磁性、声学与光学三重响应型微泡用于磁热与光热联合癌症治疗

摘要

本文介绍了一种通过自组装制备氧化铁纳米颗粒包壳微泡（NSMs）的方案，该方案将磁性、声学和光学响应性协同整合于一个纳米治疗平台中，用于磁热疗与光热联合癌症治疗。

摘要

旨在实现靶向递送、深层渗透以及在肿瘤部位可控释放的抗癌药物精准递送一直面临挑战。本文中，我们通过自组装方法制备了具有氧化铁纳米颗粒壳层的微泡（NSMs），将磁响应性、声响应性和光响应性协同整合于一个纳米治疗平台。氧化铁纳米颗粒兼具磁性和光热效应功能。静脉注射后，NSMs 可通过磁场引导至肿瘤部位。超声可触发氧化铁纳米颗粒的释放，利用微泡的空化效应促进纳米颗粒深入渗透至肿瘤组织内部。随后，可对肿瘤实施磁热疗和光热治疗，实现联合癌症治疗，从而应对因肿瘤异质性导致的抗癌耐药问题。在本实验方案中，我们完成了 NSMs 的合成及其结构、化学、磁学和声学特性的表征。此外，通过体外细胞培养实验评估了热疗的抗癌效果。该递送策略与联合治疗方案在癌症治疗中具有广阔前景，有望显著提升药物递送效率和抗癌疗效。

引言

癌症是最致命的疾病之一，每年在全球造成数百万人死亡以及巨大的经济损失¹。在临床实践中，传统的抗癌疗法（如手术切除、放射治疗和化学治疗）仍无法提供令人满意的治疗效果²。这些疗法的局限性包括高毒副作用、高复发率和高转移率³。例如，化学治疗受限于化疗药物精准递送至肿瘤部位的效率低下⁴。药物难以穿透生物屏障（包括细胞外基质和高肿瘤间质液压力）深入肿瘤组织，也是导致治疗效果不佳的原因之一⁵。此外，接受单一化疗治疗的患者通常会出现肿瘤耐药性⁶。因此，能够实现肿瘤热消融的技术，如光热治疗（PTT）和磁热疗（MHT），在降低肿瘤耐药性方面已显示出良好的前景，并正在进入临床试验阶段^7,8,9。

光热疗法（PTT）通过光热转换剂在激光能量照射下引发热消融，从而杀伤癌细胞。所产生的高温（超过50 °C）可直接导致肿瘤细胞不可逆的损伤和死亡。 ˚C）诱导细胞完全坏死¹⁰最近，氧化铁纳米颗粒（IONPs）被证实是一种光热转换剂，可被近红外（NIR）光激活。¹¹.  尽管氧化铁纳米颗粒（IONPs）在近红外区域的摩尔吸光系数较低，但它们仍是实现低温（43  ˚C）光热治疗，一种经改进的疗法，旨在减少热暴露对正常组织造成的损伤，并启动针对肿瘤转移的抗肿瘤免疫反应¹²光热疗法（PTT）的局限性之一是激光的穿透深度较浅。对于深部肿瘤，可采用交变磁场（AFM）诱导的氧化铁纳米颗粒产热，即磁热疗，作为PTT的替代疗法。^13,14磁热疗（MHT）的主要优势在于磁场具有高穿透性¹⁵然而，IONPs在临床应用中仍存在一个主要缺点，即需要相对较高的浓度。由于循环、富集和穿透等一系列障碍，纳米药物（或纳米颗粒）在动物实体瘤中的递送效率仅为1-10%。^16,17因此，一种能够实现高组织穿透性的可控且靶向的IONPs递送策略在癌症治疗中备受关注。

超声介导的纳米颗粒递送已显示出促进纳米颗粒深入肿瘤组织的能力，这归因于称为微泡空化现象的作用^18，19。在本研究中，我们通过自组装方法制备了由氧化铁纳米颗粒（IONPs）包覆的微泡（NSMs），将磁性、声学和光学响应性协同整合于一个纳米治疗平台中。NSM包含空气核心和氧化铁纳米颗粒壳层，直径约为5.4 µm。NSMs可通过磁场引导至肿瘤部位。随后，超声触发IONPs释放，同时伴随微泡空化和微流效应。微流产生的动量有助于IONPs深入渗透至肿瘤组织。光热治疗（PTT）和磁热治疗（MHT）可通过近红外激光照射或交变磁场（AFM）施加单独实现，也可联合两种方式共同实施。

方案

所有动物实验均按照OG Pharmaceutical动物护理和使用实验室动物指南批准的方案进行。这些方案遵循OG Pharmaceutical实验室动物伦理委员会的指导原则。

1. 纳米颗粒包壳微泡（NSMs）的合成

1. 将磁性纳米颗粒（Fe₃O₄，氧化铁）分散于去离子水中，配制成 10 mg/mL 的储备液。
2. 将含有 IONPs 溶液的离心管置于超声清洗仪中处理 20 分钟，使用前获得均匀分散的 IONPs 溶液。
3. 在 1.5 mL 离心管中加入 150 μL 去离子水、150 μL 10 mM 十二烷基硫酸钠（SDS）以及 400 μL 来自步骤 1.1 的 IONPs 储备液。 
4. 将匀浆器固定在支架上，并置于冰浴中。
5. 将混合液离心管置于冰浴中，并精确调整匀浆器探头位置，使其完全浸入混合液中。
6. 调节匀浆器转速至 20,000 rpm，开启匀浆器处理 3 分钟。
7. 关闭匀浆器，并将离心管从冰浴中取出。
8. 将离心管放置于试管架中，在室温下静置 12 小时以达到稳定状态。
9. 用磁铁将所得 NSMs 吸附至管壁，移除上清液，随后加入 1 mL 新鲜去离子水。
10. 重复洗涤过程三次，最后将 NSMs 重新悬浮于 1 mL 新鲜蒸馏水中。
11. 轻轻振荡后，取 10 μL NSMs 悬液转移至洁净的玻璃载片上。
12. 使用荧光显微镜在 20 倍放大倍数下观察 NSMs 的形态，确保在随机区域拍摄图像。
13. 使用开源 Nano Measurer 1.2 软件测量照片中 NSMs 的直径，至少统计 200 个微泡。
    1. 点击“文件”和“打开”以选择待处理的图像文件。图像导入后，点击“标尺”工具，绘制一条与图像中标尺长度相同的红线。
    2. 然后点击“设置”|“标尺”，输入标尺的实际长度。在图像中逐个绘制与各个微泡直径等长的线段。完成所有测量后，点击“报告”|“查看报告”。

2. NSMs 的声学响应

1. 将200 μL的NSMs用800 μL去离子水稀释，然后转移至1.5 mL离心管中，制成储备液。
2. 连接函数发生器、放大器、阻抗匹配器和自制的聚焦换能器。将换能器置于人工长方体水槽底部中央，并将水听器与示波器连接，以监测输出的超声强度（图1）。向水槽中加入去离子水，使换能器完全浸没。
3. 将函数发生器调至扫描模式，频率范围调节为10 kHz至900 kHz，幅值设为20 Vpp（峰峰值电压）。通过放大器将超声功率调节至0.1%。每个周期持续4秒，间隔时间为1秒。
4. 在离心管中准备1 mL NSMs储备液样品，并使用支架将试管固定在自制聚焦换能器的上方。将磁铁贴附于试管底部，以吸引NSMs。
5. 开启函数发生器和放大器的电源。施加5个周期（25秒）的超声后，关闭函数发生器。移除磁铁，收集含有释放的IONPs的1 mL溶液。向离心管中加入1 mL去离子水。
6. 重复步骤2.5，直至试管中的NSMs完全崩解。
7. 采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES）对所有释放的IONPs进行定量分析，方法如前所述¹³。

3. NSMs 的光学响应

注意：本研究采用了一套包含808 nm激光功率和红外热成像相机的激光系统，该系统此前已被Xu等人描述过²⁰。

1. 激光系统准备
   1. 打开激光电源，预热数分钟。将光纤耦合的808 nm激光二极管固定在铁架台上。
   2. 通过光纤将激光束引导至样品台，并使用凸透镜聚焦，使光斑直径达到6 mm。
   3. 使用激光功率计测量输出功率，并将功率调节至1 W/cm²。
   4. 将红外热成像相机固定在三脚架上。打开相机并检查其是否正常工作（例如，监测感兴趣区域（ROI）的温度）。照射结束后关闭激光电源和红外热成像相机。
2. 水溶液中的光热性能测量
   1. 在1.5 mL离心管中，用不同浓度的IONPs（1.05 mg/mL、1.35 mg/mL、3.65 mg/mL、5 mg/mL）制备1 mL样品。
   2. 将待测样品管置于激光束聚焦区域，记录样品的初始温度。
   3. 开启激光电源和红外热成像相机，连续照射样品10分钟，同时实时记录温度变化。
   4. 照射10分钟后关闭激光电源和红外热成像相机。等待该区域温度恢复至初始水平。
   5. 重复步骤3.2.2至3.2.4，以测量其他样品。
      注：使用20 °C的去离子水作为空白对照进行光热测量。
3. 培养细胞中的光热性能测量
   注：选择小鼠乳腺癌细胞（4T1）作为模型，研究光热治疗的抑制效果。
   1. 使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素的RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培养基培养细胞。设定培养环境为37 °C、5% CO₂。
   2. 在T25培养瓶中培养4T1细胞，当细胞融合度达到90%时按1:2比例传代。
      注：可根据不同实验室的具体细胞状态调整传代比例。
   3. 移除并弃去培养基，用1×PBS溶液冲洗细胞层，以去除含有胰蛋白酶抑制剂的残留血清。
   4. 向培养瓶中加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，随后加入3 mL 1640培养基，轻轻吹打收集细胞。
   5. 收集5 mL细胞悬液，在500 x g条件下离心3分钟。
   6. 弃去上清液，加入1 mL新鲜1640培养基重悬细胞，制成细胞悬液。
   7. 取100 μL细胞悬液加入含有1 mL培养基的共聚焦培养皿中。确保细胞悬液浓度为9 × 10⁵/mL，最终共聚焦培养皿中的细胞浓度为8.1 × 10⁴/mL。
   8. 将接种后的共聚焦培养皿放入培养箱中培养24小时。
   9. 用无血清1640培养基将不同浓度（1.05 mg/mL、1.35 mg/mL、3.65 mg/mL、5 mg/mL）的IONPs样品稀释，配制成1 mL溶液。
   10. 吸除共聚焦培养皿中的培养基，加入已配制的样品溶液。
   11. 开启激光电源，将激光束聚焦于培养皿中心，调节输出功率至1 W/cm²。开启红外热成像相机，对共聚焦培养皿中的细胞连续照射10分钟，实时记录聚焦区域的温度。
   12. 照射结束后关闭激光和红外热成像相机，将培养皿转移至培养箱中继续培养24小时。
   13. 移除并弃去培养基，向共聚焦培养皿中加入1 mL新鲜培养基，再加入5 μL Calcein-AM溶液（1 mg/mL）。
   14. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育15分钟，用1×PBS溶液冲洗细胞层两次。
   15. 使用共聚焦荧光显微镜观察并成像细胞，激发波长为488 nm，发射波长为500–540 nm。
   16. 在共聚焦图像中随机选取5个区域，手动统计每个区域中存活的4T1细胞数量。通过比较各实验组与对照组中活细胞数量，定量分析4T1细胞的存活率。
       注：使用20 °C的无血清1640培养基作为空白对照进行光热测量。未接受激光照射的样品组作为细胞活力对照组。
4. 体内光热性能测量
   1. 准备3只8周龄雄性ICR小鼠，平均体重为25 ± 2 g。
   2. 将2 g明胶粉末加入20 mL去离子水中，加热至40–50 °C，完全溶解明胶，形成透明澄清溶液。
   3. 向3.4.2步骤所得溶液中加入100 mg IONPs。
   4. 将明胶溶液保持在40–50 °C，立即向小鼠右侧乳腺垫注射500 μL该溶液。
   5. 开启激光电源，将激光束聚焦于目标区域（小鼠右侧乳腺垫），调节输出功率至1 W/cm²。开启红外热成像相机，对目标区域连续照射10分钟，实时记录感兴趣区域的温度。
   6. 照射结束后关闭激光和红外热成像相机。
   7. 采用CO₂窒息结合颈椎脱臼法，或研究所动物实验伦理委员会批准的其他方法处死小鼠。

4. 磁热疗测量

注意：此处使用了一种此前由 Wu 等人描述的磁热疗系统⁽²¹⁾。

1. 准备一个磁热疗系统，包括交变磁场（AFM）发生器和红外热成像相机。
   1. 开启冷却器运行10分钟，然后启动中频射频加热设备（即AFM发生器）。
   2. 设置设备参数如下：频率（f）= 415 kHz，磁场强度 = 1.8 kA/m。
2. 水溶液中的磁热疗测量
   1. 在1.5 mL离心管中，配制1 mL不同IONPs浓度的样品（1.05 mg/mL、1.35 mg/mL、3.65 mg/mL、5 mg/mL）。
   2. 将离心管置于水冷式磁感应铜线圈的中心位置。
   3. 开启交变磁场（AFM）和红外热成像相机。持续诱导样品10分钟，并实时记录温度。
      注：相机位于样品上方，提供样品的横截面视图。
   4. 关闭AFM和红外热成像相机。等待铜线圈温度恢复至基线水平，持续10分钟。
      注：注意高温，避免用手直接接触，待冷却后再取出样品。
   5. 重复步骤4.2.2至4.2.4，以测量其他样品。
   6. 关闭中频射频加热设备（AFM）和冷却器。
      注：使用20 °C的去离子水作为磁热疗测量的对照。
3. 体内磁热疗测量
   1. 准备3只8周龄雄性ICR小鼠，平均体重为25 ± 2 g。
   2. 配制20 mL含5 mg/mL IONPs溶液的10%明胶凝胶。
   3. 将明胶凝胶加热至40 - 50 °C，立即向动物右侧乳腺脂肪垫注射500 μL明胶溶液。
      注：磁感应热疗实验使用与体外测试相同参数的加热设备进行。
   4. 开启交变磁场（AFM）和红外热成像相机。将小鼠的右侧乳腺脂肪垫置于水冷式磁感应铜线圈的中心位置。
   5. 启动红外热成像相机，连续成像目标区域（小鼠右侧乳腺脂肪垫）10分钟，并实时记录该区域的温度。
   6. 诱导10分钟后，关闭设备电源开关和红外热成像相机。等待铜线圈温度恢复至基线水平，持续10分钟。
   7. 重复步骤4.3.4至4.3.6，以测量其他样品。
   8. 关闭中频射频加热设备（AFM）和冷却器。
      注：注意高温，避免用手直接接触，待冷却后再取出样品。
   9. 采用CO₂窒息结合颈椎脱位法，或研究所动物实验委员会批准的其他方法处死小鼠。

结果

本研究中使用的三重响应性纳米颗粒包壳微泡（NSMs）通过振荡表面活性剂与IONPs的混合物制备而成。IONPs（50 nm）在液-气核界面自组装，形成致密排列的磁性壳层。NSMs的形态如图1A所示。所获得的NSMs呈球形，平均直径为5.41 ± 1.78 μm（图1B）。结果表明NSMs已成功制备。当储存在水中时，微泡可保持完整超过1年，在缓冲液和细胞培养基中至少稳定10天¹⁹。如图1D所示，随着施加超声波循环次数的增加，铁（Fe）实现了逐步释放。经过10个循环后，约20%的铁被释放；直至50个超声循环，释放的铁量达到约80%的平台期。这些结果表明，可通过外部超声触发实现IONPs的按需释放。

在图2中展示了IONPs介导的水溶液中光热测量结果。如图2A、B所示，随着辐照时间的增加，IONPs的温度迅速上升。当Fe浓度为5 mg/mL...

讨论

本文介绍了一种通过自组装制备具有氧化铁纳米颗粒壳层的微泡（NSMs）的方案，将磁性、声学和光学响应性整合于单一纳米治疗平台。氧化铁纳米颗粒（IONPs）紧密包覆在气核周围形成磁性壳层，可通过外加磁场实现靶向控制。递送至目标位置后，可通过超声触发释放IONPs。释放后的IONPs可被近红外光（NIR）和交变磁场（AFM）分别或共同激活，用于光热治疗（PTT）和磁热治疗（MHT），或两者的联合治疗。

在整个实验方案中，NSMs 的合成步骤起着重要作用，是整个方案的基础。同时，IONPs 在体外的可控释放验证了 NSMs 的声学响应特性。在水溶液中进行的光热测量和磁热疗测量实验方案也分别验证了 NSMs 的磁学和光学响应特性。

为了成功制备纳米声敏剂（NSMs），使用前必须将氧化铁纳米颗粒（IONPs）溶液超声处理20分钟，以确保IONPs在水中均匀分散。进行搅拌时，必须将匀浆器探头完全浸入溶液中。在研究NSMs的声学响应时，应将样品管直接放置在换能器顶部，并用磁铁将NSMs吸附至管底，以防止超声强度衰减。此外，若在光热测量或磁热疗...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
808 nm 激光功率	Changchun New Industries Optoelectronics Tech	MDL-F-808-5W-18017023
Calcein-AM	Thermo Fisher SCIENTIFIC	C3099
胎牛血清	Invitrogen	16000-044
荧光显微镜	Olympus	IX71
函数发生器	Keysight	33500B 系列	20 MHz，双通道，具备任意波形生成功能
明胶凝胶	Sigma	9000-70-8
加热设备	Shuangping	SPG-06-II
自制聚焦换能器			频率=855，R-X=36.2W+5.8W，|Z|-θ=37W+8°
匀浆器	SCILOGEX	D-160	8000-30000 rpm
水听器	T&C	NH1000
ICR 雄性小鼠	OG Pharmaceutical. Co. Ltd		8 周龄
电感耦合等离子体发射光谱仪	PerkinElmer
红外热成像相机	FLIR	E50
氧化铁（II,III）	Alfa Aesar	1317-61-9	50-100 nm APS 粉末
激光功率计	Changchun New Industries Optoelectronics Tech
示波器	Keysight	DSOX3054T	带宽 500 MHz，采样率 5 GS/s，4 通道
射频功率放大器	T&C	AG1020	信号源也可连接外部信号源。增益可在 0 至 100% 范围内调节，具备频率扫描、脉冲和三角波等多种功能。
Roswell Park Memorial Institute-1640	KeyGEN BioTECH	KGM31800
十二烷基硫酸钠	Sigma	151-21-3