本方案描述了细胞内亚细胞区室特异性氧化还原状态的评估方法。一种对氧化还原敏感的荧光探针可实现对完整细胞进行便捷的比率分析。
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摘要
摘要
测量细胞内氧化/还原平衡可提供生物体生理和/或病理生理氧化还原状态的总体情况。巯基（硫醇）尤其重要，可通过其还原态二硫醇与氧化态二硫键的比例来揭示细胞的氧化还原状态。含有半胱氨酸的基因工程荧光蛋白为氧化还原敏感型生物传感器开辟了新时代。其中一种名为氧化还原敏感型绿色荧光蛋白（roGFP），可通过腺病毒转导轻松导入细胞，从而在不干扰细胞正常过程的情况下评估亚细胞区室的氧化还原状态。roGFP的还原态半胱氨酸和氧化态胱氨酸的激发峰分别位于488 nm和405 nm，发射光为525 nm。通过测定这两种还原态与氧化态形式的比值，可方便地计算细胞内的氧化还原平衡。在本方法文章中，采用永生化的人类三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）来评估活细胞内的氧化还原状态。实验步骤包括：利用腺病毒对MDA-MB-231细胞系进行转导以表达胞质roGFP，用H2O2处理细胞，并通过流式细胞术和荧光显微镜检测半胱氨酸与胱氨酸的比值。
引言
1985年，Helmut Sies将氧化应激定义为“促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡向促氧化剂方向发生紊乱”1，此后，大量研究致力于获取与疾病、营养和衰老相关的生物体特异性氧化还原状态1,2,3。自此以后，人们对氧化应激的理解不断拓展。针对使用抗氧化剂治疗疾病和/或延缓衰老的假说进行的测试表明，氧化应激不仅会造成损伤，还在细胞中具有其他重要作用。此外，科学家已证实自由基在信号转导过程中发挥着重要作用2。所有这些研究都进一步凸显了测定大分子氧化还原（redox）比例变化的重要性。酶活性、抗氧化剂和/或氧化剂以及氧化产物可通过多种方法进行评估。其中，测定巯基氧化状态的方法 arguably 是应用最广泛的，因为它们能够反映细胞乃至整个生物体内抗氧化剂与促氧化剂之间的平衡4。具体而言，谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）以及/或半胱氨酸（CyS）与胱氨酸（CySS）之间的比例被用作监测生物体氧化还原状态的生物标志物2。
用于检测促氧化剂与抗氧化剂之间平衡的方法主要依赖于细胞内还原态/氧化态蛋白质或小分子的水平。通过蛋白质印迹法和质谱法可广泛评估还原态/氧化态大分子（如蛋白质、脂质等）的比例，而GSH/GSSG比例则可通过分光光度法进行测定5。这些方法的一个共同特点是需要通过细胞裂解和/或组织匀浆对体系进行物理扰动。当需要测量不同细胞区室的氧化状态时，这些分析方法也变得具有挑战性。所有这些操作均会在检测环境中引入人为假象。
氧化还原敏感的荧光蛋白开启了一个有利的时代，使得在不干扰细胞的情况下评估氧化还原平衡成为可能6。这些蛋白可靶向不同的细胞内区室，从而能够定量分析特定区室的活性（例如，检测线粒体和细胞质的氧化还原状态），以研究细胞器之间的相互作用。Meyer 及其同事综述了黄色荧光蛋白（YFP）、绿色荧光蛋白（GFP）和 HyPeR 蛋白6。在这些蛋白中，氧化还原敏感型 GFP（roGFP）具有独特性，因其 CyS（激发 488 nm/发射 525 nm）和 CySS（激发 405 nm/发射 525 nm）残基产生不同的荧光信号，从而可进行比率分析，而其他氧化还原敏感蛋白（如 YFP）则不具备此特性7,8。比率输出具有重要价值，因为它能够抵消表达水平差异、检测灵敏度变化以及光漂白带来的影响8。通过改造 roGFP，可使其靶向细胞的不同亚细胞区室（如细胞质、线粒体、细胞核）或不同生物体（包括细菌和哺乳动物细胞）7,9,10。
roGFP检测采用荧光成像技术进行，尤其适用于实时可视化实验。对于设定好时间点的实验，也可使用流式细胞术对roGFP进行分析。本文描述了如何利用荧光显微镜和流式细胞术，通过腺病毒转导在过表达细胞质定位roGFP的哺乳动物细胞中，进行氧化还原状态的比率测定。
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方案
注意：本实验方案已针对汇合度为 70%–80% 的 MDA-MB-231 细胞进行优化。对于其他细胞系，应重新优化细胞数量和感染复数（MOI）。
1. 细胞准备（第1天）
- 在37 °C、5% CO2的湿润环境中，使用10 mL添加10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在75 cm2培养瓶中培养MDA-MB-231细胞系。
注意：在整个实验方案中，所有细胞贴壁和处理孵育步骤均使用添加10% FBS的DMEM，在37 °C、5% CO2的湿润环境中进行。 - 准备MDA-MB-231细胞用于实验。
- 吸除培养瓶中的培养基，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞2 min，随后加入6 mL完全培养基（含10% FBS的DMEM）终止胰酶活性。以150 × g离心5 min，吸除上清液，将细胞重悬于5 mL完全培养基中。
- 取等体积的细胞悬液与0.4%台盼蓝混合。吸取10 µL混合液，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
注意：也可使用库尔特计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。 - 将细胞接种至6孔板中用于流式细胞术分析，每孔接种150,000个细胞，加入1 mL培养基。孵育16 h以使细胞贴壁。
- 将细胞接种至4孔细胞培养腔载玻片中用于荧光成像，每孔接种25,000个细胞，加入0.5 mL培养基。孵育16 h以使细胞贴壁。
注意：除处理组孔外，还需设置对照孔。可使用一个对照孔确定细胞数量（可选：若细胞贴壁时间短于其倍增时间，则细胞数量可视为与接种密度相同），另一个对照孔作为未感染对照（0 MOI）。
2. 腺病毒 roGFP 转导（第2天和第3天）
警告：腺病毒可引起疾病。在转导细胞时，应使用带滤芯的吸头，并用10%次氯酸钠溶液对吸头、巴斯德吸管和微量离心管进行去污染处理。
注意：本方案以细胞质特异性 roGFP 为例进行演示，但相同方案也可用于靶向其他细胞区室（例如线粒体或线粒体膜间隙）。
- 通过计算转导 MDA-MB-231 细胞系所需每种 MOI 值对应的腺病毒体积（mL），生成 MOI 的剂量-反应曲线，以获得最高的转导效率（表 1）：
注意：每批腺病毒原液的功能性滴度（以每毫升空斑形成单位，PFU 表示）由公司提供。不同细胞类型的最优 MOI 各不相同。对于大多数哺乳动物细胞，最优 MOI 范围在 10 至 300 之间。根据细胞反应，应重新计算 MOI 值（例如，若细胞出现细胞毒性反应，则应降低 MOI 范围；若转导效率较低，则应提高 MOI 范围）。 - 用细胞培养基（含 10% FBS 的 DMEM）将 6 × 1010 PFU/mL 的腺病毒 roGFP 溶液稀释 100 倍，以便准确移液。
- 分别向 6 孔板的各孔中移取并加入 0.0125 mL（12.5 µL）、0.025 mL（25 µL）和 0.05 mL（50 µL）的腺病毒 roGFP 稀释液，使 150,000 个细胞分别以 50、100 和 200 MOI 进行转导，用于流式细胞术分析（表 1）。
- 向 4 孔腔室载玻片的各孔中移取并加入 0.0042 mL（4.2 µL）的腺病毒 roGFP 稀释液，使 25,000 个细胞以 100 MOI 进行转导，用于荧光成像（表 1）。
注意：孔中应使用最少体积的培养基，以确保腺病毒 roGFP 载体与细胞之间的最大接触。由于高浓度血清可能对某些细胞类型的转导效率产生负面影响，因此可能需要根据不同细胞系调整培养基中的血清含量。 - 在细胞维持条件下孵育细胞 16–24 小时。次日（第 3 天），更换为细胞培养基（含 10% FBS 的 DMEM），使细胞再恢复培养 24 小时。在显微镜下观察细胞形态；即使细胞出现形态学变化，也可能表达 roGFP。
注意：第 3 天时，细胞应开始表达 roGFP；因此，可使用荧光显微镜（激发 488 nm，发射 525 nm 滤光片）监测转导效率。为获得一致的实验结果，在评估转导效率时，应注意并记录相差显微镜下的形态学变化，并同时观察细胞形态。 - 利用步骤 2.3 中制备的 50、100 和 200 MOI 样品及其通过流式细胞术分析获得的转导效率结果（步骤 3.1 和 4.1），构建剂量-反应曲线。结合形态学变化记录（步骤 2.5）和 MOI 的剂量-反应曲线，评估最佳转导效率。
注意：尽管在 100 MOI 和 200 MOI 条件下，超过 98% 的细胞群体表达 roGFP（见代表性结果），但 200 MOI 组的 MDA-MB-231 细胞形态学变化显著。因此，确定 MDA-MB-231 细胞的最佳有效 MOI 为 100 MOI。 - 在确定 MDA-MB-231 细胞系的最佳 MOI（此处为 100 MOI）后，使用测试物质（10 µM H2O2 及其溶剂 0.1% 去离子水）进行实验。
- 按照第 1 节所述准备并接种细胞。根据步骤 2.1 中计算的 100 MOI 腺病毒转导体积，重复步骤 2.2–2.4，对细胞进行 100 MOI 的腺病毒转导。然后按照步骤 2.5 孵育培养板和腔室载玻片。
3. 胱氨酸/胱氨酸平衡的获取
- 流式细胞术（第4天）
- 在第4天，将步骤2.7.1中的细胞与10 µM H2O2共孵育1小时。
注意：本方案中使用10 µM H2O2作为测试物质，0.1%去离子水作为溶剂对照处理。其他氧化剂也可在此作为阳性对照使用。 - 吸除6孔板中的培养基，加入750 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，等待2分钟使细胞脱落。加入2 mL完全培养基（含10% FBS的DMEM）以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。
- 在4ºC下以150 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 重复步骤3.1.3
- 使用40 µm滤膜将细胞悬液过滤至适用于流式细胞术的试管中。将试管置于冰上并避光保存，并按照步骤4.1进行数据分析。
- 在第4天，将步骤2.7.1中的细胞与10 µM H2O2共孵育1小时。
- 显微成像（第4天）
- 在第4天，用10 µM H2O2处理细胞，立即采集图像（0时间点）以及处理后1小时的图像，并按照步骤4.2进行数据分析。
4. 数据分析
- 流式细胞术定量分析
- 通过样本采集软件（参见 材料表）设置流式细胞仪的三种不同分析方法：前向散射光（FCS）设为横轴，侧向散射光（SSC）设为纵轴，用于评估细胞大小和细胞复杂性（SSC 可用于粗略区分死细胞与活细胞）；例如，将激发波长 488 nm/发射波长 525 nm（异硫氰酸荧光素 [FITC]）的带通滤光片设为横轴，SSC 设为纵轴，用于检测 CyS-roGFP；再例如，将激发波长 405 nm/发射波长 525 nm（ Brilliant Violet 510 [BV510]）的带通滤光片设为横轴，SSC 设为纵轴，用于检测 CySS-roGFP。
- 采集 0 MOI 对照组样本，并使用样本采集软件观察细胞。对剩余样本（50、100、200 MOI 组，以及后续的 10 µM H2O2 处理组和溶剂对照组）重复此步骤。保存文件以供数据分析。
- 打开数据分析软件（参见 材料表），载入 0 MOI 样本文件。确定目标细胞群体（门控 1）。利用未感染的对照细胞（0 MOI）对激发波长 488 nm/发射波长 525 nm（门控 2）和激发波长 405 nm/发射波长 525 nm（门控 3）的带通滤光片设置门控，以最小化背景荧光。
- 在数据分析软件中打开 50、100 和 200 MOI 样本文件，以评估剂量-反应曲线。使用门控 2 和门控 3 分析各样本的平均荧光强度。对测试样本（10 µM H2O2 处理组和溶剂对照组）重复此步骤。
- 使用以下公式计算 roGFP 氧化形式与还原形式之间的平均荧光强度比值。
- 图像评估
- 使用配备适用于 CyS-roGFP 和 CySS-roGFP 的荧光滤光片的显微镜（例如，激发波长 488 nm/发射波长 525 nm 和激发波长 405 nm/发射波长 525 nm 的滤光片）。
- 在腔室载玻片的每个孔中，选择 4 个随机区域进行成像，使用 4 倍物镜观察较大区域。
注意：也可使用 20 倍物镜进行图像展示。 - 使用 ImageJ 软件11打开图像。对每幅图像应用分析 | 测量命令，并使用步骤 4.1.5 中的公式对数据进行定量分析。
注意：图像定量采用比值法；因此，本方案不包括背景扣除。然而，为了能够比较图像，每幅图像的亮度、对比度和饱和度必须保持一致。统计学显著性通过单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 事后检验进行评估。
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结果
利用转导的roGFP探针可轻松检测CyS/CySS的氧化还原状态。该荧光探针可定量还原形式与氧化形式之间的比率（激发波长分别为488 nm和405 nm）。荧光数据可通过流式细胞术和显微镜成像两种方法获取。
使用流式细胞术可以稳定且方便地获取大量细胞。分析过程包括三个主要步骤：1）使用FSC面积过滤器选择目标细胞群体（图1A）；2）使用488 nm激发/525 nm发射的带通滤光片对表达roGFP的细胞进行设门（图1B）；3）使用405 nm激发/525 nm发射的带通滤光片从表达roGFP的细胞中进一步筛选出含氧化态roGFP的细胞（图1C）。
每种新的细胞系都应评估其 roGFP 的最佳腺病毒感染效率。应通过细胞形态学评估以及流式细胞术和/或荧光显微镜对 roGFP 表达的分析来评价感染效率。本方案采用流式细胞术测定 roGFP 分析的剂量-反应...
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讨论
生物体内的巯基/二硫键平衡反映了细胞的氧化还原状态。生物体含有谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋白质巯基以及低分子量巯基化合物，这些成分均受氧化水平的影响，从而反映细胞的氧化还原状态4。经基因工程改造的 roGFP 可通过其 CyS 残基实现对巯基/二硫键平衡的无干扰定量检测7。roGFP 的比率型特性为哺乳动物细胞提供了可靠的氧化还原测量手段。roGFP 可通过转染方法和/或转导载体轻松导入细胞，但腺病毒转导的效率更高。
细胞的氧化还原状态容易受到细胞环境的影响（例如细胞汇合度和培养基体积）。本方案中，优化的细胞接种汇合度确定为60%–70%，每平方厘米接种15,000个细胞。2；在分析当天，细胞融合度为70%–80%。然而，不同细胞系的细胞形态和倍增时间存在差异。因此，若研究者拟使用其他细胞系，应在使用流式细胞术和/或荧光显微镜进行检测时调整细胞融合度；此举可确保根据其实验设计和需求获得准确结果。
roGFP 可通过多...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
用于在细胞中表达细胞质特异性 roGFP 的质粒构建体及重组腺病毒分别由西北大学弗莱贝格医学院 Paul T. Schumacker 博士实验室和 ViraQuest 公司制备。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所生物医学研究卓越中心（COBRE NIGMS）资助的“癌症治疗宿主反应研究中心”项目 P20GM109005、国家普通医学科学研究所系统药理学与毒理学培训项目 T32 GM106999、阿肯色大学医学科学分校基金会/医学研究捐赠奖 AWD00053956 以及阿肯色大学医学科学分校年终校长奖 AWD00053484 的支持。流式细胞术核心设施部分得到了 COBRE NIGMS 资助的“微生物致病机制与宿主炎症反应研究中心”项目 P20GM103625 的支持。本研究内容仅由作者负责，不代表 NIH 的官方观点。ATA 获得了土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）2214-A 奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | 细胞培养 |
| 4孔板载玻片 | Thermo Scientific | 154526 | 用于荧光成像的细胞接种材料 |
| 带细胞筛盖的5 ml离心管 | Falcon | 352235 | 用于流式细胞术分析的单细胞悬液管 |
| 6孔板 | Corning | 353046 | 用于流式细胞术分析的细胞接种材料 |
| 15 ml锥形离心管 | MidSci | C15B | 细胞培养 |
| 75 cm2通气盖组织培养瓶 | Corning | 4306414 | 细胞培养 |
| 腺病毒介导的细胞质特异性roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP质粒由Schumaker博士惠赠 |
| II级A2型生物安全柜 | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | 细胞培养 |
| Countess全自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10227 | 细胞计数 |
| Countess细胞计数仪专用载玻片 | Invitrogen | C10283 | 细胞计数 |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | 细胞培养 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 细胞培养 |
| 带滤芯移液器吸头，无菌，20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | 细胞培养 |
| 带滤芯移液器吸头，无菌，1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | 细胞培养 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | LSRFortessa | 配备FITC和BV510带通滤光片的流式细胞分析仪器 |
| 荧光显微镜 | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | 荧光成像 |
| 30%过氧化氢 | Fisher Scientific | H325-100 | 阳性对照 |
| 定制光源立方体 | Life Sciences | CUB0037 | roGFP表达细胞的荧光成像（激发波长405 nm） |
| GFP光源立方体 | Thermo Scientific | AMEP4651 | roGFP表达细胞的荧光成像（激发波长488 nm） |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | 人乳腺癌上皮细胞系 |
| 微量离心管，2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | 细胞培养 |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | 细胞培养 |
| 移液控制器 | Drummond | Hood Mate Model 360 | 细胞培养 |
| 血清学移液管，1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | 细胞培养 |
| 血清学移液管，5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | 细胞培养 |
| 血清学移液管，10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | 细胞培养 |
| 组织培养孵箱 | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2细胞培养孵箱 |
| 0.4%台盼蓝染液 | Invitrogen | T10282 | 细胞计数 |
参考文献
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