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利用营养缺陷型突变株进行直接液体培养筛选以评估异源蛋白的表达 米曲霉

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DOI：

10.3791/61219

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2020年5月12日

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

本文内容

摘要

已开发出一种直接液体培养（DLC）筛选方法，该方法在用于评估丝状真菌Aspergillus oryzae中异源蛋白分泌表达时，可显著缩短聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化所需时间。该方法极大地提高了评估流程的通量。

摘要

Aspergillus oryzae（米曲霉）是一种丝状真菌，是工业应用中最常用的宿主之一，广泛用于大规模生产蛋白质。通常采用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化法将外源基因导入A. oryzae。传统方法通常需要三周时间才能完成对理想转化子的筛选。本文介绍一种新技术——直接液体培养（DLC）筛选法，该方法可在200 mL三角瓶体系中将筛选时间缩短至6天，或在24孔微孔板体系中缩短至10天。DLC筛选法可在单一步骤内同时实现阳性转化子的获取及外源蛋白分泌表达水平的评估，而传统筛选方法则需分别进行两个独立步骤。本文详细描述了A. oryzae的PEG介导原生质体转化实验方案，共包括五个步骤：新鲜孢子悬液的制备、预培养、原生质体制备、DNA导入以及DLC筛选。为确保DLC筛选获得成功，关键在于使用营养丰富的培养基并优化渗透压条件。该实验方案的建立将进一步推动A. oryzae作为首选宿主在工业蛋白质生产中的广泛应用。

引言

Aspergillus oryzae 是日本食品工业中一种重要的微生物，已有1000多年的历史，被用于酿造发酵食品，如sake（米酒）、shoyu（酱油）和miso（豆酱）1,2。该菌能够分泌大量蛋白质，例如蛋白酶和淀粉酶3。A. oryzae 的基因组序列信息也已获得4。此外，针对这种真菌，已建立了一系列强大且具有实用价值的基因工程技术5,6,7,8,9,10。优良的转化子已被用作外源蛋白分泌表达的宿主11,12,13,14。

电穿孔、农杆菌介导的转化以及聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化是将异源基因导入A. oryzae15,16,17的常用技术。其中，PEG介导的原生质体转化方法自1979年首次在Neurospora crassa中报道以来已被广泛应用18。该方法中，将制备的原生质体与PEG及待导入的异源基因混合。原生质体的细胞壁通过酶解被破坏，导致细胞对物理应力和渗透压变化更为敏感19,20。在异源蛋白分泌表达的传统筛选流程中，通常包括三个步骤：获得阳性转化子（在软琼脂平板上）、区分真实与假阳性转化子（在琼脂平板上）以及评估异源蛋白的分泌表达水平（在液体培养中）；每个步骤各需七天（图1）。因此，传统方法通常需要约三周时间。

筛选转化后的A. oryzae细胞所需的时间远长于生物技术研究中常用其他微生物所需的时间，使得该过程更加繁琐。例如，当使用Escherichia coli作为宿主时，从DNA导入到确认其效应大约仅需两天时间21。

为克服上述使用A. oryzae所存在的局限性，本文介绍了一种新的直接液体培养（DLC）筛选方法，该方法可更快速、简便地评估外源蛋白的分泌表达（图1）。在DLC方法中，采用尿苷营养缺陷型突变株和富含营养的液体培养基。利用该方法，可在将DNA导入原生质体后6天内完成筛选步骤（200 mL摇瓶体系），或在24孔微孔板体系中10天内完成。此外，该方法无需耗时且操作繁琐的琼脂平板培养基制备。这种新方法具有显著优势，尤其考虑到传统方法需要两种不同的培养基：用于获得阳性转化子的软琼脂平板（需精细操作和温度控制）以及用于筛选真实转化子的固体琼脂平板。

蛋白质生产筛选流程图：DNA导入，传统方法与DLC方法。
图1：聚乙二醇（PEG）介导的丝状真菌Aspergillus oryzae原生质体转化示意图。
（上图）传统筛选方法。（下图）直接液体培养（DLC）筛选方法。请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

1. 新鲜孢子悬液的制备

  1. 在含有添加了20 mM尿苷的察氏培养基（Czapek-Dox，CD培养基）的培养皿中央接种20 μL孢子储备液（1 × 107 个孢子/mL），培养基经121 °C高压灭菌20分钟（表1）。
  2. 于30 °C培养7天，以促进孢子形成。
  3. 向含有孢子的培养皿中加入1.5 mL 0.01% Tween 20溶液（121 °C高压灭菌20分钟），用细胞涂布器刮取孢子，使其悬浮。
  4. 用移液器将孢子悬浮液收集至无菌的1.5 mL微量离心管中。
  5. 将悬浮液于4 °C保存，直至使用。
    注意：在后续实验中，应在2周内使用该孢子悬浮液。如需长期保存，可向孢子悬浮液中加入甘油，使其终浓度为15%，并于-80 °C保存。

2. 预培养

  1. 在500 mL锥形瓶中加入100 mL多肽-右旋糖酐（PD）培养基（表2），于121 °C高压灭菌20分钟。
  2. 确认培养基温度降低后，加入经0.22 μm滤膜过滤除菌的尿苷溶液，使其终浓度为20 mM。
  3. 加入200 μL在步骤1.4中制备的孢子悬液（1 x 107 孢子/mL），在30 °C、120 rpm振荡条件下培养36小时。

3. 原生质体的制备

  1. 在孔径为30 μm的玻璃滤器（121 °C高压灭菌20分钟）上收集步骤2.3中制备的真菌生物量。
  2. 向玻璃滤器中加入100 mL蒸馏水（DW）（121 °C高压灭菌20分钟），并用刮刀（121 °C高压灭菌20分钟）搅拌数次。
  3. 用蒸馏水洗涤后，向玻璃滤器中加入100 mL氯化钠（NaCl）缓冲液（121 °C高压灭菌20分钟，表3），并用刮刀搅拌数次。
  4. 用刮刀（121 °C高压灭菌20分钟）将约1−2 mL（湿体积）的细胞转移至50 mL锥形管中。
  5. 向50 mL锥形管中加入15 mL酶溶液（通过0.22 μm孔径滤器过滤除菌，表4），再加入NaCl缓冲液至总体积达到30 mL。
  6. 盖紧管盖，并用石蜡膜密封。在30 °C、60 rpm振荡条件下孵育2小时。
  7. 将所得溶液经连接在50 mL锥形管上的70 μm细胞筛网过滤，以去除未反应的菌丝体。
  8. 在50 mL锥形管中，于2,150 × g、4 °C条件下离心原生质体溶液20分钟。
  9. 小心弃去上清液，避免扰动沉淀。加入1 mL冰浴灭菌的溶液B（121 °C高压灭菌20分钟，表5），通过移液轻轻重悬沉淀的原生质体。
  10. 将重悬的原生质体转移至无菌的1.5 mL离心管中。
  11. 在2,220 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。然后加入1 mL冰浴的溶液B，通过移液轻轻重悬沉淀。
  12. 重复步骤3.9。
  13. 使用血细胞计数板，在显微镜下测定原生质体数量。
  14. 用溶液B制备原生质体悬浮液（1−3 × 107 个原生质体/mL），置于冰上保存直至使用。
    注意：请立即在后续实验步骤中使用该原生质体悬浮液。

4. 用于蛋白质分泌生产的DNA导入

  1. 以含有用于蛋白分泌表达的DNA表达盒的质粒为模板，通过PCR扩增获得分泌表达所需的DNA片段。
  2. 使用PCR纯化试剂盒处理PCR产物，制备用于转化的DNA样品。
  3. 在无菌的预冷15 mL锥形管中加入1 mL原生质体溶液、200 μL溶液C（121 °C高压灭菌20 min，表6）和50 μL DNA样品（0.5−1 μg/μL），用移液器轻轻吹打混匀。
    注意：溶液C黏度较高，操作困难；请通过反复吹打确保充分混匀。
  4. 将锥形管置于冰上孵育30 min。
  5. 加入1.5 mL溶液C，轻轻吹打混匀，然后在室温下静置20−30 min。

5. 直接液体培养筛选

注意：使用锥形瓶培养系统（第5.1节）或微孔板（第5.2节）进行选择。

  1. 使用200 mL锥形瓶的培养系统
    1. 向200 mL锥形瓶中加入50 mL含有0.8 M山梨醇的PD培养基，并在121 °C下高压灭菌20分钟。
    2. 确认培养基温度降低后，将步骤4.5中制备的原生质体悬浮液加入其中，使原生质体终浓度为1 × 105 个/mL。
    3. 在30 °C、120 rpm振荡条件下培养6天。
    4. 收集1 mL培养基，置于1.5 mL离心管中并在4 °C保存。若样品不立即分析，则将培养样品储存在-20 °C。
    5. 在1.5 mL离心管中混合20 μL培养样品与20 μL十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（表7），于95 °C煮沸5分钟。
    6. 冰上冷却后，取20 μL煮沸后的样品与5 μL预染蛋白标准品加入预制胶中，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）10分析目标异源蛋白的分泌表达情况。
  2. 使用24孔微孔板的培养系统
    1. 将步骤4.5中制备的原生质体悬浮液加入含0.8 M山梨醇的灭菌PD培养基中，使原生质体终浓度为1 × 105 个/mL，并通过移液轻轻混匀。
    2. 将步骤5.2.1中制备的溶液各1 mL加入24孔微孔板中的三个孔中。
    3. 盖上盖子，在30 °C、175 rpm振荡条件下培养10天。
    4. 收集1 mL培养基，置于1.5 mL离心管中并在4 °C保存。若样品不立即分析，则将培养样品储存在-20 °C。
    5. 在1.5 mL离心管中混合20 μL培养样品与20 μL SDS上样缓冲液，并于95 °C煮沸5分钟。
    6. 冰上冷却后，取20 μL煮沸后的样品与5 μL预染蛋白标准品加入预制胶中，通过SDS-PAGE10分析目标异源蛋白的分泌表达情况。

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结果

以下描述了将编码Talaromyces cellulolyticus纤维二糖水解酶（CBH：GenBank登录号E39854）的DNA表达盒导入A. oryzae菌株HO422的尿苷营养缺陷型菌株，并筛选该异源蛋白分泌表达的结果。

新鲜孢子悬液的制备

一个琼脂平板最终获得的孢子悬液产量为1 mL（1 × 107 个孢子/mL）。

预培养

孵育36小时后，在步骤3.1收获时，从一个烧瓶中获得约5 mL（湿体积）的真菌生物量。该产量足以进行至少两次步骤3.2的实验。

原生质体的制备

随着酶促反应的进行，聚集...

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讨论

我们开发了一种通过原生质体液体培养来快速筛选A. oryzae转化子的系统，其速度优于传统方法。该方法最关键的环节是液体培养基的渗透压。本研究利用山梨醇优化了适合液体培养的渗透压。结果显示，A. oryzae菌株HO4在含有0.8 M山梨醇的条件下生长最为活跃（图3A）。在使用软琼脂培养基的传统方法中，据报道，0.5−1.2 M的渗透压适用于N. crassa、Aspergillus sp.和Trichoderma sp.21。常用的渗透压调节剂包括山梨醇、NaCl、氯化钾（KCl）和硫酸镁（MgSO4）21。根据所用菌株的不同，可能需要调整渗透压调节剂的种类及目标渗透压值。

当使用其他丝状真菌作为异源蛋白分泌生产的宿主时，需要考虑用于制备原生质体的酶溶液的组成。本方案中所用的酶溶液组成依据Tamano

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢冈野凛庆在实验方面提供的帮助。作者感谢东北大学的小见胜也教授和金泽工业大学的町田正幸教授给予的宝贵讨论。本工作由本田研究所日本有限公司提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7.5)富士胶片和光纯药株式会社318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6.8)富士胶片和光纯药株式会社2106-100
1.5 mL 微量离心管AS ONE 公司1-1600-03
15 mL 圆锥形离心管Becton, Dickinson and Company352196
2-巯基乙醇伯乐生命科学公司1610710
24孔微孔板AGC TECHNO GLASS 公司3820-024
50 mL 圆锥形离心管Becton, Dickinson and Company352070
70-µm 细胞滤筛Becton, Dickinson and Company352350
琼脂富士胶片和光纯药株式会社010-15815
高压灭菌TOMY SEIKO CO.,LTD.LSX-700
溴酚蓝富士胶片和光纯药株式会社021-02911
CaCl2富士胶片和光纯药株式会社038-24985
酪蛋白氨基酸富士胶片和光纯药株式会社393-02145
纤维素酶 R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
糊精水合物富士胶片和光纯药株式会社044-00585
D-山梨醇富士胶片和光纯药株式会社191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020L用于SDS-PAGE预制胶
电泳装置ATTO CORPORATIONWSE-1150用于 SDS-PAGE
FeSO4·7H2O富士胶片和光纯药株式会社098-01085
玻璃滤器 17G3东京玻璃机械株式会社0000094147
甘油富士胶片和光纯药株式会社070-04941
血细胞计数板株式会社藤子521-10
高速冷冻离心机久保田株式会社7780用于50 mL锥形离心管中样品的离心
培养箱TAITEC 公司G·BR-200用于烧瓶液体培养及原生质体的制备
培养箱TAITEC 公司BR-43FL用于微量培养板液体培养和平板培养
KCl富士胶片和光纯药株式会社163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
溶菌酶Sigma-AldrichL1412-10G
MgSO₄4·7H2O富士胶片和光纯药株式会社131-00405
微型制冷离心机久保田株式会社3740用于1.5 mL微量离心管中样品的离心
显微镜徕卡显微系统DMI6000 B
NaCl富士胶片和光纯药株式会社190-13921
NaH2PO4·2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3富士胶片和光纯药株式会社195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
PCR 纯化试剂盒QIAGEN K.K28104
培养皿住友电木有限公司MS-11900用作培养板
聚乙二醇Sigma-AldrichP3640-500G
多肽蛋白胨Becton, Dickinson and Company211910
蛋白标准品伯乐生命科学公司161-0377用作 SDS-PAGE 中的分子量标准蛋白
十二烷基硫酸钠伯乐生命科学公司1610301
无菌滤器默克股份公司SLGP033RB
蔗糖NACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20东京化学工业株式会社T0543
尿苷Sigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio 公司T017

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