我们采用垂直LED光照装置，演示针对难测试物质（如着色物质或纳米材料）的藻类毒性测试。
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摘要
摘要
根据欧洲及国际法规（例如REACH法规），生态毒性数据是化学品上市前和上市后注册的必要要求。藻类毒性试验常用于化学品的监管风险评估。为了实现高可靠性和可重复性，制定标准化指南至关重要。对于藻类毒性测试，指南要求pH、温度、二氧化碳水平和光照强度等参数保持稳定且均匀。纳米材料及其他所谓的难测试物质可能干扰光照，导致结果出现较大变异，从而阻碍其在监管中的接受度。为应对这些挑战，我们开发了LEVITATT（用于藻类毒性测试的LED垂直照射台）。该装置采用底部LED照明，可实现均匀的光照分布和温度控制，同时最大限度减少样品内部的遮蔽效应。该设计优化了用于生物量定量的样品体积，同时确保有足够的CO2输入以支持藻类的指数生长。此外，测试容器的材料可根据需要定制，以最小化吸附和挥发作用。在测试有色物质或颗粒悬浮液时，使用LED光源还可在不产生额外热量的情况下提高光照强度。其紧凑的设计和最低限度的设备需求，增加了LEVITATT在各类实验室中推广应用的可能性。在符合标准化的ISO和OECD藻类毒性测试指南的同时，LEVITATT在两种标准物质（3,5-二氯苯酚和K2Cr2O7）以及三种纳米材料（ZnO、CeO2和BaSO4）的测试中，相较于锥形瓶和微孔板，表现出更低的样品间变异性。
引言
藻类毒性试验是欧洲及国际法规（如REACH1和美国TSCA）在化学品上市前和上市后注册过程中，用于生成生态毒性数据的三项强制性试验之一。为此，国际组织（如ISO和OECD）已制定了标准化的藻类试验指南。这些测试标准和指南对pH、温度、二氧化碳水平和光照强度等方面规定了理想的试验条件。然而，在实际操作中，维持稳定的试验条件十分困难，导致多种化学物质和纳米材料（常被称为“难测物质”）的试验结果在重现性和可靠性方面存在问题2。目前大多数藻类毒性测试系统采用相对较大的体积（100–250 mL），将样品置于培养箱内的旋转摇床上进行培养。此类系统限制了可实现的测试浓度数量和重复次数，且需要大量藻类培养物和测试物质。此外，这些系统通常缺乏均匀的光照场，而在大体积锥形瓶中获得可靠的光照条件尤为困难：一方面是因为光照强度随传播距离呈指数衰减，另一方面也与锥形瓶的几何形状有关。其他替代方案采用塑料微孔板3，其样品体积较小，无法提供足够的取样量用于pH测定、额外的生物量测量、色素提取或其他需要破坏性取样的分析。在利用现有系统对纳米材料及可形成有色悬浮液的物质进行藻类毒性测试时，一个特别挑战是测试物质对藻细胞可利用光的干扰或遮挡，通常称为“遮光效应”4,5。遮光可能发生在样品瓶内部，由测试物质本....
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方案
1. LEVITATT 装置的描述
- 使用20 mL的闪烁玻璃瓶（图1，插图1），确保光线能够穿透。也可使用可透光的塑料瓶。使用光度计量化光照强度。
- 测试开始时至少使用4 mL的测试悬浮液，以便在孵育期间及结束后对生物量以及纳米材料进行定量和表征/定量（图1，插图2）。
- 为20 mL闪烁瓶配备瓶盖（图1，插图3），并在盖上钻一个直径约1 mm的小孔，以允许与大气进行CO2交换。此交换对于在测试期间维持稳定的pH值和CO2水平至关重要。
- 对于挥发性物质，使用带聚四氟乙烯（Teflon）涂层的密封瓶盖，可通过注射器向顶空充入CO29；或使用完全封闭、无气相的烧瓶，通过富含碳酸氢钠（NaHCO3）的缓冲体系将CO2维持在溶液中10。
- 使用安装在外壳上的夹具固定瓶体（图1，插图4）。
- 在测试瓶下方设置LED光源（图1，插图....
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结果
首先使用参考物质进行初步测试，以确定藻株的敏感性。R. subcapitata 常用的参考物质包括重铬酸钾和3,5-二氯苯酚7,8。图3 和 表2 展示了应用R语言中的DRC软件包对生长速率数据进行分析时，藻类毒性试验的典型结果，包括曲线拟合和统计输出结果。
图3：化学物质对藻类（R. subcapitata）暴露72小时的典型浓度-反应曲线。
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讨论
浮游植物将太阳能和二氧化碳转化为有机物，因此在水生生态系统中具有关键作用。正因如此，藻类生长抑制试验被列为化学品监管风险评估所需的三项强制性水生毒性试验之一。在这一背景下，能够开展可靠且可重复的藻类毒性试验至关重要。使用锥形瓶进行测试会引入多种变异性与操作不便，如引言部分所述。为解决这一问题，已有研究提出采用微孔板3。尽管微孔板可显著减少测试所需的体积和空间，但文献中已对这类装置是否符合测试指南中的有效性判据提出了质疑6。例如，Birch 等人最近的研究表明，在37 °C条件下，使用细胞培养基（DMEM GluteMAX、Opti-MEM 和 Hams F12 GlutaMAX）时，微孔板中半挥发性化学物质会发生显著损失，并出现向其他孔的交叉污染12。对于挥发性物质的测试，可采用LEVITATT装置实现有效测试：1）使用含CO2富集顶空的密闭小瓶9；2）通过顶空直接投加挥发性化合物13
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由 PATROLS——纳米安全性测试先进工具项目资助，资助协议号为 760813，隶属于“地平线 2020”研究与创新计划。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| 氯化铵 | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap 瓶子（1L） | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| 二水合氯化钙 | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| 透明亚克力板（40x40 cm） | |||
| 六水合氯化钴(II) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| 二水合氯化铜(II) | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| 荧光分光光度计 F-7000 | Hitachi | ||
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| 六水合氯化铁(III) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED 光源 | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | 中性白光，6500K |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| 七水合硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 四水合氯化锰(II) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| 轨道摇床 | IKA | 2980200 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 菌株 | |
| 闪烁小瓶（20 mL） | Fisherscientific | 11526325 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| 二水合钼酸钠 | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| 弹簧夹 | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| 恒温箱 | VWR | WTWA208450 | 替代方案：温控室 |
| 通风管（Ø125 mm） | Silvan | 22605630165 | |
| 容量瓶（25 mL） | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| 氯化锌 | Sigma-Aldrich | 208086 |
参考文献
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for E....
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