使用亚细胞室特异性红氧敏感绿色荧光蛋白评估细胞氧化

Summary

该协议描述了对细胞内亚细胞室特异性氧化还原状态的评估。对氧化还原敏感的荧光探针可在完整细胞中方便地进行比例分析。

Abstract

测量细胞内氧化/减少平衡提供了一个有机体的生理和/或病理性红氧状态的概述。硫醇对于通过降低二恶英和氧化二硫化物比来照亮细胞的氧化还原状态尤为重要。工程中含半胱氨酸的荧光蛋白为对氧化还原敏感的生物传感器开启了一个新时代。其中之一，对氧化还原敏感的绿色荧光蛋白（roGFP），可以很容易地引入具有腺病毒转导的细胞中，从而在不中断细胞过程的情况下评估亚细胞室的氧化还原状态。减少的半胱氨酸和氧化的囊肿的roGFP有激发最大值分别在488nm和405nm，发射在525nm。评估这些还原和氧化形式的比率，可以方便地计算细胞内的氧化平衡。在这种方法中，利用不朽的人类三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）来评估活细胞内的红氧状态。协议步骤包括MDA-MB-231细胞线转导与腺病毒，以表达细胞状roGFP，治疗与_H2O_2，并评估半胱氨酸和半胱氨酸比与流动细胞学和荧光显微镜。

Introduction

1985年，赫尔穆特·西斯将氧化应激定义为"对前者的益氧化剂-抗氧化剂平衡的干扰^"1，并进行了大量的研究，^,以获得生物^1、2、32的疾病、营养和衰老特异性氧化还原状态。¹³从那时起，对氧化应激的理解变得更加广泛。测试使用抗氧化剂对抗疾病和/或衰老的假设表明，氧化应激不仅造成伤害，而且在细胞中还有其他作用。此外，科学家已经表明，自由基在信号转导²中起着重要的作用。所有这些研究都加强了确定大分子还原氧化（氧化）比变化的重要性。酶活性、抗氧化剂和/或氧化剂以及氧化产物可以通过各种方法进行评估。其中，确定二醇氧化的方法可以说是最常用的方法，因为它们报告了细胞中的抗氧化剂和益氧化剂以及生物体⁴之间的平衡。具体来说，谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽二硫化物（GSSG）和/或半胱氨酸（CyS）/半胱氨酸（CySS）之间的比率被用作生物标志物，用于监测生物体的氧化还原状态^2。

用于测量益氧化剂和抗氧化剂之间的平衡的方法主要依赖于细胞内还原/氧化蛋白或小分子的水平。西方印迹和质谱法用于广泛评估还原/氧化大分子（蛋白质、脂质等....

Protocol

注:此协议针对 70%-80% 的汇入 MDA-MB-231 单元进行了优化。对于其他细胞系，应重新优化细胞数量和感染数 （MOI）。

1. 细胞的制备（第1天）

1. 在75厘米²瓶中保持MDA-MB-231细胞系，在5%CO₂加湿的大气中补充10%的胎儿牛血清（FBS）， 补充10%的胎儿牛血清（FBS）。
   注:DMEM 补充了 10% FBS、37 °C 和 5% CO₂加湿气氛，用于整个协议中的所有附件和治疗孵化。
2. 准备MDA-MB-231单元进行实验。
   2. 
      
   4. 
      

1. 
   
   
4. 
   

Results

CyS/CySS 的氧化还原状态可通过转导的 roGFP 轻松测定。荧光探针量化还原和氧化形式之间的比率（激励波长分别为 488 nm 和 405 nm）。荧光数据可以通过流细胞学和显微镜获得。

使用流细胞测定，可以一致、方便地获得大量细胞。分析包括3个主要步骤:1）使用FSC区域滤波器选择感兴趣的细胞群（图1A）;2） 用前 488/em 为 roGFP 表达细胞进行门。525 nm 带带通滤波器（图 1B）;和3） 用前405nm/em从roGFP表达细胞中封闭含氧化的roGFP细胞。525 nm 带通滤波器 （图 1C）。

应评估每个新细胞系，以实现roGFP的最佳腺病毒转导效率。通过流动细胞测定和/或荧光显微镜对细胞进行形态评估和roGFP表达分析，评估转导效率。该协议使用流细胞测定来确定 roGFP 分析的剂量响应曲线，并选择最有效的 MO.......

Discussion

生物体中的硫醇/二硫化物平衡反映了细胞的氧化还原状态。生物有谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋白质三醇和低分子量三醇，所有这些都受到氧化水平的影响，并呼应细胞的氧化状态^4。工程性 roGfP 允许通过其 CyS 残留物⁷对硫醇/二硫化物平衡进行无中断定量。roGFP 的比值特性为哺乳动物细胞提供了可靠的氧化还原测量。roGFP可以很容易地引入细胞与转染方法和/或转导载体，但腺病毒转导具有更高的效率。

细胞的红氧状态很容易受到细胞环境（例如细胞的汇合和介质体积）的影响。对于该协议，优化的细胞播种汇合率确定为60%~70%，每厘米215，000细胞;²在分析当天，细胞是70%~80%的汇。然而，细胞形态和倍增时间在细胞系之间是不同的。因此，如果研究人员打算使用另一个细胞系，则应在获取流细胞测定和/或荧光显微镜测量时调整细胞汇合;这将确保基于其实验设计和需求的准确结果。

roGFPs 可轻松引入具有多种转染方法和/或转导载体的细.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	细胞培养
4 孔室载玻片	Thermo Scientific	154526	用于荧光成像的细胞接种材料
5 mL 带细胞过滤器盖的试管	Falcon	352235	用于流式细胞分析的单细胞悬浮管
6 孔板	Corning	353046	用于流式细胞术分析的细胞接种材料
15 ml 锥形管	MidSci	C15B	细胞培养
75 cm2 通风盖组织培养瓶	康宁	4306414	细胞培养
腺病毒胞质溶胶特异性 roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP 构建体由 Schumaker 博士友情提供
II 级、A2 型安全罩柜	Thermo Scientific	1300 系列 A2	细胞培养
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen	C10227	细胞计数
Countess 细胞计数仪腔室载玻片	Invitrogen	C10283	细胞计数
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	细胞培养
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	细胞培养
带滤芯的移液器吸头，无菌，20 & 微量;l	Fisherbrand	02-717-161	细胞培养
过滤移液器吸头，无菌，1000 &l	Fisherbrand	02-717-166	细胞培养
流式细胞仪	BD Biosciences	LSRFortessa	配备 FITC 和 BV510 带通滤光片的仪器，用于流式细胞术分析
显微镜	高级显微镜组 （AMG）	Evos FL	荧光成像
过氧化氢 30%	Fisher Scientific	H325-100	阳性对照
光立方，定制	生命科学	CUB0037	表达 roGFP 细胞的荧光成像（ex 405 nm）
光立方，GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	表达 roGFP 的细胞的荧光成像（ex 488 nm）
MDA-MB-231	美国组织培养保藏中心	HTB-26	人上皮性乳腺癌细胞系
离心管，2 ml	Grenier Bio-One	623201	细胞培养
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	细胞培养
移液器控制器	Drummond	Hood Mate 360 型	细胞培养
学移液管，1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	细胞培养
血清学移液管，5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	细胞培养
血清学移液管，10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	细胞培养
组织培养箱	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 细胞培养箱
台盼蓝染色剂 0.4%	Invitrogen	T10282	细胞计数