使用自动化成像系统测量iPSC的融合度

摘要

本实验方案的目的是比较不同的细胞外基质（ECM）包被条件，以评估不同包被方式对诱导性多能干细胞（iPSCs）生长速率的影响。具体而言，我们旨在建立能够实现iPSC培养物最佳生长的实验条件。

摘要

本研究旨在探讨在不同细胞外基质（ECM）包被的基质上培养诱导性多能干细胞（iPSCs）对细胞汇合度的影响。已建立一种无需将细胞消化为单细胞悬液计数即可实时评估iPSC汇合度的方案，以避免对细胞生长造成干扰。采用高内涵图像分析系统，对iPSC在四种不同ECM上随时间变化的汇合度进行自动化评估。通过不同的分析参数评估贴壁iPSC的细胞汇合度，结果表明，无论使用60%、80%还是100%的掩膜，在层粘连蛋白（laminin）条件下24小时和48小时仅观察到轻微差异。此外，我们还发现，与Matrigel、纤连蛋白（vitronectin）和纤维连接蛋白（fibronectin）相比，层粘连蛋白能够实现最佳的细胞汇合效果。

引言

诱导性多能干细胞（iPSCs）来源于体细胞，可分化为不同类型的细胞。它们常被用作疾病发病机制研究或药物筛选的模型系统，同时也具有应用于个体化医学的潜力。由于iPSCs具有巨大的应用前景，因此对其进行全面表征以确保其作为可靠模型系统的有效性至关重要。我们此前已证明，在低氧环境中培养iPSCs的重要性，因为这些细胞依赖糖酵解，而富氧环境可能导致氧化还原失衡¹。iPSCs对其他培养条件也较为敏感，尤其是细胞外环境。优化培养条件是维持其健康状态和增殖能力的关键问题。健康的iPSC培养将产生健康的分化细胞，而这些分化细胞通常是用于理解特定人类疾病或细胞过程的分子、细胞及功能特征的模型终点。

本研究采用一种简单方案，通过在不同孔中使用不同的包被条件来检测诱导性多能干细胞（iPSCs）的汇合度。iPSCs 需要小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层才能正常贴壁，但 iPSCs 与 MEF 共存使得诸如 RNA 或蛋白质提取等分析难以进行，因为存在两种细胞群体。为避免使用饲养层，已采用多种属于细胞外基质（ECM）的蛋白质来重建天然细胞微环境，从而实现无饲养层的 iPSC 培养。其中，Matrigel 是从 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜制剂，富含细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、连环蛋白/巢蛋白）以及生长因子²

方案

1. 包被96孔板

注意：在同一块板的不同孔中测试了不同的涂层（参见补充文件）。

1. 用DMEM将Matrigel按1:100稀释。每孔加入100 µL至96孔板中，室温孵育1小时。随后吸除溶液，用100 µL PBS洗涤各孔 DMEM 洗涤两次。
2. 用 PBS（含钙和镁）将层粘连蛋白（20 µg/mL，LN-521）稀释，每孔加入 100 µL，4 °C 过夜孵育。次日用 DMEM 洗涤两次，然后接种细胞。
3. 将玻连蛋白（10 µg/mL）用稀释缓冲液稀释，每孔加入100 µL至96孔板中，室温孵育1小时。接种细胞前，用不含钙和镁的PBS洗涤各孔。
4. 将 HU-Fibronectin (30 µg/mL) 用 ddH₂O 稀释₂O. 每孔加入100 µL，室温孵育45分钟。随后用培养基洗涤各孔，再进行细胞接种。

2. iPSCs 的培养维持

注意：iPSCs 为商业购买获得。这些 iPSCs 来源于健康的人类成纤维细胞，并使用附加体型技术进行重编程。

1. 从-80 °C冰箱或液氮中取出冻存的iPSCs，在37 °C水浴中解冻。在将细胞冻存管移入生物安全柜前，用70%乙醇擦拭管壁。
....

结果

本研究中，我们探究了在不同包被条件下培养的诱导多能干细胞（iPSCs）的汇合度。通过使用细胞计数仪，我们能够在5天内以三复孔形式快速获得具有参考价值的结果。由于iPSCs难以直接贴附于塑料培养器皿表面，必须依赖包被层以支持其增殖，因此我们选择监测人源iPSCs的汇合度，因其可反映细胞培养的健康状态，并可能提示其分化潜能。体外扩增后，我们将iPSCs接种于不同的细胞外基质（ECM）基底上，并通过明场成像观察样本图像，同时结合鬼笔环肽染色（用于标记肌动蛋白纤维，即F-actin）分析细胞，以评估其在器皿表面的贴附情况（图1）。事实上，鬼笔环肽染色可直观显示细胞对器皿表面的贴附程度，从而反映其对特定包被材料的适应性。贴附良好的细胞展现出清晰可辨的细胞骨架微丝结构，而未良好贴附的细胞则呈现微丝塌陷形态。明场观察与鬼笔环肽染色结果相结合，证实iPSCs在包被表面上具有良好的贴附能力。

为研究细胞汇合情况，我们分别使用Matrigel、LN-521、vitronectin和Hu-fibronectin将iPSCs以三复孔接种，并重复实.......

讨论

诱导多能干细胞（iPSCs）在疾病建模、未来药物筛选以及其在精准医学中的潜在应用，使其成为一项极具重要性的技术。正因如此，我们认为有必要清楚地了解能够更好地模拟胚胎干细胞生理状态的体外培养条件。在此背景下，我们利用 野生型iPSCs测试了不同的细胞外基质（ECM）包被条件，以明确能够维持细胞处于健康且未分化状态的培养环境。此外，一个关键问题是iPSCs培养过程中使用MEF和Matrigel中的异源成分，这可能导致技术重复之间的实验变异性，从而阻碍机制性研究的开展²⁶。

在本研究中，我们使用高内涵图像分析细胞仪检测了诱导多能干细胞（iPSCs）在无异种源性基质（即LN-521、Vitronectin、人源纤维连接蛋白Hu-Fibronectin）上的汇合度。采用自动图像分析系统的原因在于，若使用台盼蓝排斥法进行细胞计数，则需要制备单细胞悬液，而这对iPSCs的操作并不推荐，因为iPSCs应以细胞簇形式传代以避免细胞死亡。通过高内涵图像分析获得的数据使我们能够在不干扰细胞的情况下连续监测细胞汇合情况，仅需在5天内每天对细胞成像一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 移液管，聚苯乙烯材质， individually 纸/塑料包装，无菌	Corning	4488	工具
15 mL 高透明度聚丙烯（PP）锥形离心管	Falcon	352097	工具
1× PBS（含 Ca2+；Mg2+）	Thermofisher	14040133	培养基
1× PBS（不含 Ca2+；Mg2+）	Euroclone	ECB4004L	培养基
5 mL 移液管，聚苯乙烯材质， individually 纸/塑料包装，无菌	Corning	4487	工具
细胞培养微孔板，96 孔，聚苯乙烯，平底	Greiner Bio One	655090	耗材
细胞培养板，6 孔	Costar	3516	耗材
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基，高糖）	Sigma	D5671	培养基
EDTA	Sigma	ED4SS-500g	试剂
Epi 附加体质粒 iPSC 重编程试剂盒	Invitrogen	A15960	试剂
FAST - READ 102	Biosigma	BVS100	工具
胎牛血清（FBS）	Gibco	10270106	培养基
纤连蛋白	Merck	FC010	包被物
甘油	Sigma	G5516	试剂
H2O		MILLIQ
Hoechst	Thermofisher	33342	试剂
Laminin 521	Stem Cell Technologies	77003	包被物
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	LS25030081	试剂
Matrigel	Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	354277	包被物
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）	Life Technologies	A24903	包被物
MTESR1 培养基	Stem Cell Technologies	85851	培养基
MTESR1 添加剂	Stem Cell Technologies	85852	培养基
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	试剂
鬼笔环肽	Sigma	P1951	试剂
玻璃粘连蛋白	Stem Cell Technologies	7180	包被物
Y-27632	Sigma	Y0503	试剂