一种用于纳米材料及其他难处理物质藻类毒性测试的小规模装置

摘要

我们采用垂直LED光照装置，演示针对难测试物质（如着色物质或纳米材料）的藻类毒性测试。

摘要

根据欧洲及国际法规（例如REACH法规），生态毒性数据是化学品上市前和上市后注册的必要要求。藻类毒性试验常用于化学品的监管风险评估。为了实现高可靠性和可重复性，制定标准化指南至关重要。对于藻类毒性测试，指南要求pH、温度、二氧化碳水平和光照强度等参数保持稳定且均匀。纳米材料及其他所谓的难测试物质可能干扰光照，导致结果出现较大变异，从而阻碍其在监管中的接受度。为应对这些挑战，我们开发了LEVITATT（用于藻类毒性测试的LED垂直照射台）。该装置采用底部LED照明，可实现均匀的光照分布和温度控制，同时最大限度减少样品内部的遮蔽效应。该设计优化了用于生物量定量的样品体积，同时确保有足够的CO₂输入以支持藻类的指数生长。此外，测试容器的材料可根据需要定制，以最小化吸附和挥发作用。在测试有色物质或颗粒悬浮液时，使用LED光源还可在不产生额外热量的情况下提高光照强度。其紧凑的设计和最低限度的设备需求，增加了LEVITATT在各类实验室中推广应用的可能性。在符合标准化的ISO和OECD藻类毒性测试指南的同时，LEVITATT在两种标准物质（3,5-二氯苯酚和K₂Cr₂O₇）以及三种纳米材料（ZnO、CeO₂和BaSO₄）的测试中，相较于锥形瓶和微孔板，表现出更低的样品间变异性。

引言

藻类毒性试验是欧洲及国际法规（如REACH¹和美国TSCA）在化学品上市前和上市后注册过程中，用于生成生态毒性数据的三项强制性试验之一。为此，国际组织（如ISO和OECD）已制定了标准化的藻类试验指南。这些测试标准和指南对pH、温度、二氧化碳水平和光照强度等方面规定了理想的试验条件。然而，在实际操作中，维持稳定的试验条件十分困难，导致多种化学物质和纳米材料（常被称为“难测物质”）的试验结果在重现性和可靠性方面存在问题²。目前大多数藻类毒性测试系统采用相对较大的体积（100–250 mL），将样品置于培养箱内的旋转摇床上进行培养。此类系统限制了可实现的测试浓度数量和重复次数，且需要大量藻类培养物和测试物质。此外，这些系统通常缺乏均匀的光照场，而在大体积锥形瓶中获得可靠的光照条件尤为困难：一方面是因为光照强度随传播距离呈指数衰减，另一方面也与锥形瓶的几何形状有关。其他替代方案采用塑料微孔板³，其样品体积较小，无法提供足够的取样量用于pH测定、额外的生物量测量、色素提取或其他需要破坏性取样的分析。在利用现有系统对纳米材料及可形成有色悬浮液的物质进行藻类毒性测试时，一个特别挑战是测试物质对藻细胞可利用光的干扰或遮挡，通常称为“遮光效应”^4,5。遮光可能发生在样品瓶内部，由测试物质本身和/或其与藻细胞之间的相互作用引起；也可能发生在样品瓶之间，由样品瓶相对于彼此及光源的位置所导致。

该方法基于Arensberg等人⁶提出的微型藻类毒性测试装置，可满足OECD 201⁷和ISO 8692⁸等标准的测试要求。为进一步克服上述局限性，本方法进行了以下优化：1）采用LED光照技术，确保光照条件均匀且产热极低；2）提供足够的样品体积用于化学或生物学分析，同时维持恒定的pH和CO₂水平；3）支持使用多种测试容器材料，适用于挥发性物质或具有高吸附潜力的物质的测试。

方案

1. LEVITATT 装置的描述

1. 使用20 mL的闪烁玻璃瓶（图1，插图1），确保光线能够穿透。也可使用可透光的塑料瓶。使用光度计测定光强。
2. 测试开始时至少使用4 mL的测试悬浮液，以便在培养期间及培养结束后对生物量以及纳米材料进行定量和表征（图1，插图2）。
3. 为20 mL闪烁瓶配备瓶盖（图1，插图3），并在盖上钻一个直径约1 mm的小孔，以允许与大气进行CO₂交换。此交换对于在测试期间维持稳定的pH和CO₂水平至关重要。
4. 对于挥发性物质，使用带有聚四氟乙烯（Teflon）涂层的密封瓶盖，可通过注射器向顶空充入CO₂⁹；或使用完全封闭、无气相的瓶体，通过富集的碳酸氢钠（NaHCO₃）缓冲体系将CO₂维持在溶液中¹⁰。
5. 使用安装在外壳上的夹具固定瓶体（图1，插图4）。
6. 在测试瓶下方设置LED光源（图1，插图5），提供均匀的“冷白光”或“日光”型荧光照明，光强范围为60–120 µE∙m^-2∙s^-1，测量波长范围为光合作用有效波段400 nm至700 nm。该装置通过在光源上安装调光器，可调节光强范围为5–160 µE∙m^-2∙s^-1，从而支持在更高或更低光强条件下的测试。
7. 将装置置于轨道摇床上，在整个测试过程中持续振荡样品，以保持细胞处于自由悬浮状态，并促进CO₂从空气向水中的传质（图1，插图6）。
8. 将装置置于温度可控的房间或恒温柜中，以在整个测试期间维持稳定的温度（图1，插图7）。

图1：用于藻类毒性测试的LED垂直照明台（LEVITATT）示意图。1) 用于培养的20 mL玻璃闪烁小瓶，2) 用于分析的4 mL样品，3) 带有钻孔的盖子以实现CO₂交换，4) 用于提供特定光照条件的外壳，5) 位于外壳中央的LED光源，6) 实验过程中用于振荡的轨道摇床，以及7) 恒温箱。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 藻类培养基的制备

1. ISO 8692 藻类生长培养基由四种不同的储备液组成。根据表1称取适量盐类，并用超纯水稀释。

储备液	营养物质	储备液中的浓度	测试溶液中的浓度
1：宏量营养素	NH4Cl	1.5 g/L	15 mg/L（N：3.9 mg/L）
	MgCl₂2·6H2O	1.2 g/L	12 mg/L（Mg：2.9 mg/L）
	CaCl2∙2H2O	1.8 g/L	18 mg/L（Ca：4.9 mg/L）
	MgSO₄4∙7H2O	1.5 g/L	15 mg/L（S：1.95 mg/L）
	KH2PO4	0.16 g/L	1.6 mg/L（P：0.36 mg/L）
2: Fe-EDTA	FeCl3·6H2O	64 mg/L	64 µg/L（Fe：13 µg/L）
	Na2EDTA∙2H2O	100 mg/L	100 µg/L
3：微量元素	H3BO3a	185 mg/L	185 µg/L（B：32 µg/L）
	MnCl2∙4H2O	415 mg/L	415 µg/L（Mn：115 µg/L）
	ZnCl2	3 mg/L	3 µg/L（Zn：1.4 µg/L）
	CoCl2·6H2O	1.5 mg/L	1.5 µg/L（Co：0.37 µg/L）
	CuCl2∙2H2O	0.01 mg/L	0.01 µg/L（Cu：3.7 ng/L）
	Na2MoO4∙2H2O	7 mg/L	7 µg/L（Mo：2.8 µg/L）
4: NaHCO₃	NaHCO₃3	50 g/L	50 mg/L（C：7.14 mg/L）

表1：藻类生长培养基中储备溶液的营养成分浓度

注意：H₃BO₃ 可通过添加 0.1 M NaOH 溶解。检测金属时应去除 EDTA，以避免与金属离子形成络合物。通过膜过滤（平均孔径 0.2 µm）或高压灭菌（120 °C，15 分钟）对储备液进行灭菌。储备液 2 和 4 不可高压灭菌，需通过膜过滤灭菌。将溶液避光保存于 4 °C。

2. 制备 1 L 藻类培养基时，将 500 mL 灭菌超纯水转移至 1 L 灭菌容量瓶中，加入 10 mL 储备液 1：大量营养元素、1 mL 储备液 2：Fe-EDTA、1 mL 储备液 3：微量元素和 1 mL 储备液 4：NaHCO₃。
3. 用灭菌超纯水定容至 1 L，塞紧瓶塞并充分振荡，使藻类培养基均匀混合。
4. 使用前将溶液与空气接触过夜，或通入无菌过滤空气 30 分钟以达到平衡。平衡后，如有必要，用 1 M HCl 或 1 M NaOH 将 pH 调整至 8.1 ± 0.2。

3. 设置藻类测试

注意：藻类测试程序的流程图见图2。

图2：藻类测试装置的流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 根据步骤2制备的藻类生长培养基，配制所需最高测试浓度的受试化合物储备液。配制储备溶液/悬浮液时，遵循OECD 201（适用于可溶性化合物）或OECD 318（适用于纳米材料）指南。
2. 测定储备液的pH值。若其与藻类生长培养基的pH值偏差超过1个单位，则使用1 M HCl或1 M NaOH将pH调节至8。
3. 计算在25 mL测试溶液中达到最终细胞浓度为1 × 10⁴ 个细胞/mL所需的接种液体积。
   注意：接种液应来自使用LEVITATT装置培养的、无污染且处于指数生长期的Raphidocelis subcapitata培养物。
4. 计算向每个25 mL容量瓶中添加的储备液量，以获得所需的测试浓度。各浓度之间的倍数不应超过3.2。
5. 为每个选定浓度标记一个25 mL容量瓶，并额外标记一个25 mL容量瓶作为对照。
6. 向各个25 mL容量瓶中加入达到目标浓度所需的受试化合物储备液。对照组容量瓶中不得加入储备液。
7. 向每个25 mL容量瓶中加入培养基，使体积达到约20 mL。
8. 向每个25 mL容量瓶中加入步骤3.3中计算出的接种液体积，然后用培养基定容至总体积为25 mL。
9. 塞紧瓶塞，通过将容量瓶垂直翻转两次的方式充分混匀。
10. 从每个容量瓶中转移0.4 mL至单独的螺口小瓶中，并加入1.6 mL丙酮（用MgCO₃饱和）。每个测试浓度和对照组各取一个样品。盖紧瓶盖，避光室温保存，直至进行荧光测定（第4节）。
11. 将每种测试溶液4 mL移入20 mL闪烁瓶中（每个浓度设3个重复，对照组设5个重复）。拧紧闪烁瓶瓶盖。注意：瓶盖必须带有钻孔（直径约1 mm），以允许CO₂交换。
12. 在24 h、48 h和72 h时，从每个闪烁瓶中移取0.4 mL至螺口小瓶中，并加入1.6 mL丙酮（用MgCO₃饱和）。盖紧瓶盖，避光室温保存，直至进行荧光测定（第4节）。
13. 在72 h取完最后一个样品后，将同一浓度的三个重复样品轻轻混合于一个瓶中，并测定pH值。对所有浓度及对照组重复此操作。所测各样品的pH值与初始pH值的偏差不得超过1.5个单位。
14. 根据所在机构的规定和规程，将剩余液体排入废液容器中。

4. 分析藻类测试样品

1. 使用荧光分光光度计测量藻类生物量（此处以叶绿素A表示）。叶绿素A的激发波长峰值为420 nm，发射波长峰值为671 nm。
2. 对每个样品的荧光值重复测量三次，并计算每个样品的平均值。
3. 使用公式1计算生长速率。所测得的荧光值（相对单位）可直接作为公式1中的生物量参数。
   公式1：µ = (ln N_t – ln N₀) / t
   其中，µ为生长速率（d^-1），N₀为初始生物量，N_t为时间t时的生物量，t为试验持续时间（d）。注意，N₀和N_t应使用相同的单位表示。
4. 使用统计软件对生长速率数据拟合非线性回归曲线（例如，对数-逻辑函数或Weibull函数），以获得10%、20%和50%抑制率下的有效浓度值。补充信息中提供了在统计软件R中使用DRC包进行拟合的代码示例¹¹。

结果

首先使用参比物质进行初步测试，以确定藻株的敏感性。R. subcapitata 常用的参比物质包括重铬酸钾和3,5-二氯苯酚^7,8。图3 和 表2 展示了应用R语言中的DRC软件包对生长速率数据进行分析时，藻类毒性试验的典型结果，包括曲线拟合和统计输出结果。

图 3：化学物质对藻类（R. subcapitata）暴露 72 小时的代表性浓度-反应...

讨论

浮游植物将太阳能和二氧化碳转化为有机物，因此在水生生态系统中具有关键作用。正因如此，藻类生长抑制试验被列为化学品监管风险评估所需的三项强制性水生毒性试验之一。在这一背景下，能够开展可靠且可重复的藻类毒性试验至关重要。使用锥形瓶进行测试会引入多种变异性与操作不便，如引言部分所述。为解决这一问题，已有研究提出采用微孔板³。尽管微孔板可显著减少测试所需的体积和空间，但文献中已对这类装置是否符合测试指南中的有效性判据提出了质疑⁶。例如，Birch 等人最近的研究表明，在37 °C条件下，使用细胞培养基（DMEM GluteMAX、Opti-MEM 和 Hams F12 GlutaMAX）时，微孔板中半挥发性化学物质会发生显著损失，并出现向其他孔的交叉污染¹²。对于挥发性物质的测试，可采用LEVITATT装置实现有效测试：1）使用含CO₂富集顶空的密闭小瓶⁹；2）通过顶空直接投加挥发性化合物¹³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Sigma-Aldrich	V179124
氯化铵	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap 瓶子（1L）	Buch & Holm A/S	9072335
硼酸	Sigma-Aldrich	B0394
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	208290
透明亚克力板（40x40 cm）
六水合氯化钴(II)	Sigma-Aldrich	255599
二水合氯化铜(II)	Sigma-Aldrich	307483
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Sigma-Aldrich	E5134
荧光分光光度计 F-7000	Hitachi
盐酸	Sigma-Aldrich	258148
六水合氯化铁(III)	Sigma-Aldrich	236489
LED 光源	Helmholt Elektronik A/S	H35161	中性白光，6500K
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M9272
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich	230391
四水合氯化锰(II)	Sigma-Aldrich	221279
轨道摇床	IKA	2980200
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 菌株
闪烁小瓶（20 mL）	Fisherscientific	11526325
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6014
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	415413
二水合钼酸钠	Sigma-Aldrich	331058
弹簧夹	Frederiksen Scientific A/S	472002
恒温箱	VWR	WTWA208450	替代方案：温控室
通风管（Ø125 mm）	Silvan	22605630165
容量瓶（25 mL）	DWK Life Sciences	246781455
氯化锌	Sigma-Aldrich	208086