并行高通量单分子动力学分析用于位点特异性DNA切割

摘要

本文介绍了一种在单分子水平上高通量检测DNA位点特异性切割的实验方法。本方案以限制性内切酶NdeI为例演示了该技术的操作流程。该方法可轻松改造，用于研究任何导致DNA位点特异性切割的生物学过程。

摘要

位点特异性DNA切割（SSDC）是许多细胞过程中的关键步骤，也是基因编辑中的重要环节。本研究描述了一种动力学检测方法，能够同时测量多个单个DNA分子中的SSDC。在微流控流动通道中制备了以磁珠锚定的底物DNA，每个DNA分子仅包含一个拷贝的目标序列。通过外部磁铁对顺磁性磁珠施加微弱拉力。利用宽视野、低倍物镜进行暗场成像，可观测多达1,000个独立DNA分子的完整性。注入限制性内切酶NdeI以启动切割反应。通过视频显微镜观察与DNA相连的磁珠在物镜焦平面中向上移动并消失的帧数，记录每一次DNA切割发生的精确时刻。逐帧统计磁珠数量以量化反应进程，并通过指数拟合确定反应速率。该方法可在单次实验中获得关于单分子SSDC反应的定量且具有统计学意义的数据。

引言

位点特异性DNA切割（SSDC）是许多基因组操作中的关键步骤。例如，细菌的限制-修饰（RM）¹系统和CRISPR²系统通过识别并切割特定序列的外源DNA，保护细胞免受噬菌体和质粒的侵袭。在II型限制-修饰系统中，限制性内切酶（REs）通过蛋白质-核酸相互作用识别短至4–8个碱基对（bp）的序列³。CRISPR相关内切酶（如Cas9）则通过靶位点与结合在内切酶上的crRNA进行杂交，从而结合到特定位置⁴。位点特异性双链断裂（DSBs）的形成也是许多DNA重组事件的第一步⁵。例如，V(D)J重组产生的抗原结合区多样性依赖于对特定靶位点的识别和切割⁶。一些转座子也被证实能够靶向特定的DNA序列⁷。毫不奇怪，参与这些过程的许多位点特异性核酸酶（如Cas9）已成为基因编辑技术的核心组分⁸。此外，人们还人工设计了新型的位点特异性内切酶（如锌指核酸酶⁹和TALENs¹⁰），用于基因组编辑。

已有多种方法被用于测量核酸位点特异性切割的动力学过程，包括凝胶分析、荧光^11,12以及基于测序的方法¹³。一项重要进展是微珠的固定化技术，该技术通过DNA链断裂后单个DNA分子中微珠的运动来检测双链断裂（DSBs）。在这些方法中，采用不同类型的力以确保切割后DNA链的分离以及微珠的运动。例如，已有研究利用光镊技术测量EcoRV对DNA的切割过程¹⁴。在这些实验中，研究目标是探究靶标搜寻过程，实验条件经过优化，使得位点特异性结合成为限速步骤。光镊技术的一个主要缺点是每次只能观察一条DNA分子，此外，还需周期性施加较大的拉力以检测链的分离情况。

另一种技术利用流体和弱磁力的组合，持续地对微珠施加拉力¹⁵。通过该方法可测量NdeI酶在扩散限制条件下的切割活性。该方法能够同时检测数百个DNA分子，从而在单次实验中获得具有统计学意义的结果。基于磁力镊子的实验也已被采用。在一项研究中，通过在插入用寡核苷酸中引入双链断裂（DSB），对逆转录病毒整合酶进行了分析¹⁶。成功的整合会导致DSB被插入至拴系的DNA中，并使连接的微珠脱落。在另一项针对ATP依赖型III类限制性内切酶EcoPI的研究中，单次实验即可观察数十个DNA分子¹⁷。磁力镊子的优势在于，可在反应过程中精确控制并实时监测施加的张力以及DNA成环状态。

本文介绍了一种高度并行的单分子方法，用于测量SSDC动力学，该方法利用了近年来在大规模DNA锚定技术方面的进展。此方法是对先前用于测量DNA复制¹⁸、DNA轮廓长度¹⁹以及限制性内切酶（REs）切割活性¹⁵等方法的改进与拓展。在该技术中，制备含有单个识别序列拷贝的线性DNA，其一端标记生物素，另一端标记地高辛。生物素与共价连接于顺磁性微珠上的链霉亲和素结合。将DNA-微珠复合物注入已功能化修饰、固定有抗地高辛FAB片段的微流控通道中。DNA通过其末端的地高辛与表面吸附的FAB片段结合，从而实现与表面位点的锚定。通过永磁体施加微弱磁力，防止微珠非特异性地粘附于表面。样品可快速注入（<30 s）流动通道以启动切割反应。在数据采集期间停止流动。每当一条DNA被切割时，可通过记录微珠移出物镜焦平面并从视频记录中消失的帧数，精确确定切割发生的时刻。通过逐帧统计剩余的微珠数量，可定量分析反应进程。

以下是使用 NdeI 的完整实验方案以及收集到的示例数据。作为该技术应用的一个示例，我们在两种不同浓度的镁离子（一种必需的金属辅助因子）条件下，测量了一系列蛋白质浓度下的切割速率。尽管本方案的应用实例使用了 NdeI，但通过调整 DNA 底物的设计，该方法可适用于任何位点特异性核酸酶。

方案

1. 制备流动池

1. 清洗盖玻片
   1. 将盖玻片放入染色缸中，先用乙醇（EtOH）超声清洗，再用1 M KOH超声清洗，每次各30分钟。为避免KOH在EtOH中析出，每次清洗之间需用ddH₂O充分冲洗。
   2. 重复EtOH和KOH清洗步骤各一次，共完成四次清洗（两次EtOH和两次KOH）。将清洗后的盖玻片保存在染色缸中的ddH₂O中。
2. 使用洁净的剃刀切割加样管和出口管（长度均为8 cm），并插入洁净载玻片上的孔中。进样端使用PE-20管，出样端使用PE-60管。用环氧树脂固定5分钟，以确保管路稳固，并剪去多余部分。
   注：载玻片尺寸为2'' × 3'' × 1 mm。孔成对钻取，间距为15 mm，每对孔构成单个通道的两端。内径较小的管路用作进样端，以减少上游死体积，从而缩短混合时间（图1）。
3. 将预先切割好通道图案的双面胶带对齐并贴附在载玻片的孔位上方，用塑料镊子压平，确保密封良好。
   注：本实验所用双面胶带厚度为120 µm，通道宽度为2 mm，长度为15 mm。通道使用刀片打印机切割（材料表）。单个盖玻片上最多可容纳四个通道。参见 图1 查看流动池的示意图。
4. 撕去背衬后，将洁净的盖玻片（用压缩空气吹干）覆盖在胶带上，并再次用塑料镊子压平，确保密封良好。
5. 用环氧树脂密封盖玻片边缘，完成流动池的封装，并静置使其固化。

2. 用于拴系的标记DNA的制备

1. 在PCR管中，准备50 µL的PCR反应混合液，其中包含0.02 U/µL高保真DNA聚合酶、200 µM dNTPs、0.5 µM正向引物、0.5 µM反向引物以及250 ng的M13mp18载体DNA。
   注意：此处选择的正向引物（biotin-CCAACTTAATCGCCTTGC）和反向引物（digoxigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC）用于扩增一段约1,000 bp的区域，该区域跨越M13mp18 DNA环状基因组中第6338至第107位。扩增区域中间含有一个NdeI酶切位点。正向引物的5ʹ端标记有地高辛（digoxigenin），可与盖玻片上的抗地高辛抗体结合；反向引物的5ʹ端标记有生物素（biotin），可与链霉亲和素包被的微珠结合。
2. 将PCR管放入热循环仪中，并按照表1所示的程序进行扩增。
3. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商提供的操作说明纯化PCR产物。
   注意：使用材料表中指定的试剂盒时，典型的DNA产量约为2 µg。

3. DNA与微珠的固定

1. 配制 10 mL 缓冲液 A（1 M Tris-HCl [pH = 7.5]，50 mM NaCl，2 mM MgCl₂，1 mg/mL β-酪蛋白，1 mg/mL Pluronic F-127）。在真空干燥器中脱气至少 1 小时。
2. 为功能化流动池，将 25 µL 抗地高辛 FAB 片段（20 µg/mL）溶于 PBS 中，注入流动通道。使用凝胶加样枪头插入 PE-60 管路中。室温（RT）孵育 30 分钟。
3. 孵育后，用注射器吸取 0.5 mL 缓冲液 A 通过通道冲洗。注意避免将空气引入通道。
4. 功能化完成后，将流动池安装至倒置显微镜上。将出口管连接至注射泵，并将入口管插入盛有缓冲液 A 的微量离心管中。
5. 手动吸取至少 0.5 mL 缓冲液 A 冲洗系统并启动泵。让泵以 10 µL/min 运行至少 5 分钟，以平衡系统。
6. 为准备磁珠（材料表），涡旋混匀磁珠原液瓶，取 1.6 µL 的 10 mg/mL 原液磁珠加入 50 µL 缓冲液 A 中，然后涡旋混匀。
7. 使用磁力分离器，吸除上清缓冲液，并将磁珠重悬于 50 µL 缓冲液 A 中，随后涡旋混匀。
8. 重复步骤 3.7 两次，共洗涤三次。最后一次洗涤时，将磁珠重悬于 100 µL 缓冲液 A 中并涡旋，以获得终浓度为 160 µg/mL 的磁珠悬液。
9. 为形成 DNA-磁珠复合物，首先在缓冲液 A 中配制 480 µL 的 0.5 pM 标记 DNA 底物。然后加入 20 µL 浓度为 160 µg/mL 的磁珠悬液，加样前务必涡旋混匀磁珠。置于旋转仪上孵育 3 分钟。
10. 3 分钟后，立即以约 10 µL/min 的流速将混合物加载至通道中，持续约 15 分钟，或直至观察到足够的磁珠固定。
    注意：磁珠在表面的密度不应过高，以免相互接触（参见讨论部分）。
11. 为洗去所有未结合的游离磁珠，将入口管切换至装有新鲜缓冲液 A 的离心管，并以 50 µL/min 的流速冲洗至少 10 分钟，或直至观察不到松散磁珠为止。

4. 数据收集与分析

1. 为准备数据采集，将进样管放入含有至少 100 µL NdeI（0.25–4.00 U/mL）的缓冲液 A 的微量离心管中。将永久磁铁置于流道上方，并将光源置于偏轴位置以进行暗场成像。
   注意：在数据采集期间，使用悬臂式光学支架将两个粘合在一起的环形稀土磁铁固定在流道活性表面以上 8 mm 处。偏轴照明使用鹅颈灯。
2. 使用商用显微镜、摄像机和数据采集软件（材料表）。在软件中，点击 "曝光" 选项卡，将 "曝光时间" 设置为 10 ms。点击 "时间序列" 选项卡，将 "图像数量" 设置为 600，"持续时间" 设置为 20 分钟，"间隔" 设置为 2 秒。点击 "运行" 以开始数据采集。
3. 在注射泵上，将流速设置为 150 µL/min，注射体积设置为 80 µL。在数据采集开始 1 分钟时按下 "运行"。注射完成后，关闭泵并关闭阀门，以防止数据采集期间发生流动。
4. 数据采集完成后，打开图像分析软件（材料表）。在 "文件" 选项卡下，选择 "导入" | "图像序列"。在弹出菜单中定位图像文件，然后点击 "打开"。
5. 通过在 "图像" 下拉菜单中选择 "调整阈值" 来设置阈值。使用滑动条设置阈值，以识别图像中对应于微珠的亮斑。
6. 通过在 "分析" 下拉菜单中点击 "分析颗粒"，统计每一帧中的亮斑数量。点击 "确定"，然后选择 "是" 以处理所有图像。保存结果文件。
   注意：这将生成一个数据文件，其中包含每个记录视频帧中的微珠数量。
7. 打开数据分析软件（材料表），通过在 "文件" 下拉菜单中点击 "从文本文件导入" 来导入结果文件。绘制微珠数量随时间变化的曲线图。
8. 通过在 "分析" 下拉菜单中点击 "曲线拟合"，对微珠数量随时间的变化进行拟合。选择 "自然指数" 方程，然后点击 "尝试拟合" | "确定"。
   注意：拟合区域应仅包含样品注入后记录的数据。拟合函数指数中的拟合参数即为切割速率。

结果

利用该技术，在两种不同浓度的镁离子（2 mM 和 4 mM）条件下，测定了 NdeI 的单链切割（SSDC）速率随蛋白浓度（0.25–4.00 U/mL）的变化。每种实验条件至少重复两次，每次实验包含数百至 1,000 个锚定的 DNA 分子。图 2 描述了实验设计。图 3 展示了数据采集与分析细节的示例。图 4 描述了在两种镁离子浓度下，切割速率随蛋白浓度的变化关系。可以看出，在足够低的蛋白浓度下，切割速率与蛋白浓度成正比，且不受镁离子浓度影响；而在足够高的蛋白浓度下，切割速率依赖于镁离子浓度，但与蛋白浓度无关。

...

步骤

描述

讨论

该方案可用于测量任何SSDC系统的动力学过程，前提是实验过程中能够观察到链的分离。通过观察连接珠的脱离来检测切割事件，从而标记链分离的瞬间。所有先前的步骤均发生在切割检测之前；因此，仅记录总的反应时间。

通过将抗体蛋白非特异性吸附到洁净的玻璃表面，对流动池盖玻片进行功能化处理。玻璃表面清洁不充分可能影响抗体的结合。在拴系过程中，微珠密度应足够低，以避免微珠之间发生相互作用。附着位点的表面密度可通过功能化过程中抗体的浓度进行调控。微珠的总数取决于视场的大小。本实验中，数百至1,000个拴系微珠即可获得良好的统计结果，并避免微珠间的相互作用。在注入微珠过程中，通过实时视频监测表面拴系情况。当估计的微珠数量达到500至1,000个时，停止微珠注入。

能够准确测量的最快切割速率受限于流动池的混合时间。层流流动池中的混合时间受多种因素影响。反应物向表面的扩散是一个关键步骤，因此混合时间取决于反应物的扩散系数。在入口管路中会发生显著的剪切，该管路将样品从样品储液池输送至流动通道，这会增加确保反应通道表面充分混合所需的时间。研究发现，通过减...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5分钟环氧树脂	Devcon	14250
抗地高辛素FAB片段	Roche Diagnostics	11214667001
相机及软件	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
数据分析软件	Vernier Inc.	LP
双面胶带	Grace Biolabs	SA-S-1L
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液	Corning	21-031-CV
95%乙醇	VWR	89370-082
正向引物：地高辛素-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
图像分析软件	美国国立卫生研究院	ImageJ
倒置显微镜	Nikon	TE2000
刻刀打印机	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne链霉亲和素磁珠	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI酶	New England Biolabs	R0111S
PCR纯化试剂盒	Qiagen	28104
Pluronic F-127	Anatrace	P305
聚乙烯管PE-20	BD Intramedic	427406
聚乙烯管PE-60	BD Intramedic	427416
Q5预混液	New England Biolabs	M0492S
稀土磁铁 0.5" 外径 0.25" 内径	National Imports	NSN0814
稀土磁铁 0.75" 外径 0.5" 内径	National Imports	NSN0615
反向引物：生物素-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
注射泵	Kent Scientific	Genie Plus
β-酪蛋白（来自牛乳）	Sigma-Aldrich	C6905