通过异位细胞系统中的蛋白质聚合测量跨细胞相互作用

Summary

在这里，我们提出了一个优化的协议，使用荧光显微镜快速和半定量测量异质细胞系统中跨体中的配体受体相互作用。

Abstract

细胞接口的蛋白质相互作用决定着从组织发育和癌症进展到突触形成和维持等多种生物结果。许多这些基本相互作用发生在跨，通常是由表达膜锚定结合对的细胞之间的异亲或同亲相互作用引起的。阐明疾病相关突变如何破坏这些基本蛋白质相互作用，可以深入了解无数的细胞生物学领域。许多蛋白质-蛋白质相互作用分析通常不会区分cis和跨相互作用，这可能导致高估体内发生的结合程度，并涉及蛋白质和/或专门监测设备的劳动密集型纯化。在这里，我们提出了一个优化的简单协议，允许只观察和量化跨相互作用，而无需冗长的蛋白质纯化或专用设备。HEK细胞聚合检测涉及两个独立的HIK细胞群的混合，每个细胞都表达膜绑定同质配体。经过短暂的潜伏期后，对样品进行成像，并量化生成的聚合物。

Introduction

突触粘附分子促进的突触相互作用是突触和神经网络生成的发展、组织、规范、维护和功能的基础。这些跨合成细胞粘附分子的识别正在迅速增加:因此，确定结合的伙伴并了解这些新的粘附分子是如何相互作用的，这一点至关重要。此外，基因组测序已经确定了许多这些粘附分子的突变，这些突变通常与多种神经发育、神经精神病和成瘾障碍¹有关。编码突触细胞粘附分子的基因突变可能会有害地改变相互作用，并可能导致突触形成和或维持的病理生理变化。

存在多种测定，以定量评估蛋白质-蛋白质相互作用，如同热热量学，圆形二度，表面质子共振^2， 虽然在性质上定量，他们有几个局限性。首先，它们需要重组蛋白，有时需要漫长而乏味的净化步骤。第二，它们需要先进的专门设备和技术专长。第三，它们可以高估结合的程度，因为它们允许自然系在体内膜上的蛋白质之间的cis和跨相互作用。在这里，我们提出了一个简单和相对快速的检测，专门测试跨交互。

为了规避与纯化蛋白检测相关的许多并发症，我们优化了基于细胞的蛋白质相互作用检测，该检测可以重述减少的异质细胞系统中的跨相互作用。这种检测以前曾以各种形式用于研究细胞相互作用。在此方法中，候选细胞粘附分子被转化为 HEK293T 细胞。在生理条件下，HEK293T细胞没有表现出自我聚合，因此它们成为这种检测的典范。然而，当表达受体和配体的单个 HEK 细胞群组合在一起时，受体和配体的结合会迫使 HEK 细胞聚集发生。此聚合仅通过跨交互进行调解，通常可在数十分钟内观察到。此方法无需蛋白质纯化步骤，该方法的效率依赖于表达认知粘连分子的 HEK 细胞群组合在一起，然后在几十分钟后成像的范式。此外，这种方法相对便宜，因为既不需要抗体，也不需要昂贵的设备。获取数据所需的唯一设备是标准荧光显微镜。这种基于细胞的检测的另一个优点是能够快速筛选疾病相关点突变对跨相互作用的影响。这可以通过用感兴趣的蛋白质突变变异的 cDNA 传染 HEK 细胞来执行。

在此协议中，我们举例说明，我们调查在诊断患有严重智力残疾和癫痫的患者中发现的 Neurexin3® （Neurexin®^A687T）中的误区突变是否改变了与富含白细胞的重复性跨膜蛋白 2 （LRRTM2） 的跨性别相互作用。Neurexin3®是进化保存的先天性细胞粘附分子家族的成员，虽然最近的工作已经确定了突触^{3、4、5、6、7}的多个角色，但我们对这种分子和神经素家族所有成员的突触理解仍然不完整。LRRTM2是一种激发后突触细胞粘附蛋白，参与突触形成和维护^{8，9，10。}重要的是，LRRTM2 专门与缺乏拼接站点 4 替代异位素 （SS4-） 的神经素异形相互作用，但不与包含拼接站点 4 替代异位素 （SS4+） 的神经素异形交互。在Neurexin3®中发现的人类误区突变（A687T）位于一个未经研究的细胞外区域，该区域在进化保存后，在所有α神经素⁷之间保存。随着这两种分子之间的相互作用在^8、9、11之间建立，我们提出了一个问题:Neurexin®SS4-LRRTM2的结合能力是否因A687T点突变而改变？这一分析表明，A687T点突变意外地增强了Neurexin3®与LRRTM2的聚合，表明点突变所在的细胞外区域在调解跨同步相互作用方面发挥作用。

Protocol

1. 细胞培养和变性

1. 使 HEK 细胞介质与 DMEM， 1x （杜尔贝科的鹰的介质的修改） 补充 4.5 克 / 升葡萄糖， L - 谷氨酰胺 + 硫酸钠和 10% Fbs 。无菌过滤器。
2. 预先确定合适的配体和受体进行聚合检测。
   注:Neurexin3+SS4+/-及其已知的配体之一LRRTM2用于本研究。在 pcDNA3.1 中，cDNA 表示了兴趣的连体和受体。吉布森组件用于将纽雷辛3®插入pcDNA3.1^12。纽雷辛3+F/R:塔塔格塔格特格塔格塔格特加特克卡卡特加特卡特卡特克塔茨克塔克特克特克
   加加格克茨加塔卡特克特加塔塔卡特加特加特加
3. 准备 HEK293T 细胞。
   1. 将 HEK293T 细胞生长到一个 T-75 烧瓶中。
   2. 一旦汇合，使用2 mL的试金石，并放置在37°C孵化器2分钟。将 6 mL 的 HEK 介质添加到烧瓶中以重新悬浮细胞，并将所有 8 mL 转移到 15 mL 圆锥管中。
   3. 500 x g 的颗粒为 5 分钟，在 HEK 细胞介质中重新悬浮，共 8 mL。
   4. 数细胞，在6井板的每口井中加入735，000个细胞。使用 HEK 细胞介质将每口井的最终体积调整为 2 mL。
   5. 放置在37°C的孵化器中，让细胞在一夜之间生长，或直到它们达到50-60%的结合。
4. 使用磷酸钙方法¹³转染 HEK293T 细胞。
   1. 与1微克荧光蛋白（pcDNA3.1-神经素^3+WT SS4-和1微克的mCherry）共同感染3微克的蛋白质。
   2. 与第 1.4.1 步一样， 转染井 2 。但与兴趣的突变蛋白（pcDNA3.1-纽瑞辛^3®A687T SS4-）。
   3. 与另外一种荧光蛋白的 1 微克 （pcDNA3.1 LRRTM2 和 GFP 的 1μg） 一起与 3 μg 的兴趣配体进行转染。
   4. 转染好 4 和井 5 作为负控制: 井 4 与 1 μg 的 Gfp 和井 5 与 1μg 的 mcherry 。
   5. 如果需要附加条件或控制（Neurexin®3^WT/A687T SS4+），则准备另一个板材（如步骤 1.4.1-1.4.4）。
      注:在表观荧光显微镜下进行24小时转位后24小时进行变性效率分析，并量化为表达其转染的荧光蛋白的细胞数量。更简化的方法将包括用双晶向量编码的 HEK 细胞的转染，以获得荧光蛋白和感兴趣的配体，并且强烈建议在共转体上方进行。在本研究中，阿尔法神经素为~4.3 kb，使用需要共同分流的双晶体系统观察到荧光强度低。
5. 转产后48小时，收获细胞进行聚集。
   1. 用PBS清洗每口井两次。
   2. 在 PBS 中加入 1 mL 的 10 mM EDTA，以轻轻地分离细胞对细胞的相互作用，并在 37 °C 下孵育板 5 分钟。
      注:由于研究中粘附分子的潜在蛋白解，不建议使用 Trypsin 进行步骤 1 . 5 . 2 。此外，在 EDTA 添加后，协议在完成之前可能不会停止，因为细胞现在将暴露在环境条件下。
   3. 轻轻敲击板分离细胞，并将每个细胞收获成单独的 15 mL 圆锥管。
   4. 离心锥形管在500 x g 和室温5分钟。
6. 当细胞在造粒时，通过标记每个微中心管的顶部来准备6个孵化管。
   注:GFP 和 mCherry 条件的每一次排列都应用于包含所有实验条件和适当的控制。例如:1. GFP/mCherry，2. 母马/LRRTM2-GFP 3。GFP/纽瑞辛^3+WT SS4-梅里，4。GFP/纽瑞辛^3+A687T SS4--切里，5.纽瑞辛^3+WT SS4---梅里/勒特姆2-GFP，6.纽瑞辛^3+A687T SS4--梅里/拉特姆2-GFP。制作额外的管子，以适应进一步的条件和控制。
7. 用 10 mM CaCl 2 和 10 mM_{MmgCl 2}加热到 37 °C，在 500μL 的 HEK 介质中去除超纳坦和重新悬浮的细胞。
   注:添加CaCl₂ 和MgCl₂ 允许粘附分子重新建立结合，并且只有在有关细胞相互作用伙伴需要二价粘附剂的情况下才需要粘合。
8. 使用血细胞计将每个 15 mL 圆锥管中的细胞计数，并将每个条件的 200，000 个细胞从步骤 1.6.1 计入适当的管中，总体积为 500 μL 的 1:1 混合物。
   注:每种情况只需5分钟计算和引用金额。
9. 在室温下在慢管旋转器中孵育管。

2. 图像采集

1. 优化特定样品的显微镜采集参数。在此示例中，图像是在宽场显微镜上拍摄的。使用5倍空气目标（NA:0.15:WD:20000μm），以获得足够大的磁场进行分析。
2. 在第 1.8 步混合 HEK 细胞的两个条件后立即评估基线聚合。这些现在是"时间零"图像。
   1. 每个样品混合物的移液器 40 μL 在 488 和 561 通道的荧光下通过带电显微镜滑动和图像。
   2. 每次样品滴落在一个对焦平面上获取三个不同的视场。
3. 以"时间 60"图像在 60 分钟内获取最终图像。
   1. 要在 60 分钟的潜伏期后获得混合物的"时间 60"图像，请从旋转管和移液器中将每个样品的每个情况的 40 μL 样本再取到带电滑梯上。图像为第 2.2.2 步。
      注:细胞聚合应每15分钟检查一次，直到饱和。聚合的时间将取决于正在测试的蛋白质。

3. 图像J/斐济分析

1. 要使用斐济/ImageJ 量化聚合范围，请保存分析文件。
   1. 将所提供的补充编码文件保存到计算机上的图像J宏文件夹中。
   2. 安装所提供的聚合宏（插件、宏、安装，并选择"聚合分析.txt"文件）。
2. 确定阈值。
   1. 将"时间零".tif文件加载到图像J中并拆分通道（图像|颜色|拆分通道）。
      注:"时间零"图像用于确定整个实验的阈值和最小双关大小。
   2. 屏蔽每个通道（插件|宏|AggregationAssay_MakeMask）。从映像窗口制作面具将出现。选框旁边确定阈值的图像和确定群集参数从直方图和点击确定。
   3. 使用滑动栏确定图像的阈值，将数字记录到幻灯片栏的右侧，然后单击 "确定"。
   4. 将显示 群集大小的直方图 。从适合实验的直方图中选择群集大小，在 最小群集大小 中键入此数字:框，然后单击 "确定"。此大小以下的群集将不进行分析。
3. 运行分析。
   1. 在图像J中打开条件1的"时间60"图像，并像步骤3.2.1一样拆分通道。
   2. 遮蔽每个通道（插件、宏、AggregationAssay_MakeMask）。使用步骤 3.2.3 和步骤 3.2.4 中确定的相同阈值和大小。取消选择 "确定图像阈值 "旁边的框， 从直方图中确定群集参数 ，然后手动键入大小和阈值到适当的字段中，然后单击 "确定"。
   3. 计算聚合索引（插件|宏|AggregationAssay_CalculateOverlap）。选择要比较的蒙面通道，并编入生成的文件将保存的目录。
   4. 每个"时间 60"图像在每种情况下重复步骤 3.3.1-3.3。
      注:聚合索引定义为总重叠区域除以两个通道区域减去重叠区域乘以 100 的总和（聚合索引 = 重叠区域/[通道 1 的区域+ 通道 2 的区域 - 重叠区域] x 100）。此规范化是两个蒙面通道之间的"OR"操作，表示两个掩体中的总像素。

Results

A687T 突变增加神经素 3® SS4 - 绑定到 LRRTM2⁷
为了研究两种已知突触蛋白的细胞间相互作用如何受到智力残疾和癫痫患者发现点突变的影响，我们使用了上述 HEK 细胞聚合检测（图 1）。细胞根据第1节进行转染，并根据协议第1节和第2节准备成像。细胞在基线上进行成像，没有像预期的那样观察到聚合（未显示）。在 60 分钟内获得的图像与协议第 3 节一样进行分析。为了尽量减少选择偏差，条件被随机化，使实验者失明。出于类似的原因，每个图像的整个视场都被选为投资回报率。

细胞没有表达任何突触配体（GFP/mCherry）的情况显示，在60分钟的潜伏期后，聚集量最小（图2）。同样，在两个细胞群中只有一个表达突触配体（mCherry/LRRTM2-GFP或GFP/神经素^3+T/A687T SS4--mCherry）的条件下，在60分钟的潜伏期（图2）之后，其聚集量极小。不...

Discussion

剖析细胞粘附过程中在跨细胞过程中发生的蛋白质-蛋白质相互作用，可以更好地了解基本细胞过程背后的分子机制，包括成熟和改造过程中突触的形成、功能和维护。细胞对细胞相互作用的意义超越了神经生物学，在信号传导、细胞迁移和^{组织发育等方面}具有更广泛的作用。细胞粘附的畸变会破坏细胞过程，这是适当的细胞功能所必必须的，并且可能低于各种病因，如癌症、关节炎、成瘾、自闭症和精神分裂症^{1，15，16。}在这里，我们提供了一个优化的详细协议，涉及HIK细胞聚合，允许测试细胞粘附相互作用的跨。

使用此 HEK 细胞聚合协议，我们可以剖析聚合中的差异，以接近先天性蛋白与其后突触配体之间的结合能力。因此，我们可以提出这样的问题:两种基本突触蛋白之间的相互作用是否受到点突变的影响？更具体地说，Neurexin3®与LRRTM2的跨相互作用是否受到A687T的影响？这...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 带卡口盖的一次性微管	VWR	89000-028	HEK 细胞群的孵育
1000 mL 快速—流量过滤装置，0.2 um aPES 膜	Thermo Fisher	567-0020	HEK 培养基的灭菌
15 mL SpectraTube 离心管	Ward's Science	470224-998	收获 HEK 细胞
6 孔无菌组织培养板	VWR	100062-892	培养 HEK 细胞
氯化钙	Sigma	223506-500G	磷酸钙转染，HEK 细胞重悬
离心机 - Sorvall Legend RT	Kendro 实验室产品	75004377	收获 HEK 细胞
CO2 细胞培养箱	Thermo Scientific	HERACELL 150i	在生长过程中孵育 HEK 细胞
DMEM，1x（Eagle 培养基的 Dulbecco 改良型），含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠	康宁	10-013-CV	HEK 细胞维护
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 PBS （1X）	Gibco	14190-144	传代/收获 HEK 细胞
乙二胺四乙酸		Sigma-500G	收获 HEK 细胞
Falcon 通气培养瓶，75 cm2 生长区域	康宁	9381M26	培养 HEK 细胞
胎牛血清	Sigma	17L184	HEK 细胞维持
HEK293T细胞	ATCC		模型系统
ImageJ	NIH	V： 2.0.0-rc-69/1.52p	图像分析
氯化镁六水	Sigma	M9272-500G	HEK 细胞重悬
液 磷酸氢二钠 无水	Fisher BioReagents	BP332-500	磷酸钙转染
胰蛋白酶 0.25% （1X） 溶液	GE Healthcare Life科学	SH30042.01	传代 HEK 细胞
管旋转器			HEK 细胞群的孵育
超透明显微镜载玻片。白色磨砂、带正电荷	Denville Scientific Inc.	M1021	图像采集
宽视场显微镜	Zeiss	Axio Vert 200M	图像采集