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方法文章

使用自动化成像系统测量iPSC的融合度

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DOI：

10.3791/61225

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2020年6月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Rare Diseases Research Division, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, 2Department of Science, University Roma Tre, 3Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS

本文内容

摘要

本实验方案的目的是比较不同的细胞外基质（ECM）包被条件，以评估不同包被方式对诱导性多能干细胞（iPSCs）生长速率的影响。具体而言，我们旨在建立能够实现iPSC培养物最佳生长的实验条件。

摘要

本研究旨在探讨在不同细胞外基质（ECM）包被的基质上培养诱导性多能干细胞（iPSCs）对细胞汇合度的影响。已建立一种无需将细胞消化为单细胞悬液计数即可实时评估iPSC汇合度的方案，以避免对细胞生长造成干扰。采用高内涵图像分析系统，对iPSC在四种不同ECM上随时间变化的汇合度进行自动化评估。通过不同的分析参数评估贴壁iPSC的细胞汇合度，结果表明，无论使用60%、80%还是100%的掩膜，在层粘连蛋白（laminin）条件下24小时和48小时仅观察到轻微差异。此外，我们还发现，与Matrigel、纤连蛋白（vitronectin）和纤维连接蛋白（fibronectin）相比，层粘连蛋白能够实现最佳的细胞汇合效果。

引言

诱导性多能干细胞（iPSCs）来源于体细胞，可分化为不同类型的细胞。它们常被用作疾病发病机制研究或药物筛选的模型系统，同时也具有应用于个体化医学的潜力。由于iPSCs具有巨大的应用前景，因此对其进行全面表征以确保其作为可靠模型系统的有效性至关重要。我们此前已证明，在低氧环境中培养iPSCs的重要性，因为这些细胞依赖糖酵解，而富氧环境可能导致氧化还原失衡1。iPSCs对其他培养条件也较为敏感，尤其是细胞外环境。优化培养条件是维持其健康状态和增殖能力的关键问题。健康的iPSC培养将产生健康的分化细胞，而这些分化细胞通常是用于理解特定人类疾病或细胞过程的分子、细胞及功能特征的模型终点。

本研究采用一种简单方案，通过在不同孔中使用不同的包被条件来检测诱导性多能干细胞（iPSCs）的汇合度。iPSCs 需要小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层才能正常贴壁，但 iPSCs 与 MEF 共存使得诸如 RNA 或蛋白质提取等分析难以进行，因为存在两种细胞群体。为避免使用饲养层，已采用多种属于细胞外基质（ECM）的蛋白质来重建天然细胞微环境，从而实现无饲养层的 iPSC 培养。其中，Matrigel 是从 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜制剂，富含细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、连环蛋白/巢蛋白）以及生长因子2,3。其他所用的包被条件则是已知在构建 ECM 中具有重要作用的纯化蛋白：层粘连蛋白-521 已知由人类多能干细胞（hPSCs）在胚胎内细胞团中分泌，是出生后人体中最常见的层粘连蛋白之一4,5,6,7,8,9,10,11；纤连蛋白是一种异源因子-free 的细胞培养基质，已被证实可支持 hPSC 的生长与分化12,13,14,15,16；纤维连接蛋白是一种对脊椎动物发育至关重要的 ECM 蛋白，对于胚胎干细胞的贴附及其维持在多能状态方面也具有重要作用17,18,19,20,21,22,23,24,25。由于存在多种不同的包被条件，我们比较了它们对 iPSCs 汇合度的影响。

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方案

1. 包被96孔板

注意：在同一块板的不同孔中测试了不同的涂层（参见补充文件）。

  1. 用DMEM将Matrigel按1:100稀释。每孔加入100 µL至96孔板中，室温孵育1小时。随后吸除溶液，用100 µL PBS洗涤各孔 DMEM 洗涤两次。
  2. 用 PBS（含钙和镁）将层粘连蛋白（20 µg/mL，LN-521）稀释，每孔加入 100 µL，4 °C 过夜孵育。次日用 DMEM 洗涤两次，然后接种细胞。
  3. 将玻连蛋白（10 µg/mL）用稀释缓冲液稀释，每孔加入100 µL至96孔板中，室温孵育1小时。接种细胞前，用不含钙和镁的PBS洗涤各孔。
  4. 将 HU-Fibronectin (30 µg/mL) 用 ddH₂O 稀释2O. 每孔加入100 µL，室温孵育45分钟。随后用培养基洗涤各孔，再进行细胞接种。

2. iPSCs 的培养维持

注意：iPSCs 为商业购买获得。这些 iPSCs 来源于健康的人类成纤维细胞，并使用附加体型技术进行重编程。

  1. 从-80 °C冰箱或液氮中取出冻存的iPSCs，在37 °C水浴中解冻。在将细胞冻存管移入生物安全柜前，用70%乙醇擦拭管壁。
  2. 将细胞悬液用1000 µL移液器逐滴加入含有5 mL预热细胞培养基（如mTeSR1）的15 mL无菌锥形管中。
  3. 以 304 x 离心细胞 g 室温（RT）下孵育5分钟。
  4. 吸除培养基，将细胞沉淀重悬于4 mL细胞培养基中。
  5. 将细胞悬液接种至6孔板的两个孔中（105 每6孔细胞培养板接种iPSCs之前，预先接种小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。在接种iPSCs前两天，以2.4的密度接种MEFs x 104/cm2 在DMEM（含10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素）中。
  6. 接种后，在细胞培养基中加入10 µM ROCK抑制剂Y-27632。
  7. 将iPSCs在MEFs上培养前4-5周，随后转为无饲养层条件（即无MEF条件），使用感兴趣的包被材料之一（参见步骤1及 表1) 在 mTeSR1 中。
  8. 当iPSCs融合度达到70-80%时，使用0.5 mM EDTA在室温下处理3-5分钟，按1:4比例传代。每6孔板加入1 mL 0.5 mM EDTA（其他规格培养板按比例调整用量）。转移至新的无饲养层条件培养孔中，于37 °C、5% CO2、20% O2条件下培养。 O2.  
  9. 每天更换新鲜的mTeSR1培养基，每2天传代一次细胞。

3. 细胞汇合度的表征

  1. 实验使用96孔板。
  2. 在无饲养层条件下培养至少1个月后，每孔接种10,000个细胞，以确保实验所用细胞未经过小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）传代。使用一次性细胞计数板 在光学显微镜下对细胞进行计数。
  3. 实验设置三个重复组，即每种接种条件需在三个孔中进行测试。
  4. 从接种后的第1天开始，使用细胞计数仪在明场模式下进行自动图像采集。此后每24小时进行一次自动图像采集，持续5天。有关实验参数的详细信息，请参见补充文件。
  5. 启用自动对比度和自动曝光功能，以更清晰地观察细胞。
  6. 设置汇合度分析参数（见补充文件），对每个孔分别应用60%、80%和100%的掩膜，以评估因孔边缘光折射所导致的焦点变化。使用上述不同掩膜分析设置，对每个时间点的细胞汇合度进行分析。

4. 统计分析

  1. 以均值 ± 均值标准误（SEM）的形式报告定量结果。
  2. 为比较不同包被条件之间的总体差异，应使用相同的样本进行数据收集，并进行学生氏配对样本 t 检验。小于 0.05 的 P 值被认为具有统计学显著性，所有报告的 p 值均为双侧。

5. 细胞骨架微丝的表征

  1. 在室温下用含4%多聚甲醛（4% PFA）的PBS固定细胞10分钟，随后用PBS洗涤两次，共10分钟。
  2. 每孔加入100 µL封闭液（由5% BSA和0.1% Triton溶于PBS中配制而成），室温孵育1小时。
  3. 移除封闭液，用PBS洗涤样品两次，每次10分钟。
  4. 每份样品加入100 µL鬼笔环肽-偶联工作液，室温孵育1小时。
  5. 用PBS洗涤细胞两次，每次10分钟，室温进行。
  6. 用PBS按1:10000稀释Hoechst 33342对细胞核染色，室温孵育10分钟。
  7. 移除Hoechst染色液，用PBS洗涤细胞两次，每次10分钟。
  8. 用H2O洗涤样品，并在化学通风橱中自然干燥。
  9. 加入100 µL封片介质（如PBS:甘油，1:1）覆盖细胞，以保持样品的荧光信号。
  10. 使用配备白光激光器（WLL）和405 nm半导体激光器的激光共聚焦显微镜，在激发/发射波长493/517 nm下观察细胞。采用HC PLAPO 40x油镜依次采集共聚焦图像。所有样品均使用相同的激光功率、分束器、滤光片设置、针孔直径和扫描模式。

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结果

本研究中，我们探究了在不同包被条件下培养的诱导多能干细胞（iPSCs）的汇合度。通过使用细胞计数仪，我们能够在5天内以三复孔形式快速获得具有参考价值的结果。由于iPSCs难以直接贴附于塑料培养器皿表面，必须依赖包被层以支持其增殖，因此我们选择监测人源iPSCs的汇合度，因其可反映细胞培养的健康状态，并可能提示其分化潜能。体外扩增后，我们将iPSCs接种于不同的细胞外基质（ECM）基底上，并通过明场成像观察样本图像，同时结合鬼笔环肽染色（用于标记肌动蛋白纤维，即F-actin）分析细胞，以评估其在器皿表面的贴附情况（图1）。事实上，鬼笔环肽染色可直观显示细胞对器皿表面的贴附程度，从而反映其对特定包被材料的适应性。贴附良好的细胞展现出清晰可辨的细胞骨架微丝结构，而未良好贴附的细胞则呈现微丝塌陷形态。明场观察与鬼笔环肽染色结果相结合，证实iPSCs在包被表面上具有良好的贴附能力。

为研究细胞汇合情况，我们分别使用Matrigel、LN-521、vitronectin和Hu-fibronectin将iPSCs以三复孔接种，并重复实...

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讨论

诱导多能干细胞（iPSCs）在疾病建模、未来药物筛选以及其在精准医学中的潜在应用，使其成为一项极具重要性的技术。正因如此，我们认为有必要清楚地了解能够更好地模拟胚胎干细胞生理状态的体外培养条件。在此背景下，我们利用 野生型iPSCs测试了不同的细胞外基质（ECM）包被条件，以明确能够维持细胞处于健康且未分化状态的培养环境。此外，一个关键问题是iPSCs培养过程中使用MEF和Matrigel中的异源成分，这可能导致技术重复之间的实验变异性，从而阻碍机制性研究的开展26。

在本研究中，我们使用高内涵图像分析细胞仪检测了诱导多能干细胞（iPSCs）在无异种源性基质（即LN-521、Vitronectin、人源纤维连接蛋白Hu-Fibronectin）上的汇合度。采用自动图像分析系统的原因在于，若使用台盼蓝排斥法进行细胞计数，则需要制备单细胞悬液，而这对iPSCs的操作并不推荐，因为iPSCs应以细胞簇形式传代以避免细胞死亡。通过高内涵图像分析获得的数据使我们能够在不干扰细胞的情况下连续监测细胞汇合情况，仅需在5天内每天对细胞成像一...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由C.C.获得的博米诺杰苏基金会和现行研究项目（意大利卫生部）资助。  我们谨向恩里科·贝尔蒂尼博士（Bambino Gesù儿童研究医院神经科学部神经肌肉与神经退行性疾病实验室，分子医学实验室）、斯特凡尼娅·佩特里尼博士（Bambino Gesù儿童研究医院研究实验室共聚焦显微镜核心设施）以及朱莉娅·佩里科利表示感谢 （儿童保健医院Bambino Gesù肿瘤血液科，基因与细胞治疗中心）) 以及Roberta Ferretti（肿瘤血液学、基因与细胞治疗科，意大利博米诺·杰苏儿童研究医院）) 感谢各位就科学问题和专业技术提供的讨论与帮助。Maria Vinci 获得了“英国儿童癌症基金会”的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 移液管，聚苯乙烯材质， individually 纸/塑料包装，无菌Corning4488工具
15 mL 高透明度聚丙烯（PP）锥形离心管Falcon352097工具
1× PBS（含 Ca2+；Mg2+）Thermofisher14040133培养基
1× PBS（不含 Ca2+；Mg2+）EurocloneECB4004L培养基
5 mL 移液管，聚苯乙烯材质， individually 纸/塑料包装，无菌Corning4487工具
细胞培养微孔板，96 孔，聚苯乙烯，平底Greiner Bio One655090耗材
细胞培养板，6 孔Costar3516耗材
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基，高糖）SigmaD5671培养基
EDTASigmaED4SS-500g试剂
Epi 附加体质粒 iPSC 重编程试剂盒InvitrogenA15960试剂
FAST - READ 102BiosigmaBVS100工具
胎牛血清（FBS）Gibco10270106培养基
纤连蛋白MerckFC010包被物
甘油SigmaG5516试剂
H2OMILLIQ
HoechstThermofisher33342试剂
Laminin 521Stem Cell Technologies77003包被物
L-谷氨酰胺（200 mM）GibcoLS25030081试剂
MatrigelCorning Matrigel hESC-Qualified Matrix354277包被物
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）Life TechnologiesA24903包被物
MTESR1 培养基Stem Cell Technologies85851培养基
MTESR1 添加剂Stem Cell Technologies85852培养基
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122试剂
鬼笔环肽SigmaP1951试剂
玻璃粘连蛋白Stem Cell Technologies7180包被物
Y-27632SigmaY0503试剂

参考文献

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