用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

摘要

本文介绍了一种从成熟脂肪细胞中分离细胞核、通过荧光激活分选进行纯化以及在单细胞水平上进行转录组学分析的实验方案。

摘要

棕色脂肪和米色脂肪是特殊的脂肪组织，可通过依赖解偶联蛋白1（UCP1）和非依赖UCP1的途径以耗散能量的方式进行产热。直到最近，产热型脂肪细胞一直被视为一个同质的细胞群体。然而，近期研究表明，存在多种在发育起源、底物利用和转录组特征上各不相同的亚型或细胞亚群。尽管单细胞基因组学已取得进展，但由于充满脂质的脂肪细胞结构脆弱，将脂肪组织无偏地分解为不同细胞亚型仍具挑战性。本方案旨在通过高效地从脂肪组织中分离单个细胞核，用于包括RNA测序在内的下游应用，从而克服上述困难。随后可利用RNA测序及生物信息学分析来研究细胞异质性。

引言

研究表明，棕色脂肪组织（BAT）具有显著的能量消耗能力。在啮齿类动物和人类中均存在两种具有不同发育特征的产热型脂肪细胞：米色脂肪细胞和经典的棕色脂肪细胞。经典的棕色脂肪细胞主要位于肩胛间BAT储存部位，而米色脂肪细胞则在某些生理信号（如长期寒冷暴露）刺激下，零星出现在白色脂肪组织（WAT）中，这一过程被称为"褐变"或"米色化"。借助先进的成像技术，现已明确成人含有大量UCP1⁺ BAT，尤其在锁骨上区域^1,2,3,4。成人BAT的含量与脂肪含量呈负相关，并可通过外界刺激（如长期寒冷暴露^5,6或β3-肾上腺素能受体激动剂⁷）而增加。BAT介导的能量消耗可能为对抗肥胖提供一种可行的策略。

直到最近，产热型脂肪细胞一直被视为一个同质性的细胞群体。然而，研究发现存在多种在发育起源、底物利用和转录组方面各不相同的亚型或亚群^8,

方案

动物护理和实验操作均按照阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理与使用委员会批准的程序进行。

1. 组织消化和裂解缓冲液的配制

1. 配制组织消化缓冲液。
   1. 每克脂肪组织配制约 1 mL 消化缓冲液。
   2. 称取 1.5 U/mL 胶原酶 D 和 2.4 U/mL 中性蛋白酶 II，加入磷酸盐缓冲液（PBS）中。
2. 配制细胞核制备缓冲液（NPB）。
   1. 在无核酸酶水中配制含 10 mM HEPES、1.5 mM 氯化镁、10 mM 氯化钾、250 mM 蔗糖和 0.1% NP-40 的溶液，充分混匀。蔗糖溶解所需时间可能长于其他组分。
3. 配制 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液。
   1. 在含 EDTA 的 PBS 中配制 0.5% BSA 溶液。建议使用经无菌过滤的细胞培养级 PBS（见材料表）。

2. 脂肪组织的酶消化

1. 根据 Aune 等人的方法解剖小鼠以提取脂肪组织¹³。将分离的组织收集到含有 PBS 的培养皿中。将组织转移至滤纸上吸干，然后放入洁净的培养皿中。
2. 向消化缓....

结果

未分选的脂肪细胞核中含有碎片和双细胞核，这会在后续的单细胞RNA测序中产生噪声和高背景信号。典型的流式细胞分选门控策略如图1所示。首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）对细胞核进行初步筛选（A）；接着，仅根据SSC的宽度和高度组合参数选择单细胞核（B）；最后，仅选择DAPI阳性事件，并将其分选至收集缓冲液中（C）。该工作流程可获得高纯度的单细胞核，最大限度地减少细胞核聚集体和细胞碎片（图2）。

为确认分选后细胞核的完整性，取少量样品经DAPI染色后在显微镜下观察。细胞核膜应保持完整，细胞核呈圆形（图2B）。为验证纯化效果，还建议在.......

讨论

本文介绍了一种简单且稳健的分离单细胞核并研究脂肪组织异质性的方法。与全组织RNA测序相比，该实验流程能够无偏倚地揭示细胞异质性及特定细胞群体的标志物。该方法对脂肪细胞生物学、分子代谢以及肥胖研究的发展具有重要意义和创新性。

该方案特别针对snRNA-seq的下游应用进行了优化。 "纯化" 使用MoFlo XDP高速分选仪实现健康细胞核分离的步骤可完全去除粗悬液中的碎片和聚集体，同时保持核膜完整性。因此，该方法提高了液滴生成过程中的捕获效率，单次运行即可获得数千个单核转录组，且不影响检测到的基因数量。除了基于液滴的单细胞平台外，基于分选仪的微孔板平台和Fluidigm C1平台¹⁵ 也可用于获得转录组更高分辨率和更全面的覆盖¹⁶由于该工作流程可获得高质量的细胞核，因此只需对现有的单细胞ATAC测序（scATAC-seq）方案进行最小修改，即可开展基于测序的转座酶可及性染色质分析（即ATAC-测序）。¹⁷.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
autoMACS 冲洗液	Miltenyi Biotec	130-091-222	含EDTA的PBS；经无菌过滤
BSA	Sigma	A1595
CaCl2	Sigma	21115
细胞滤器 100 μm	康宁	431752
细胞滤器 40μm	康宁	431750
CellTrics (30 μm)	希森美康	04-004-2326
胶原酶D	罗氏	11088866001
Countess II FL 全自动细胞计数仪	Invitrogen	AMQAF1000
DAPI	Sigma	D9542
Dispase II	罗氏	4942078001
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Fisher	P217-3
MACS SmartStrainer（30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458	可堆叠滤光片
MgCl2	Sigma	M1028
MoFloXDP 细胞分选仪	贝克曼库尔特	ML99030
NP-40	Sigma	74385
Protector RNase抑制剂	罗氏	3335402001
蔗糖	Fisher	S5-3