壤和植物样品，所有操作过程中均使用独立工具，并将未富集与富集样品进行物理分离，以尽量减少交叉污染。土壤和植物样品经干燥后，先研磨至可通过2 mm筛网，再使用滚压研磨机进一步研磨至类似面粉的细度。示踪研究需要额外的规划、更长的样品处理时间与更多的人工投入，并会产生更高的成本 ¹⁵与传统的氮素研究相比，氮富集材料和样品分析能够提供更精确的信息。然而，通过质量平衡方法，结合生长季内多次取样事件的示踪研究，研究人员可估算肥料氮在土壤-作物系统中的分布，并估算系统中未被计入的肥料氮去向。

引言

氮肥（N）的使用对于满足全球不断增长人口对粮食、纤维、饲料和燃料的需求至关重要，但农田中氮素的流失可能对环境质量产生负面影响。由于氮素在土壤-作物系统中会经历多种转化过程，因此有必要更深入地了解氮素循环、作物对氮素的吸收利用以及肥料氮素的总体归趋，以改进管理措施，提高氮素利用效率，并最大限度减少氮素对环境的损失。传统的氮肥研究主要关注处理措施对季末指标的影响，例如作物产量、作物氮素吸收量相对于施氮量的比率（表观肥料利用率）以及土壤中残留的氮素含量。尽管这些研究能够量化整个系统的氮素输入、输出和利用效率，但无法识别或量化来源于肥料或土壤的氮素在土壤-作物系统中的具体去向。必须采用基于稳定同位素的不同方法，来追踪和量化来源于肥料的氮素（FDN）在土壤-作物系统中的归趋。

氮有两种稳定同位素， ¹⁴氮和 ¹⁵N，在自然界中以约272:1的相对恒定比例存在 ¹⁴N/¹⁵N¹ （浓度为 0.366 原子 %） ¹⁵N 或 3600 ppm ¹⁵N^2,3）。添加 ¹⁵氮富集肥料增加总产量 ¹⁵土壤系统中的氮含量。如 ¹⁵氮富集肥料....

方案

1. 野外地点描述

注意：进行¹⁵N示踪田间试验时，所选试验地点应尽量减少因土壤、地形和物理特征引起的变异⁵。由于坡度、风力或水流迁移以及耕作导致的土壤侧向移动，可能发生交叉污染；而土壤氮素的垂直分布可能受到地下水流和暗管排水的影响⁶。

1. 描述实验田间试验地点，包括以往的管理措施（如前茬作物和耕作方式）、经纬度、土壤物理和化学性质（如土壤质地分析、初始肥力状况、pH值和土壤容重）。
2. 记录研究地点及田块四角的GPS坐标。
3. 描述生长季期间的管理措施，包括病虫害管理（除草剂、杀虫剂或杀菌剂的使用）、土壤养分管理（包括施用量、养分来源、施用位置和施用时间）、耕作措施、灌溉事件及灌溉量，以及残留物管理。
4. 由于作物生长和微生物介导的氮素转化过程受土壤水分、土壤温度和空气温度的影响，应记录气候信息，包括每日最高和最低气温、每日降水量，以及多个深度（与土壤采样深度相对应）的土壤水分和温度数据。

2. 实验设计

1. 种植六行玉米（约86,000株/ha）^-1在76 cm行距下种植，最终小区尺寸为15.2 m × 4.6 m。
   1. 在纵向长度的两端各设立1.5米的边界区....

结果

本文所展示的结果来自 2015 年建立于明尼苏达大学位于明尼苏达州威西卡附近的南部推广与研究中心的田间试验点。该试验点在 2015 年之前采用玉米–大豆［Glycine max (L.) Merr］轮作体系，而在 2015 年和 2016 年生长季期间则采用玉米–玉米轮作体系。土壤类型为 Nicollet 壤质黏土（细质地壤土，混合型，高活性，中性湿润半淀积土）–Webster 壤质黏土（细质地壤土，混合型，高活性，中性典型湿润潜育土）复合体。除氮素（N¹⁸）外，土壤养分管理均按照大学推荐方案进行。多个氮肥处理采用随机完全区组设计，设四个重复，但本文仅展示种植时施用 135 kg N∙ha^-1 尿素的处理。土壤容重采用 intact core 方法测定¹⁹，在每个重复中，于 0–15 cm、15–30 cm、30–60 cm、60–90 cm 和 60–120 cm 深度层次的中心位置采集两个 5 cm 深度的样品。容重数据在各深度层次内.......

讨论

稳定同位素研究是追踪和量化土壤-作物系统中固定氮（FDN）的有效工具。然而，氮示踪研究涉及三个主要假设，若这些假设被违背，则可能使采用该方法所得出的结论无效。这些假设是：1）示踪剂在整个系统中均匀分布；2）所研究过程的发生速率保持一致；3）从¹⁵N富集池中离开的氮不会重新返回³。由于本研究关注的是总固定氮在整个土壤-作物系统中的分布情况，因此假设2和假设3的影响极小²¹。

由于¹⁵N标记物质成本较高，通常会限制¹⁵N示踪研究的规模。因此，在开展氮素示踪研究之前，研究人员应仔细规划研究目标，需考虑以下因素：取样次数、研究持续时间（数天至数年）、氮肥施用量，以及在施用¹⁵N标记肥料后，由于与大量土壤氮的混合稀释，仍能从自然丰度（0.366 原子%）中检测出差异所需的¹⁵N富集浓度²。参考文献2中已报道了不同类型农学研究中常用的^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20 mL 闪烁瓶	ANY；Fisher Scientific 为一个示例	0334172C
250 mL 硼硅酸盐玻璃瓶	QORPAK	264047
48 孔板	EA Consumables	E2063
96 孔板	EA Consumables	E2079
布质零件袋（30×50 cm）	ANY	NA	用于玉米穗
CO2 背负式喷雾器	ANY；Bellspray Inc 为一个示例	Model T
硬币信封（6.4×10.8 cm）	ANY；ULINE 为一个示例	S-6285	用于 2 mm 研磨植物样品
玉米切碎机	ANY；DR Chipper Shredder 为一个示例	SKU:CS23030BMN0	用于切碎玉米生物量
玉米种子	ANY	NA	适合该地区的杂交品种
一次性鞋套	ANY；Boardwalk 为一个示例	BWK00031L
200 试验证乙醇	ANY；Decon Laboratories Inc. 为一个示例	2701TP
带抽绳的织物袋（90×60 cm）	ANY	NA	用于植物样品采集
尿素肥料（46-0-0）	ANY	NA	~0.366 原子% 15N
手耙	ANY；Fastenal Company 为一个示例	5098-63-107
手用镰刀	ANY；Home Depot 为一个示例	NJP150	用于植物样品采集
手持式土壤取样探针	ANY；AMS 为一个示例	401.01
液压土壤取样探针	ANY；Giddings 为一个示例	GSPS
盐酸，12N	Ricca Chemical	R37800001A
研磨罐磨机	ANY；Cole-Parmer 为一个示例	SI-04172-50
实验室磨粉机	Perten	3610	用于研磨谷物
精确至四位小数的微量天平	ANY；Mettler Toledo 为一个示例	XPR2
N95 颗粒物过滤式面罩呼吸器	ANY；ULINE 为一个示例	S-9632
氯丁橡胶或丁基橡胶手套	ANY	NA	用于盐酸浴操作
纸质五金袋（13.3×8.7×27.8 cm）	ANY；ULINE 为一个示例	S-8530	用于土壤样品和玉米籽粒
植物研磨机	ANY；Thomas Wiley Model 4 Mill 为一个示例	1188Y47-TS	用于将切碎的玉米生物量研磨至 2 mm 颗粒
塑料标签	ULINE	S-5544Y-PW	用于标记织物袋和微区茎秆捆
氢氧化钠颗粒，ACS 级	Spectrum Chemical	SPCM-S1295-07
土壤研磨机	ANY；AGVISE 不锈钢研磨机带电机为一个示例	NA	用于将土壤研磨并通过 2 mm 筛网
锡胶囊 5×9 mm	Costech Analytical Technologies Inc.	041061
锡胶囊 9×10 mm	Costech Analytical Technologies Inc.	041073
尿素（46-0-0）	MilliporeSigma	490970	10 原子% 15N