并行高通量单分子动力学分析用于位点特异性DNA切割

摘要

本文介绍了一种在单分子水平上高通量检测DNA位点特异性切割的实验方法。本方案以限制性内切酶NdeI为例演示了该技术的操作流程。该方法可轻松改造，用于研究任何导致DNA位点特异性切割的生物学过程。

摘要

位点特异性DNA切割（SSDC）是许多细胞过程中的关键步骤，也是基因编辑中的重要环节。本研究描述了一种动力学检测方法，能够同时测量多个单个DNA分子中的SSDC。在微流控流动通道中制备了以磁珠锚定的底物DNA，每个DNA分子仅包含一个拷贝的目标序列。通过外部磁铁对顺磁性磁珠施加微弱拉力。利用宽视野、低倍物镜进行暗场成像，可观测多达1,000个独立DNA分子的完整性。注入限制性内切酶NdeI以启动切割反应。通过视频显微镜观察与DNA相连的磁珠在物镜焦平面中向上移动并消失的帧数，记录每一次DNA切割发生的精确时刻。逐帧统计磁珠数量以量化反应进程，并通过指数拟合确定反应速率。该方法可在单次实验中获得关于单分子SSDC反应的定量且具有统计学意义的数据。

引言

位点特异性DNA切割（SSDC）是许多基因组操作中的关键步骤。例如，细菌的限制-修饰（RM）¹系统和CRISPR²系统通过识别并切割特定序列的外源DNA，保护细胞免受噬菌体和质粒的侵袭。在II型限制-修饰系统中，限制性内切酶（REs）通过蛋白质-核酸相互作用识别短至4–8个碱基对（bp）的序列³。CRISPR相关内切酶（如Cas9）则通过靶位点与结合在内切酶上的crRNA进行杂交，从而结合到特定位置⁴。位点特异性双链断裂（DSBs）的形成也是许多DNA重组事件的第一步⁵。例如，V(D)J重组产生的抗原结合区多样性依赖于对特定靶位点的识别和切割⁶。一些转座子也被证实能够靶向特定的DNA序列⁷。毫不奇怪，参与这些过程的许多位点特异性核酸酶（如Cas9）已成为基因编辑技术的核心组分⁸。此外，人们还人工设计了新型的位点特异性内切酶（如锌指核酸酶⁹和TALENs¹⁰），用于基因组编辑。

已有多种方法被用于测量核酸位....

方案

1. 制备流动池

1. 清洗盖玻片
   1. 将盖玻片放入染色缸中，先用乙醇（EtOH）超声清洗，再用1 M KOH超声清洗，每次各30分钟。为避免KOH在EtOH中析出，每次清洗之间需用ddH₂O充分冲洗。
   2. 重复EtOH和KOH清洗步骤各一次，共完成四次清洗（两次EtOH和两次KOH）。将清洗后的盖玻片保存在染色缸中的ddH₂O中。
2. 使用洁净的剃刀切割加样管和出口管（长度均为8 cm），并插入洁净载玻片上的孔中。进样端使用PE-20管，出样端使用PE-60管。用环氧树脂固定5分钟，以确保管路稳固，并剪去多余部分。
   注：载玻片尺寸为2'' × 3'' × 1 mm。孔成对钻取，间距为15 mm，每对孔构成单个通道的两端。内径较小的管路用作进样端，以减少上游死体积，从而缩短混合时间（图1）。
3. 将预先切割好通道图案的双面胶带对齐并贴附在载玻片的孔位上方，用塑料镊子压平，确保密封良好。
   注：本实验所用双面胶带厚度为120 µm，通道宽度为2 mm，长度为15 mm。通道使用刀片打印机切割（材料表）。单个盖玻片上最多可容纳四个通道。参见 图1 查看流动池的示意图。
4. 撕去背衬后，....

结果

利用该技术，在两种不同浓度的镁离子（2 mM 和 4 mM）条件下，测定了 NdeI 的单链切割（SSDC）速率随蛋白浓度（0.25–4.00 U/mL）的变化。每种实验条件至少重复两次，每次实验包含数百至 1,000 个锚定的 DNA 分子。图 2 描述了实验设计。图 3 展示了数据采集与分析细节的示例。图 4 描述了在两种镁离子浓度下，切割速率随蛋白浓度的变化关系。可以观察到，在足够低的蛋白浓度下，切割速率与蛋白浓度成正比，且不受镁离子浓度影响；而在足够高的蛋白浓度下，切割速率依赖于镁离子浓度，但与蛋白浓度无关。

.......

步骤

描述

讨论

该方案可用于测量任何SSDC系统的动力学过程，前提是实验过程中能够观察到链的分离。通过观察连接珠的脱离来检测切割事件，从而标记链分离的瞬间。所有先前的步骤均发生在切割检测之前；因此，仅记录总的反应时间。

通过将抗体蛋白非特异性吸附到洁净的玻璃表面，对流动池盖玻片进行功能化处理。玻璃表面清洁不充分可能影响抗体的结合。在拴系过程中，微珠密度应足够低，以避免微珠之间发生相互作用。附着位点的表面密度可通过功能化过程中抗体的浓度进行调控。微珠的总数取决于视场的大小。本实验中，数百至1,000个拴系微珠即可获得良好的统计结果，并避免微珠间的相互作用。在注入微珠过程中，通过实时视频监测表面拴系情况。当估计的微珠数量达到500至1,000个时，停止微珠注入。

能够准确测量的最快切割速率受限于流动池的混合时间。层流流动池中的混合时间受多种因素影响。反应物向表面的扩散是一个关键步骤，因此混合时间取决于反应物的扩散系数。在入口管路中会发生显著的剪切，该管路将样品从样品储液池输送至流动通道，这会增加确保反应通道表面充分混合所需的时间。研究发现，通过减.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5分钟环氧树脂	Devcon	14250
抗地高辛素FAB片段	Roche Diagnostics	11214667001
相机及软件	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
数据分析软件	Vernier Inc.	LP
双面胶带	Grace Biolabs	SA-S-1L
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液	Corning	21-031-CV
95%乙醇	VWR	89370-082
正向引物：地高辛素-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
图像分析软件	美国国立卫生研究院	ImageJ
倒置显微镜	Nikon	TE2000
刻刀打印机	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne链霉亲和素磁珠	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI酶	New England Biolabs	R0111S
PCR纯化试剂盒	Qiagen	28104
Pluronic F-127	Anatrace	P305
聚乙烯管PE-20	BD Intramedic	427406
聚乙烯管PE-60	BD Intramedic	427416
Q5预混液	New England Biolabs	M0492S
稀土磁铁 0.5" 外径 0.25" 内径	National Imports	NSN0814
稀土磁铁 0.75" 外径 0.5" 内径	National Imports	NSN0615
反向引物：生物素-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
注射泵	Kent Scientific	Genie Plus
β-酪蛋白（来自牛乳）	Sigma-Aldrich	C6905