该方法可对软煤（即氧化和未氧化的褐煤及次烟煤）、腐殖酸矿石和页岩、泥炭、堆肥以及商品肥料和土壤改良剂中的干态和液态样品，以无灰基为基础，对腐殖物质（如腐殖酸和富里酸）进行重量法定量分析。
本文内容
摘要
摘要
本方法旨在准确、精确地测定软煤、腐殖矿石和页岩、泥炭、堆肥以及含腐殖物质的商业产品中腐殖酸（HA）和/或富里酸（FA）的浓度。该方法基于使用0.1 N NaOH作为提取剂，对测试材料进行碱性提取，并通过离心将碱溶性腐殖物质（HS）与不溶性产物分离。随后，用浓HCl将离心后的碱性提取液pH调节至1，使HA沉淀析出。通过离心将沉淀的HA与富里酸组分（FF）（即仍保留在溶液中的HS部分）分离。然后将HA进行烘箱干燥或冷冻干燥，并测定干燥后HA的灰分含量。纯HA（即无灰分）的质量除以样品质量，所得分数乘以100，即得样品中HA的百分含量。为测定FA含量，将FF加载到疏水性DAX-8树脂上，该树脂吸附FA组分（也称为疏水性富里酸，HFA）。随后用去离子H2O洗涤树脂，去除未吸附的组分，即非富里酸组分（也称亲水性富里酸组分，HyFF），直至所有未吸附物质完全去除。然后用0.1 N NaOH将FA解吸下来。所得的钠型富里酸（Na-fulvate）再通过强H+-交换树脂进行质子化，得到FA。将所得FA进行烘箱干燥或冷冻干燥，测定其灰分含量，并按照上述HA的计算方法确定其在样品中的浓度。
引言
腐殖质（HS）是微生物分解和转化死亡植物组织后产生的动态残留物1,2,3，并在此过程中掺入微生物副产物和生物量3,4,5，该过程被称为腐殖化6。腐殖质广泛存在于土壤、天然水体、湖泊沉积物、泥炭、软煤及腐殖页岩中，约占地球总有机碳的25%7。这类物质是由数千种独特分子组成的复杂混合物，根据其在强碱性和酸性水溶液中溶解度的不同，可分为三个主要组分：腐殖酸（HAs），即碱溶性但酸不溶性组分；富里酸（FAs），即在碱和酸中均可溶解的组分；以及胡敏素组分，在所有pH值条件下均不溶解6,8。富里酸组分（FF）可进一步划分为疏水性富里酸（HFA）和亲水性富里酸（HyFA）两个亚组分。这两个亚组分的定义依据是：FF中能够结合到疏水性DAX-8树脂上的部分为HFA，不能结合到树脂上的部分为HyFA。
腐殖酸（HS）在农业中的应用日益广泛，常被用作作物生物刺激素；在畜牧业中，特别是作为牲畜饲料添加剂；在采矿业中用于钻井泥浆；在环境修复中则作为电子穿梭体。此外，腐殖酸在人类医学应用方面的研究也正在不断增加。
目前存在多种测定腐殖酸（HA）和富里酸（FA）的方法。然而，这些方法大多既不准确也不精确。例如，在美国最常用的两种测定HA的方法是比色法9和加利福尼亚州食品与农业部（CDFA）方法，这两种方法均被证明会高估来自美国西部和加拿大的多种矿石及提取物中HA的含量10。比色法或分光光度法之所以不准确，是因为其依赖于碱性提取液在特定波长下的吸光度，而该提取液中除HA外还含有FA及其他发色团，它们均会在所用波长下产生吸收，且所用标准品并不能代表被测样品的实际组成10。CDFA方法也不准确，因其未以无灰基为基础提供HA浓度。由于不同矿石的灰分含量不同，部分灰分会在提取过程中被带入，且提取过程本身也会引入灰分，因此该方法无法准确反映HA的实际浓度10。为满足对准确且精确方法的需求，2014年发布了一种基于文献11所述的标准化重量分析法，用于在无灰基基础上定量测定HA和FA12。随后，国际标准化组织（ISO）于2018年对该方法进行了小幅修改，并将其纳入《肥料和土壤调理剂》标准中，命名为“肥料材料中腐殖酸和疏水性富里酸浓度的测定”13。
本文概述了提取和定量腐殖酸及疏水性富里酸的实验方案，并详细说明了该方法所产生的数据的准确性和精密度。
方案
1. 固体样品制备
- 使用研钵和研杵将约 5 g 待分析样品研磨，确保研磨后的样品 100% 通过美国标准筛网 200 号（即 74 µm），并充分混匀粉末。
- 通过重量法测定粉末的水分含量。
- 称量一个铝制称量舟，记录其质量（Wwb）。
- 将约 2 g 样品粉末转移至称量舟中，记录总质量（Wws+wb）。
- 将称量舟置于干燥烘箱中，在 102 °C 下干燥 24 h（温度不得超过 102 °C）。24 h 后，从烘箱中取出称量舟，放入干燥器中冷却至少 1 h。
- 称量并记录称量舟与干燥后样品粉末的总质量（Wds+wb）。
- 使用公式 1.1 计算水分含量。
公式 1.1 固体样品粉末的水分含量
% 水分 = (((Wws+wb - Wwb) – (Wds+wb - Wwb)) / (Wws+wb - Wwb)) * 100
2. 提取步骤
- 固体样品
- 称取约 2.5 g 过筛后的 样品粉末（Wsamp），放入塑料或铝制称量舟中，并将重量记录至小数点后四位。
- 将样品转移至 1 L 量筒中，并用 0.1 M NaOH（4 g NaOH x L-1）定容至 1 L。
- 加入一根磁力搅拌子（例如，长度为 5 - 7 cm），在搅拌器上快速搅拌（即 300 – 400 rpm），直至样品充分混匀。
- 将量筒中的全部内容物转移至一个 1 L 锥形瓶中，用 N2 气体抽除瓶内顶空空气，并用气密盖密封瓶口。
- 将锥形瓶置于搅拌器上，在 300 - 400 rpm 条件下搅拌 16 - 18 小时。
- 液体样品
- 对于液体材料，通过振荡充分混匀样品，确保测试液体均匀混合。务必使可能沉降至容器底部的任何残留物也充分混匀。
- 称取约 5 g 测试液体（精确至小数点后四位，记为 WTL），加入 1 L 量筒中。
- 用 0.1 M NaOH 将量筒定容至最终体积 1 L。
- 加入一根磁力搅拌子（例如，长度为 5 – 7 cm），在搅拌器上快速搅拌（例如，300 - 400 rpm），直至测试样品完全混匀。
- 将混合液转移至 1 L 锥形瓶中，用 N2 气体抽除顶空空气，并用气密盖密封瓶口。
- 将锥形瓶置于搅拌器上，在 300 - 400 rpm 条件下搅拌 1 小时。
注：此后，固体样品与液体样品的处理步骤相同。
3. 从碱性提取物中去除不溶性物质
- 搅拌结束后，将烧瓶从搅拌器上取下，将混合物转移至合适的离心管中，并以 4,921 × g 离心 30 分钟。
- 收集含有 HA 和 FA 的碱性上清液，转移至一个洁净的 1 L 锥形瓶中，瓶内放置磁力搅拌子。弃去不溶性物质。若离心后仍有残余颗粒未沉淀，建议通过玻璃棉或孔径为 2.5 µm 的定性滤纸进行过滤。
4. 从发酵液中沉淀并分离透明质酸
- 在搅拌板上以 300 - 400 rpm 的速度搅拌碱性提取液时，将 pH 探针垂直插入溶液中段，逐滴加入浓 HCl，直至溶液达到稳定的 pH 值 1.0 ± 0.1。
- 当 pH 值达到 pH 1 并保持稳定后，将 pH 探针从烧瓶中取出，取出搅拌子，用密封盖盖住烧瓶，静置至沉淀的腐殖酸（HA）完全沉降至烧瓶底部。
注意：腐殖酸（HA）沉淀并从溶液中析出所需的时间取决于样品中腐殖酸的来源和含量，通常需要 1 - 6 小时才能完全沉淀。 - 将提取液及沉淀的腐殖酸（HA）在 4921 × g 条件下离心 1 小时。离心结束后，将上清液（FF）倾入洁净的 1 L 锥形瓶中，并用密封盖盖好。
注意：可能需要更长的离心时间，以确保腐殖酸（HA）充分压实，从而在倾倒上清液（FF）时避免混入任何沉淀的腐殖酸（HA）。 - 将离心管置于 100 °C 的干燥烘箱中干燥 24 小时。
- 干燥完成后，将离心管从烘箱中取出，放入干燥器中冷却至室温。冷却后，用刮刀将管壁和管底的残留物彻底刮下，定量转移至已去皮的称量舟中，称重并记录质量（WEHA）。该残留物即为“提取的腐殖酸（HA）”。
注意：若在腐殖酸（HA）与上清液（FF）分离过程中使用了大于 50 mL 的离心管，则可将沉淀的腐殖酸（HA）转移至耐高温的 50 mL 离心管中进行干燥。此外，若有冻干机，也可对沉淀的腐殖酸（HA）进行冷冻干燥。冻干状态下的腐殖酸（HA）更易于收集，因其不会黏附在塑料管壁上，无需刮取。
5. 灰分含量的测定
注意：测定干燥的HA和FA样品中灰分含量的步骤相同。此处以HA的表示法展示该步骤。
- 将约30 mg干燥的HA（WHA）转移至一个洁净且已预先称重的陶瓷皿（WCD）中，该陶瓷皿此前已在100 °C的干燥烘箱中烘干，并在干燥器中冷却至室温。记录HA与陶瓷皿的总质量（WHA+CD）后，将HA在马弗炉中于600 °C下灼烧2小时。
注意：每份HA样品应进行三个重复实验，并取平均灰分含量用于纯HA的计算。 - 2小时后，将陶瓷皿及其内容物从马弗炉中取出，放入干燥器中冷却。冷却后，称量含灰分的陶瓷皿质量（WASH+CD），并使用公式1.2计算灰分比率（Ashrat）：
公式1.2 Ashrat = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)
6. 纯化提取的HA纯度百分比的测定
- 使用公式 1.3，根据灰分含量校正，计算纯 HA 的最终质量（WPHA）：
公式 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat）
7. 测定原始来源样品中纯透明质酸（HA）的浓度（%）
- 使用公式 1.4 和 1.5 确定纯 HA 的浓度：
公式 1.4：固体样品中纯 HA 的百分比 = (WPHA/Wsamp) × 100
公式 1.5：液体样品中纯 HA 的百分比 = (WPHA/WTL) × 100
8. HFA 纯化的柱制备
- 准备一个装有聚甲基丙烯酸甲酯 DAX-8 树脂的低压色谱柱。如果树脂此前未使用过，需先将其在甲醇中浸泡 2 小时，然后用去离子 H2O 充分冲洗，直至完全去除甲醇。
- 此时去除漂浮在水面上的细小树脂颗粒。如果树脂此前已使用过，则按照第 10 节所述方法进行再生。
- 彻底冲洗后，将树脂倒入一根尺寸为 5 × 25 cm 的玻璃色谱柱中，柱底端配有带 10 µm 烧结滤板的端件以支撑树脂床。在柱顶部预留 2.5 至 5 cm 的无树脂空间，以便 FF 溶液在进入树脂床前充分混合。将上端件安装到色谱柱上，并通过蠕动泵从柱顶泵入去离子 H2O，以压实 DAX-8 树脂床。
9. HFA 的分离
- 树脂床装填完成后，通过柱子顶部使用蠕动泵在低压条件下将FF上样至柱中，流速为35–40 mL/min。在整个上样和洗涤过程中，必须确保柱内树脂顶部始终被溶液覆盖，以防止树脂干燥以及提取物在树脂床中产生沟流。
- 当富里酸组分完全上样至树脂后，通过蠕动泵在低压下从柱顶泵入去离子水洗涤树脂，以去除未吸附的“亲水性富里酸组分”（HyFF）。流速为35–40 mL/min。弃去含HyFF的流出液，除非该液体将用于后续分析。
- 用去离子H2O洗涤柱子，直至柱流出液在350 nm处的吸光度与用于洗涤柱子的去离子H2O的吸光度相等（例如，相差在0.015吸光度单位以内）。使用去离子水对分光光度计进行调零（即作为空白）。
- 通过蠕动泵从柱子底部泵入0.1 M NaOH，进行反向洗脱以解吸HFA，流速为35–40 mL/min。收集泵流出液（即Na-富里酸盐），置于洁净且容量足够大的容器中（例如2 L锥形瓶）。
注意：大部分HFA吸附在DAX-8树脂床的最上层。从柱子底部引入0.1 M NaOH进行解吸，可最大限度减少完全解吸富里酸所需的0.1 M NaOH用量。 - 当柱流出液在350 nm处的吸光度与0.1 M NaOH进样液的吸光度相等时，表明所有HFA均已解吸。使用0.1 M NaOH作分光光度计空白。将用于检测解吸后富里酸溶液吸光度的流出液一并加入收集液中，以确保所有富里酸均被回收。
10. 通过质子化进行HFA脱灰
- 将黄腐酸钠溶液反复通过装有强阳离子 H+-交换树脂（材料表）的 5 × 50 cm 层析柱（柱底带有玻璃砂芯以截留树脂），依靠重力流动，直至流出液的电导率经电导率仪测定低于<120 µS/cm。每次通过前，H+-交换树脂需按照第11节所述进行再生处理。
- 为确保最后一次通过后所有富里酸（FA）均从树脂上被洗脱，用去离子水冲洗树脂，直至流出液在 350 nm 处的吸光度与所用去离子水一致（例如，吸光度差异在 0.015 单位以内）。以去离子 H2O 作为空白对照进行分光光度测定。将冲洗液以及用于检测吸光度的流出液部分全部加入纯化的 FA 溶液中。为有助于完全去除 FA，可在冲洗过程中多次搅动树脂（例如使用长玻璃棒或塑料棒）。
- 使用旋转蒸发仪在 55 °C 下将 FA 浓缩至约 15 ± 2 mL 体积。
- 将 15 mL FA 浓缩液完全转移至一个 50 mL 塑料离心管中，并在 60±3 °C 的烘箱中干燥至恒重。冷冻干燥可作为烘箱干燥的替代方法。干燥完成后，将离心管转移至干燥器中冷却。
- 用刮刀刮下管壁和管底的 FA，收集后置于已去皮的称量纸上称重。所得物质即为“提取的 FA”（WEFA）。
- 按照步骤6中所述方法测定提取 FA 的灰分比（ASHrat），并使用公式 1.2 计算灰分比。使用公式 1.3 计算不含灰分的提取 FA 质量（WPFA），其中将 WEFA 代入 WEHA 的位置。最后，使用公式 1.4 计算样品中纯 FA 的百分含量，将 WPFA 代入 WPHA 的位置。
11. DAX-8 树脂再生
- 通过蠕动泵将0.1 M HCl（8.33 mL浓HCl溶于去离子H2O并定容至1000 mL）以35–40 mL/min的流速从柱底泵入DAX-8树脂，直至流出液pH值与进样液pH值相等，完成树脂再生。再生过程中所有试剂均需使用蠕动泵经DAX-8柱通过。
- 将去离子水从柱顶泵入，冲洗柱子，直至流出液pH值与进样液（即去离子水）pH值一致。
12. H+-阳离子交换树脂的再生
- 通过将H+阳离子交换树脂倒入一个大烧杯（例如，4 L塑料烧杯）中，以去离子H2O覆盖树脂，混匀后倾去水，重复冲洗数次，从而在批次过程中再生树脂。
- 用1 M HCl（83.3 mL浓HCl加去离子水至终体积1000 mL）覆盖树脂。静置至少2小时，期间偶尔搅拌（例如，每30分钟一次）。
- 倾去酸液，用去离子水覆盖树脂，以去除树脂中多余的酸。用玻璃棒剧烈搅拌15秒，待树脂沉降至烧杯底部后倾去水。重复此过程，直至冲洗水的电导率≤ 0.7 µS/cm。
- 将再生后的树脂重新装入层析柱中。用去离子H2O覆盖树脂，确保树脂在使用间隔期间保持湿润。
结果
该方法的性能数据见表1–5。表1给出了从HA和FHA浓度差异较大的液态市售样品中提取HA和FAH的方法精密度。
透明质酸（HA）的相对标准偏差（RSD）低于透明质酸氟代苯甲酰衍生物（HFA），但三种液体样品中HFA的平均RSD为6.83%，表明具有较高的精密度。霍维茨比率（HorRat）是一种标准化的性能参数，用于评估分析方法在实验室间精密度方面的适用性。本文中该参数用于评价实验室内的精密度。HorRat值<0.5可能表明存在未公开的数据平均处理或操作人员对该方法具有高度熟练经验；而值>2.0则提示测试样品存在不均一性、方法需优化或操作人员需接受更全面的培训、检测操作低于检出限，或所用方法不适用。在液体样品分析中，仅有一项HFA分析的HorRat值>2（表1）。
从三种腐殖矿样品中提取HA和HFA的精确性数据见表2。同样，除了从矿样2中提取的HFA和从矿样3中提取的HA外，其余所有HorRat值均低于2。这表明该方法在腐殖矿样品中提取HA和HFA具有较高的精确度。
植物生物刺激剂的生产商通常会配制含有腐植酸（HS）以及其他成分（如海藻、无机肥料、煤炭或糖蜜）的产品。表3给出了对这些类型添加剂的添加情况进行分析的结果，以评估其对方法精密度的影响。这些添加剂均未对腐植酸（HA）或黄腐酸（HFA）的回收率产生显著影响（表3）。
表4 和 表5 分别报告了从模拟商业产品中极低浓度液体样品中回收 HA 和 HFA 的结果。HA 的回收率优异，范围为 88% 至 97%（表4），HFA 的回收率范围为 92% 至 104%（表5）。HA 和 HFA 的平均回收率分别为 93% 和 97%，两种物质的相对标准偏差（% RSD）均小于 5%。尽管精密度良好，但这些数据表明仍需进行实验室重复测定。HA 的方法检出限（MDL）和方法定量限分别为 4.62 和 1.47 mg/L，HFA 的方法检出限和方法定量限分别为 4.8 和 1.53 mg/L。
| 腐殖质，% | |||||||
| 材料 | L16 | L17 | L2 | ||||
| HFA | HA | HFA | HA | HFA | HA | ||
| 重复1 | 1.44 | 17 | 6.59 | 7.76 | 0.36 | 4.46 | |
| 重复2 | 1.39 | 16.03 | 6.25 | 7.79 | 0.42 | 4.93 | |
| 重复3 | 1.34 | 16.44 | 6.02 | 7.55 | 0.4 | 4.46 | |
| 重复4 | 1.54 | 16.75 | 6.2 | 7.69 | 0.33 | 4.53 | |
| 平均值 | 1.43 | 16.56 | 6.27 | 7.7 | 0.38 | 4.6 | |
| 标准差（SD） | 0.09 | 0.42 | 0 | 0.11 | 0.04 | 0.23 | |
| 24 | |||||||
| 相对标准偏差（RSD），% | 6.29 | 2.53 | 3.8 | 1.39 | 10.4 | 4.91 | |
| Hor Rat(r) | 1.58 | 0.72 | 1.25 | 0.47 | 2.31 | 1.55 | |
| a提取条件为1 g样品溶于1 L 0.1 M NaOH溶液中。 | |||||||
表1. 从液体商业样品中提取和定量HA与HFA的方法精密度。 提取条件为1 g样品溶于1 L 0.1 M NaOH中。
| 腐殖质，% | ||||||
| 矿石1 | 矿石2 | 矿石3 | ||||
| 样品 | HFA | HA | HFA | HA | HFA | HA |
| 重复1 | 1.75 | 67.4 | 1.31 | 27.01 | 1.55 | 8.95 |
| 重复2 | 1.69 | 67.63 | 1.25 | 27.48 | 1.41 | 7.2 |
| 重复3 | 1.63 | 67.1 | 1.27 | 27.34 | 1.47 | 8.35 |
| 重复4 | 1.77 | 67.59 | 1.55 | 26.89 | 1.51 | 7.98 |
| 平均值 | 1.71 | 67.53 | 1.35 | 27.18 | 1.49 | 8.12 |
| 标准差（SD） | 0.06 | 0.94 | 0.14 | 0.28 | 0.06 | 0.73 |
| 相对标准偏差（RSD, %） | 3.7 | 1.39 | 10.33 | 1.02 | 4.02 | 9.02 |
| HorRat(r) | 0.99 | 0.66 | 2.71 | 0.42 | 1.07 | 3.09 |
表2. 从腐殖矿石中提取和定量HA与HFA的方法精密度。 提取条件为1 g样品溶于1 L 0.1 M NaOH中。（数据来源于Lamar等，2014）
| 重复组 | 掺杂物 | HA, % | FA, % | HA相对回收率, % | HFA相对回收率, % |
| 1 | 无 | 81.61 | 12.86 | ||
| 2 | 无 | 80.16 | 12.78 | ||
| 1 | 海藻 | 80.21 | 12.85 | ||
| 2 | 海藻 | 80.72 | 12.79 | 99.5 | 99.6 |
| 1 | 肥料 | 80.25 | 12.98 | ||
| 2 | 肥料 | 79.57 | 123.77 | 98.8 | 101.6 |
| 1 | 煤 | 78.79 | 12.92 | ||
| 2 | 煤 | 81.27 | 12.84 | 98.9 | 101.8 |
| 1 | 糖蜜 | 79.38 | 12.99 | ||
| 2 | 糖蜜 | 81.02 | 12.72 | 99.2 | 100.9 |
| 平均值 | 80.3 | 12.85 | |||
| 标准差 | 0.885 | 0.09 | |||
| a 向0.1 M NaOH中添加FA + HA终浓度为2.5 g/L。（数据来自Lamar等，2015） | |||||
表3. 掺杂物对Gascoyne风化褐煤中HA和HFA定量的影响。（数据来自Lamar等，2015）
| HA | |||
| 样品编号 | 提取量，mg | 回收量，mg | 回收率，% |
| 1 | 24.6 | 23.7 | 96.3 |
| 2 | 22.6 | 19.9 | 88.1 |
| 3 | 25.2 | 23.6 | 93.7 |
| 4 | 22.5 | 21.5 | 95.6 |
| 5 | 23.9 | 21.8 | 91.2 |
| 6 | 23.2 | 20.8 | 89.7 |
| 7 | 24 | 23.2 | 96.7 |
| 平均值 | 23.7 | 22.1 | 93 |
| 标准差（SD） | 1.01 | 1.52 | 3.43 |
| 相对标准偏差（RSD），% | 4.35 | 6.88 | 3.67 |
| （数据来源：Lamar 等，2014） | |||
表4. 加标空白样品中HA的回收率。（数据来源：Lamar 等，2014）
| FA | |||
| 样品编号 | 提取量，mg | 回收量，mg | 回收率，% |
| 1 | 19.9 | 19 | 95.48 |
| 2 | 23.1 | 22.9 | 99.13 |
| 3 | 20.7 | 19.4 | 93.72 |
| 4 | 20.5 | 19.8 | 96.39 |
| 5 | 20.8 | 21.6 | 103.85 |
| 6 | 21.9 | 20.1 | 91.78 |
| 7 | 22.7 | 22.3 | 98.24 |
| 平均值 | 21.37 | 20.73 | 96.94 |
| 标准差（SD） | 1.21 | 1.53 | 3.95 |
| 相对标准偏差（RSD），% | 5.64 | 7.36 | 4.07 |
| （数据来源：Lamar 等，2014） | |||
表5. 从加标空白样品中回收HFA。（数据来源：Lamar 等，2014）
讨论
该方法中提取和分离HA的初始步骤相对简单。由于HFA的分离涉及柱层析，因此获得可重复结果的关键在于严格遵循每一步骤的细节并加以实践。特别是树脂的正确制备至关重要。甲基丙烯酸甲酯共聚物DAX-8树脂的正确制备与装填极为重要。树脂装填是否得当直接影响HFA的产率和质量。若存在沟流现象，则HFA的预处理（如酸化）和吸附均无法完全进行，导致分离结果不准确。若在上样前观察到树脂中存在沟道或空隙，应卸下层析柱并轻轻振摇，使树脂珠重新分布并在无沟道的情况下自然沉降，然后通过泵入洁净的去离子水重新装填柱体。2O流经树脂。此外，如方案中所述，在将上清液加载到树脂时，保持液面高于树脂，可使上清液在进入树脂前充分混合，从而实现更有效的吸附。对于强阳离子 H+-交换树脂（材料表），完全再生不能操之过急。Na+/+ 交换需要时间，因此最好进行批量处理，以便在重新酸化过程中混合树脂。用去离子水（DI H₂O）冲洗时混合树脂有助于去除过量的 HCl。在用去离子水洗涤酸化后的树脂以除去多余酸的过程中，混合树脂有助于去除 HCl。必须彻底去除酸，直至电导率降至 ≤ 0.7 µS/cm，这一点极为重要。否则，HCl 将随 HFA 一同被带入后续步骤。
最后，在用DAX-8树脂解吸HFA时，当进液的吸光度等于出液的吸光度后，建议让柱子静置数小时，观察是否会有额外的HFA释放。如果发生这种情况，可在树脂上方液体中观察到变黄现象。一旦出现此现象，可通过继续解吸，直至进液与出液的吸光度再次相等，以去除额外的HFA。
HFA 分离的一个缺点是整个过程耗时较长。HFA 从 DAX-8 树脂上的完全解吸以及从 H+-交换树脂上的彻底去除均会产生较大体积的溶液，必须通过旋转蒸发进行浓缩，这无疑是分析过程中的一个瓶颈。为了缩短时间，有研究建议使用丙酮而非 0.1 M NaOH 从 DAX-8 树脂上解吸 HFA14。作者声称，使用 50% 丙酮代替 NaOH 作为解吸剂，可获得相似的 HFA 结果，且 DAX-8 树脂能够充分再生，因此可省去 H+-交换步骤。由于产生的体积减少，且丙酮比水更易通过旋转蒸发快速去除，该改进显著缩短了分析时间 。这一改进值得进一步研究。
该方法仅限于分析已经过腐殖化过程的有机质，对于泥炭和软煤，则分别为进一步经历了泥炭化过程以及泥炭化与煤化过程的有机质。腐殖化是指死亡的、主要是植物来源的物质，通过一系列微生物逐步分解的过程，这些微生物依次消耗并改造越来越难降解的底物。非生物过程也参与了分解和再合成反应。腐殖化最终产生相对难降解的物质，这些物质由数千种分子组成的异质混合物构成，具有不同分子量以及碳、氧和氢含量，从而形成腐殖物质（HS）。HS 还会进一步受到泥炭化和煤化作用的改造。因此，该方法不适用于经过化学过程改性的植物材料。例如，木质素磺酸盐常被用作腐殖酸肥料（HFA）的掺假物。木质素磺酸盐是亚硫酸盐制浆过程的副产物，因此并非通过腐殖化过程生成。此外，许多其他物质也能与 DAX-8 树脂结合。例如，已有研究使用 DAX-8 树脂从溶液中吸附农药15。显然，农药不属于腐殖物质（HS）。因此，某种物质能与 DAX-8 树脂结合，并不能证明其属于腐殖酸肥料（HFA）。判断的前提必须同时满足两个条件：一是通过腐殖化过程生成，二是能够与 DAX-8 树脂结合。
随着对腐殖酸（HS）各种组分在不同应用中作用的认识不断深入，进一步分离腐殖酸组分并相应地改进方法可能具有优势。目前该方法尚未对羟基富里酸（HYFA）进行定量。然而，该组分也可能具有生物活性，例如在植物生物刺激作用中，通常在农业处理中施用完整的富里酸（FF）组分，而非纯化的羟基富里酸（HFA）。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢腐殖酸产品贸易协会（HPTA）对本研究工作的资助，该资助促成了本文所述方法的标准化；同时感谢 Lawrence Mayhew、Dan Olk 博士和 Paul Bloom 博士在方法标准化过程中提供的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amberlite IR 120 H+-交换树脂 | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ 型 |
| 分析天平 | Ohaus | PA214 | 带玻璃防风罩 |
| 离心机 | Beckman Coulter | Allegra X-14 | 转速不低于4300 rpm |
| 离心管 | Beckman Coulter | 适配所选转子 | |
| 陶瓷燃烧坩埚 | Sigma | Z247103 | |
| DAX-8色谱柱 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| IR 120色谱柱 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
| 干燥器 | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | 真空型 |
| 干燥烘箱 | Fisher Scientific | Isotemp | 精密型，控温精度±3?C |
| 电导率仪 | HM Digital | EC-3 | |
| 锥形瓶 | Amazon | 1 L, 2 L | |
| 浓盐酸（HCl） | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| 磁力搅拌器 | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
| 磁力搅拌子 | 可在多个供应商处购得 | ||
| 马弗炉 | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| 氮气 | Praxair | UNI1066 | 纯度99.99% |
| 蠕动泵 | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| 蠕动泵管 | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH计 | Oakton Instruments | WD-35618--03 | |
| 旋转蒸发仪 | Buchi | R-210/R-215 | |
| 分光光度计 | Healthcare SCiences | Ultrospec II | 双光束，波长范围200至900 nm，波长准确度±1 nm，重复性±0.5 nm。 |
参考文献
- DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils. Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).
- Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin. Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).
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