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环介导等温扩增技术用于筛查 沙门氏菌 在动物饲料中检测并确认 沙门氏菌 从培养物分离

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DOI：

10.3791/61239

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2020年5月20日

 ,  ,  , 
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

本文内容

摘要

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种等温核酸扩增检测技术（iNAAT），在病原体检测领域已引起广泛关注。本文介绍一种经多家实验室验证的 沙门氏菌 LAMP 协议作为一种快速、可靠且稳健的筛查方法 沙门氏菌 在动物饲料中检测并确认疑似阳性样本 沙门氏菌 从培养物分离。

摘要

环介导等温扩增（LAMP）作为一种强大的核酸扩增检测技术，已广泛用于快速检测多种细菌、真菌、寄生虫和病毒病原体。 沙门氏菌 是一种全球范围内引起食品安全关注的细菌性病原体，包括动物食品。本文介绍了一种经多个实验室验证的 沙门氏菌 可用于快速检测动物饲料中是否存在目标成分的LAMP检测方案 沙门氏菌 污染，并可用于确认初步判断 沙门氏菌 从所有食品类别中分离回收的菌株。LAMP 检测特异性靶向 沙门氏菌 侵袭基因（invA）且快速、灵敏、高度特异。模板DNA从动物性食品的增菌培养液或疑似菌株的纯培养物中提取制备 沙门氏菌 分离物。LAMP试剂混合物通过组合等温扩增主混合液、引物、DNA模板和水制备而成。LAMP检测在65 °C恒温条件下运行30 min。阳性结果通过实时荧光监测，最早可在5 min内检出。LAMP检测对动物食品或培养基中的抑制物具有高度耐受性，是一种用于筛查和确认的快速、可靠、稳健、经济高效且操作简便的方法 沙门氏菌LAMP 方法最近已被纳入美国食品药品监督管理局的 细菌学分析手册 （BAM）第5章

引言

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种由日本科学家团队于2000年发明的新型等温核酸扩增检测技术（iNAAT）1。LAMP在初始步骤中通过形成靶标特异性的茎环DNA结构，利用链置换DNA聚合酶对起始模板进行准指数级高效扩增，可在不到1小时内产生超过109个目标序列拷贝1。与广泛使用的核酸扩增检测技术聚合酶链式反应（PCR）相比，LAMP具有多项优势。第一，LAMP反应在恒温条件下进行，因此无需复杂的热循环仪器。第二，LAMP对培养基和生物物质具有高度耐受性2，在临床检测和食品检测应用中均表现出良好的稳健性3,4，这简化了样本前处理流程，并显著降低假阴性结果的发生率5。第三，LAMP适用于多种检测平台，包括浊度检测、比色法、生物发光、荧光检测以及微流控技术6。第四，LAMP具有高度特异性，其使用4至6条特异性设计的引物，靶向识别6至8个特定区域1,7。第五，LAMP具有超高的灵敏度，大量研究已报道其灵敏度优于常规PCR或实时PCR8。最后，LAMP检测速度更快，目前许多LAMP检测方案采用30分钟的标准运行时间，而PCR类检测通常需要1−2小时8。

这些优势推动了LAMP在广泛病原体检测领域的应用，包括 体外 诊断学9动物疾病诊断10以及食品和环境检测11值得注意的是，一种用于结核病的LAMP（环介导等温扩增）方法（TB-LAMP） 结核分枝杆菌) 已被世界卫生组织（WHO）推荐作为在外周地区诊断肺结核时替代痰涂片显微镜检查的有效检测方法12LAMP技术的应用范围也已超越微生物鉴定，涵盖过敏原、动物物种、药物耐药性、转基因生物以及农药的检测13.

非伤寒沙门菌 沙门氏菌 是一种全球范围内备受关注的食源性人畜共患病原体，对食品安全和公共卫生具有重大影响14它还被认定为动物食品中的重要微生物危害。15,16. 为防止 沙门氏菌 由受污染的人类食品和动物饲料引发的疾病/疫情，迫切需要快速、可靠且稳健的检测方法 沙门氏菌 在多种基质中。在过去十年中，国际上在开发与应用方面已做出大量努力 沙门氏菌 在最近一篇综述中总结的多种食品基质中的LAMP检测方法8. 多个 沙门氏菌 LAMP 检测方法（包括本文所述方法）已根据成熟的国际指南成功完成了多实验室验证17,18,19,20.

我们的 沙门氏菌 LAMP 检测特异性靶向 沙门氏菌 侵袭基因 invA （GenBank 登录号 M90846）21 在多种食品基质中快速、可靠且稳定4,22,23,24,25,26该方法已在一项协作前研究中于六种动物源性食品基质中得到验证26 以及在一项多实验室协作研究中的干犬粮中19因此， 沙门氏菌 本文所述的LAMP方法最近已被纳入美国食品药品监督管理局（FDA）的 细菌学分析手册 （BAM）第5章 沙门氏菌27 用于实现两个目的，其一作为快速筛查是否存在 沙门氏菌 在动物饲料中作为两种疑似结果的可靠确认方法 沙门氏菌 从所有食物中分离。

方案

注意：LAMP 反应体系包含 DNA 聚合酶、缓冲液、MgSO₄、dNTPs、甜菜碱、引物混合物和水4，dNTPs、引物、DNA模板和水。前四种试剂包含在一种等温扩增预混液中（材料表）。引物在实验室内部预先混合制成引物混合物（10x）。DNA模板可从动物源性食品样本的增菌培养液中制备，用于筛查目的，或从疑似阳性培养物中制备 沙门氏菌 用于确认目的的分离物。此外，设置阳性对照（从任何样本中提取的DNA） 沙门氏菌 参考菌株，例如， 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌ATCC 19585 [LT2]）以及无模板对照（NTC；无菌分子级水）均需在每次LAMP反应中设置。

1. DNA模板的制备

  1. 从动物源性食品增菌液中制备DNA模板，请遵循以下步骤。
    1.  无菌称取25 g动物饲料样品（如干猫粮、干狗粮、牛饲料、马饲料、禽类饲料和猪饲料）至无菌滤袋中材料清单），或同等规格。将袋子放入大型容器或支架中，以在孵育期间提供支撑。
    2. 加入225 mL无菌缓冲蛋白胨水（BPW），通过轻轻旋转和短暂手摩混匀，室温静置60 ± 5分钟。
    3. 轻轻摇动混匀，用试纸测定pH值。如有必要，用无菌1 N NaOH或1 N HCl将pH值调节至6.8 ± 0.2。于35 ± 2 °C 24 ± 2 小时。
    4. 轻轻旋转混匀含有动物饲料增菌液的袋子。从袋子的滤过侧转移1 mL液体至微量离心管中，短暂涡旋振荡。
    5. 使用样本制备试剂提取 DNA（材料表如下所示。
      1. 以 900 x 离心 g 离心1分钟以去除大颗粒，然后将上清液转移至新的微量离心管中。
      2. 在 16,000 x g 条件下离心 g 2 分钟后弃去上清液。
      3. 将沉淀重悬于 100 µL 样品制备试剂并置于100 ± 1 °C 在干式加热块中加热10分钟。
      4. 冷却至室温，并将样本DNA提取物储存在-20 °C.
  2. 准备疑似样本的DNA模板 沙门氏菌 培养物，遵循以下步骤。
    1. 获得初步结果 沙门氏菌 根据美国食品药品监督管理局《细菌学分析手册》第5章，从所有食品的培养分离中获得的分离物 沙门氏菌 D 部分：分离 沙门氏菌27.
    2. 接种疑似 沙门氏菌 在非选择性琼脂平板（如血琼脂、营养琼脂和胰蛋白胨大豆琼脂）上划线分离菌株，并于35 ± 2 °C 24 ± 2 h。
    3. 将数个单菌落转移至5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或脑心浸液肉汤（BHI）中，在35 ± 2 °C 16 ± 2 小时。
      注意：如果初步 沙门氏菌 培养物是纯的。此时，可通过将数个单菌落悬浮于5 mL TSB中并进行加热来制备DNA模板 500 μL 悬浮液在100 ± 1 °C 在干式加热块中孵育10分钟。继续进行下文的步骤5。
    4. 转移 500 µL 将过夜培养物加入微型离心管中，在 100 ± 1 °C 在干式加热块中加热10分钟。
    5. 冷却至室温，并将分离的DNA提取物储存在-20 °C.
  3. 为制备阳性对照 DNA，参照上述从疑似样本中制备 DNA 模板的类似步骤进行操作 沙门氏菌 增加一个稀释步骤的培养物
    1. 接种 S. 鼠伤寒沙门菌 ATCC 19585（LT2）或任意 沙门氏菌 在非选择性琼脂平板（如血琼脂、营养琼脂和胰蛋白胨大豆琼脂）上接种参考菌株，并于35 ± 2 °C 24 ± 2 小时。
    2. 将数个单菌落转移至5 mL TSB或BHI肉汤中，在35 ± 2 °C 孵育 16 ± 2 小时，以达到约 109 CFU/mL
    3. 在0.1%蛋白胨水中对过夜培养物进行连续稀释，以获得约107 CFU/mL
    4. 转移 500 µL 将此稀释液加入微量离心管中，在100 ± ℃下加热 1 °C 在干式加热块中加热10分钟。
    5. 冷却至室温，并将阳性对照 DNA 储存于 -20 °C.

2. 引物混合液（10倍浓度）的制备

  1. 购买商业合成的LAMP引物（Sal4-F3、Sal4-B3、Sal4-FIP、Sal4-BIP、Sal4-LF和Sal4-LB），采用标准脱盐纯化方法（表1）。
引物名称描述序列 (5´-3´)长度 (bp)
Sal4-F3正向外侧引物GAACGTGTCGCGGAAGTC18
Sal4-B3反向外侧引物CGGCAATAGCGTCACCTT18
Sal4-FIP正向内侧引物GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG38
Sal4-BIP反向内侧引物GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC38
Sal4-LF环正向引物TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG25
Sal4-LB环反向引物AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG21

表1：用于动物饲料中沙门氏菌筛查和培养分离物中沙门氏菌确认的LAMP引物。 引物设计基于沙门氏菌invA基因序列（GenBank登录号M90846）。

  1. 通过加入适量无菌分子级水溶解引物，制备每种引物的贮存液（100 µM）。涡旋振荡混匀10秒，于-20 °C保存（长期保存需置于-80 °C）。
  2. 根据工作表（表 2）配制引物混合液（10x）。将适量体积的引物贮存液与无菌分子级水加入微量离心管中。充分涡旋振荡10秒，使所有试剂混合均匀。
组分储存浓度 (µM)引物混合物浓度 (µM)体积 (µL)
Sal4-F3 引物100110
Sal4-B3 引物100110
Sal4-FIP 引物10018180
Sal4-BIP 引物10018180
Sal4-LF 引物10010100
Sal4-LB 引物10010100
分子级水N/AN/A420
总计N/AN/A1000

表2：LAMP 引物混合液（10x）配制工作表。 引物序列列于表1中。

  1. 将10倍引物混合液分装至微量离心管中，每管500 µL，并于-20 °C保存。

3. LAMP 反应体系的构建

注意：为防止交叉污染，强烈建议将用于配制 LAMP 预混液和添加 DNA 模板的区域在物理上分隔开。图 1 为 LAMP 示意图。

LAMP 工作流程图：配制预混液，分装至各孔，加入 DNA 模板，上机，扩增结果。
图 1：沙门氏菌 LAMP 检测工作流程示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 准备与运行设置
    1. 使用异丙醇和可降解 DNA 及 DNase 的溶液（材料表）清洁实验台。使用可降解 DNA 及 DNase 的溶液清洁移液器和试管条架（材料表）。
    2. 将等温扩增主混合液、引物混合液（10×）、分子级水、阳性对照 DNA 和 DNA 模板在室温下解冻。
    3. 打开 LAMP 仪器（材料表），轻触启动屏幕以进入主界面。按照以下步骤创建一次运行。
      注意：一种型号的 LAMP 仪器具有两个模块（A 和 B），每个模块可容纳 8 个样本；另一种型号为单个模块，可容纳 8 个样本（材料表）。
      1. 点击 LAMP+退火，选择 编辑 以输入样本信息。
        注意：默认的 LAMP 运行程序包括在 65 °C 下扩增 30 分钟，以及从 98 °C 到 80 °C 的退火阶段，每秒降低 0.05 °C。
      2. 点击每一行样本以激活光标，并输入相应的样本信息，使用 AB 模块 图标在两个 LAMP 仪器模块之间切换。
      3. 输入完所有样本信息后，点击 确认 图标。
        注意：可选操作是将运行设置（称为“程序”，包含样本信息及默认的 LAMP 运行程序）保存以供后续使用。点击 保存 图标并为该程序命名。下次测试相同样本集时，可通过已保存的程序启动新运行。点击主界面左下角的 文件夹 图标，选择 程序 以加载已保存的程序。
  2. LAMP 反应体系构建
    注意：当使用两个 LAMP 仪器模块（A 和 B，共 16 个样本）时，按 18 个样本量配制 LAMP 主混合液。若仅使用一个 LAMP 仪器模块（共 8 个样本），则按 10 个样本量配制主混合液。对于其他样本数量，应相应调整体积以补偿移液损耗。每次 LAMP 运行均须包含一个阳性对照和一个无模板对照（NTC）。建议在独立的 LAMP 运行中对每个样本进行重复检测。
    1. 根据工作表（表 3）配制 LAMP 主混合液。将适量的等温扩增主混合液、引物混合液和分子级水加入微量离心管中，轻轻涡旋混匀 3 秒，短暂离心。
    2. 将试管条放入条架中，向每个孔中加入 23 µL 的 LAMP 主混合液。
    3. 对所有 DNA 模板进行涡旋振荡并短暂离心。向相应孔中加入 2 µL DNA 模板，并盖紧盖子。
    4. 将试管条从架中取出，轻弹手腕，确保所有试剂均聚集于管底。
    5. 将试管条装入 LAMP 仪器的模块中，关闭盖子前确保管盖已牢固密封。
组分工作浓度终反应浓度每样本体积 (µL)18 个样本总体积 (µL)10 个样本总体积 (µL)
ISO-001 等温扩增主混合液1.67x1x15270150
引物混合液10x1x2.54525
分子级水N/AN/A5.59955
主混合液小计N/AN/A23414230
DNA 模板N/AN/A2N/AN/A

表3：LAMP反应体系配制工作表。 引物混合液（10x）根据表2配制，所用引物的贮存液见表1。

4. LAMP 反应运行

注意：在 LAMP 反应过程中，使用 FAM 荧光通道采集荧光信号。达到最大扩增速率曲线时的荧光比值所对应的时间点即为峰值时间（Tmax；min），由仪器自动确定。Tm（°C）为最终扩增产物的熔解/退火温度。

  1. 点击屏幕右上角的 运行 图标，并选择包含试管条的区域以启动 LAMP 运行。
  2. 可选操作：在反应进行过程中，点击 温度、扩增 和 退火 选项卡，查看 LAMP 运行期间各项参数的动态变化。
  3. 运行完成后，点击 扩增 和 退火 选项卡查看完整的扩增曲线和退火曲线，并点击 结果 选项卡查看分析结果。
  4. 可选操作：为便于记录，可记录屏幕左上角显示的运行编号，格式为“仪器序列号_运行编号”，例如：“GEN2-2209_0030”。

5. LAMP 结果的解读

注意：LAMP 结果可直接在 LAMP 仪器面板上查看，和/或使用 LAMP 软件（材料表）进行查看。

  1. 为解读仪器面板上的LAMP结果，请遵循以下步骤。
    1. 轻敲 文件夹 主屏幕左下角的图标并选择 日志 导航至文件位置以加载感兴趣的 LAMP 运行。
      注：LAMP 实验按日期排序，起始顺序为年份。
    2. 观察与每次运行相关的五个标签页： 简介, 温度, 扩增, 退火，以及 结果.
      注意： 个人简介 和 温度 标签分别显示LAMP反应进行过程中样品孔中的设定温度和实际温度。 扩增 和 退火 标签分别显示扩增和退火阶段的荧光读数及荧光变化。 结果 标签页显示 LAMP 结果的表格视图。
    3. 轻敲 结果 切换以观察每个孔的 LAMP 结果。
      注意：共有三列（孔板、扩增和退火）。“扩增”列显示达峰时间值（T最大；分:秒）记录每个样品（“孔”）的数值，“退火”列显示熔解/退火温度（Tm; °C) 用于检测该孔中是否存在任何扩增产物。
    4. 解读LAMP结果，并按如下方式报告最终的LAMP结果。
      1. 首先观察对照孔，NTC 孔应为空白 T最大 而 Tm 可以为空（适用于 LAMP 仪器的两种型号）或 < 83 °C （仅适用于具有两个模块的LAMP仪器型号）。阳性对照孔应具有 T最大 5到10分钟之间 Tm 左右 90 °C.
      2. 检查样品孔。所有含有正确成分的样品 Tm （约） 90 °C）和 T最大 （5−30 分钟之间）被视为阳性 沙门氏菌.
      3. 根据重复实验的结果报告最终的LAMP结果。如果重复实验结果一致，可报告最终的LAMP结果；如果重复实验结果不一致，应独立重复两次实验。若结果仍不一致，则该样本应被视为初步阳性。 沙门氏菌 并且需要经过培养确认。
  2. 使用该软件解读LAMP结果，请遵循以下步骤。
    1. 点击 计算机 在左侧面板上点击图标，导航至文件位置以加载感兴趣的 LAMP 运行。
      注意：安装软件的计算机无需连接 LAMP 仪器即可分析 LAMP 结果，即支持远程访问。LAMP 运行记录按日期进行组织。
    2. 观察与每次运行相关的七个标签页： 个人简介, 温度, 扩增, 扩增速率, 退火, 退火衍生物，以及 结果.
      注意：与仪器面板视图类似，该 简介 和 温度 标签分别显示LAMP反应进行过程中样品孔中的程序设定温度和实际温度。 扩增/扩增速率 和 退火/退火衍生物 标签页分别显示扩增和退火阶段的荧光读数或荧光变化。 结果 标签页显示了LAMP结果的表格视图，该视图与仪器面板视图略有不同。
    3. 轻敲 扩增速率 点击以查看荧光比率随时间变化的图示。点击 设置 屏幕右上角的图标，将“Peak Detection Threshold Ratio”从 0.020 调整为 0.010。
      注意：必须进行此调整，以确保识别出所有有效峰，并使软件获得的结果与仪器面板上显示的结果一致。
    4. 轻敲 结果 切换以观察每个孔的 LAMP 结果。
      注意：共有四列（图名称、孔号、孔名称和峰值），其中“峰值”列的上方显示为“Amp Time”（T最大；分:秒）记录每个样本（“孔名称”）的结果，而底部显示“退火导数”（Tm; °C) 用于检测该孔中任何扩增产物。
    5. 解读 LAMP 结果，并按照使用仪器面板时的类似步骤报告最终的 LAMP 结果，但有一个例外：NTC 孔和其他阴性样本应显示为空白 Tm 因为 LAMP 软件设置会消除这些 Tm < 83 °C 结果。同样，所有具有正确 Tm （约） 90 °C）和 T最大值 （5−30 分钟之间）被视为阳性 沙门氏菌.

结果

图2 和 图3 展示了在两个平台上显示的代表性 LAMP 图形/表格。在此 LAMP 实验中，样本 S1 至 S6 为鼠伤寒沙门氏菌（S. enterica）血清型 Infantis ATCC 51741 的 10 倍系列稀释液，浓度范围为每反应 1.1 × 106 CFU 至 11 CFU。阳性对照为每反应 1.7 × 104 CFU 的鼠伤寒沙门氏菌（S. enterica）血清型 Typhimurium ATCC 19585（LT2），NTC 为分子生物学级水。

如图 2E和图 3G所示，NTC 和 PC 孔均为有效的对照。NTC 孔在 LAMP 仪器面板上的 Tmax 为空白，Tm < 83 °C，在 LAMP 软件中显示为空白，表明结果为阴性。PC 孔在两种平台上的 Tmax 均为 7 分 45 秒，Tm 约为 90 °C，表明结果为阳性。样本 S1 至 S6 的 Tmax 在 6 分 30 秒至 12 分 15 秒之间，均为Salmonella阳性。

在对同一批样本进行重复检测后，报告了这些样本的最终LAMP结果。该次具有代表性的LAMP检测表明，LAMP能够成功检测样本中浓度范围较宽的沙门氏菌（Salmonella）。

使用 Genie II 设备进行 PCR 分析；屏幕上显示五个阶段的实验结果图。
图 2：LAMP 仪器面板上显示的代表性 LAMP 结果。（A）程序选项卡显示设定的温度程序。（B）温度选项卡显示 LAMP 反应过程中各样品孔的实际温度。（C）扩增选项卡显示 LAMP 扩增期间的荧光读数。（D）退火选项卡显示退火阶段荧光信号（导数）的变化。（E）结果选项卡以表格形式展示 LAMP 检测结果。请点击此处查看此图的放大版本。

光谱数据分析；发射、吸收研究中的图谱与结果；光谱仪设置。
图3：在LAMP软件中查看的代表性LAMP结果。（A）程序设定选项卡显示设定的温度程序。（B）温度选项卡显示LAMP反应过程中各样品孔的实际温度。（C）扩增选项卡显示LAMP扩增过程中的荧光读数。（D）扩增速率选项卡显示LAMP扩增过程中荧光信号的变化（荧光比值）。（E）退火选项卡显示退火阶段的荧光读数。（F）退火导数选项卡显示退火阶段荧光信号的变化（导数）。（G）结果选项卡以表格形式展示LAMP结果。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种简单、快速、特异且灵敏的LAMP方法，分别用于动物源性食品和纯培养物中Salmonella的筛查与确证。该方法使用含有四种关键试剂的等温扩增预混液，以及可直接使用的实验室自制引物混合液，仅需少量移液操作即可完成LAMP反应体系的配制（图1）。整个反应过程（包括扩增和熔解阶段）总运行时间少于38分钟（图2A,B 和 图3A,B）。阳性结果通过实时荧光信号进行监测（图2C 和 图3C,D），最早可在5分钟内检出26。熔解曲线分析阶段可作为LAMP特异性的额外验证，仅当样本具有正确的Tm值（约90 °C）时才被判定为阳性（图2D,E 和 图3E−G）。此前已有报道显示，该方法在纯培养条件下可检测低至1个Salmonella细胞，对动物源性食品的检测灵敏度可达< 1 CFU/25 g26。

由于LAMP技术非常高效且能产生大量DNA1，因此必须采用最佳实验室操作规范以防止交叉污染，包括将LAMP主混合液的配制区域与DNA模板的添加区域进行物理分隔、避免产生气溶胶、使用带滤芯的吸头、频繁更换手套，以及在扩增后禁止打开LAMP反应管。

该方法的特异性 沙门氏菌 LAMP 方法此前已使用 300 株细菌（247 株）进行过测试 沙门氏菌 185 种血清型和 53 种非沙门氏菌）并证实具有100%特异性26显著差异 T最大 在两者之间观察到 沙门氏菌 物种, S. enterica 和 沙门氏菌邦戈里亚种，以及其中 S. enterica 亚种，尤其是亚种（subsp.） arizonae (IIIa)26然而，根据LAMP结果判读规则，这些仍属于有效的阳性结果。在我们开展的干犬粮多实验室协作研究中，共有14名分析人员参与19，偶尔会观察到在重复 LAMP 检测中结果不一致的样本。这些样本通常涉及延迟出现阳性结果的样本（T最大值 > 15 分钟）。通常，独立重复两次运行即可解决该问题。更少见的情况下，我们观察到样品具有正确的 Tm 但无或不规则 T最大 值（< 5 分钟）。这通常是由于反应管中有气泡所致。

在LAMP方法的整个生命周期中，包括方法开发、评估、预协作研究以及多实验室验证阶段，我们观察到LAMP对多种动物源性食品或食品基质以及培养基中的抑制物具有很高的耐受性4,19,22,23,24，这凸显了该方法的稳健性，并在全球范围内与大量其他研究相互印证8。相比之下，PCR或实时PCR通常需要使用内部扩增对照，以确保阴性结果并非由基质抑制所致，因此LAMP在此方面更具优势28。此外，在绝大多数研究中，LAMP表现出与PCR或实时PCR相当甚至更高的特异性和灵敏度8。LAMP试剂的成本约为每反应1美元。本方案中使用的LAMP仪器体积小、维护需求低且便于携带，可适用于任何通过荧光检测目标序列的等温扩增方法，包括LAMP。通过使用LAMP软件，可生成多种格式的完整报告（pdf、文本和图像）。

方法验证是新方法投入使用前的关键步骤。值得注意的是，本文报道的LAMP方案已成功完成多实验室验证19. 随着该LAMP方案近期被纳入美国食品药品监督管理局（FDA）BAM第5章 沙门氏菌27，预计该方法将得到更广泛的应用，既可作为动物饲料中的快速筛查方法，也可作为疑似阳性结果的可靠确证方法 沙门氏菌 来自所有食品类别的分离株。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。本文所表达的观点仅为作者自身观点，不一定反映美国卫生与公共服务部、美国食品药品管理局或美国政府的官方政策。提及任何商业材料、设备或流程均不构成食品药品管理局的批准、认可或推荐。

致谢

作者感谢美国食品药品监督管理局（FDA）微生物学方法验证小组委员会（MMVS）和细菌学分析手册（BAM）委员会成员对伤寒沙门氏菌（Salmonella）LAMP 方法验证研究的审阅。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脑心浸液肉汤（BHI broth）BD Diagnostic Systems, Sparks, MD299070用于沙门氏菌培养的液体培养基。
缓冲蛋白胨水（BPW）BD Diagnostic Systems, Sparks, MD218105用于从动物源性食品样品中复苏沙门氏菌的预增菌培养基。
DNA AWAYThermo Fisher Scientific, Waltham, MA7010可清除实验台面、玻璃器皿和塑料器皿上的非目标DNA及DNase，且不影响后续DNA样品。
Genie Explorer 软件OptiGene Ltd., West Sussex, United KingdomVersion 2.0.6.3支持Genie仪器的远程操作，包括LAMP扩增运行和数据分析。
Genie II 或 Genie III（LAMP仪器）OptiGene Ltd., West Sussex, United KingdomGEN2-02 或 GEN3-02一种小型仪器，可精确控温至100 °C，精度为 ± 0.1 °C，并通过FAM通道同步进行荧光检测。Genie II 包含两个模块（A和B），每个模块可容纳8个样本；Genie III 为单个模块，可容纳8个样本。
Genie条状管OptiGene Ltd., West Sussex, United KingdomOP-00088孔联排管，带集成锁紧盖，工作体积为10至150 µl。
Genie条状管架OptiGene Ltd., West Sussex, United KingdomGBLOCK用于搭建LAMP反应时固定Genie条状管，该铝制管架也可作为冷却块使用。
盐酸（HCl）溶液，1 NThermo Fisher Scientific, Waltham, MASA48-500在动物源性食品样品中加入BPW后、过夜增菌前，用于调节pH值。
加热金属块Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA88-860-022用于DNA提取过程中将样品加热至100 ± 1 °C。
培养箱Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA3960标准实验室培养箱。
ISO-001 等温扩增预混液OptiGene Ltd., West Sussex, United KingdomISO-001优化的预混液，用于简化LAMP反应体系的配制，包含来自Geobacillus spp.的链置换GspSSD DNA聚合酶大片段、耐热无机焦磷酸酶、反应缓冲液、MgSO4、dNTPs以及双链DNA结合染料（FAM检测通道）。
异丙醇Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAA416用于工作台面的消毒。
LAMP引物Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IACustom详细信息见表1的LAMP引物。
微量离心机Eppendorf North America, Hauppauge, NY22620207MiniSpin plus 个人微量离心机。
微量离心管Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA05-408-129标准微量离心管。
分子生物学级水Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAAM9938用于配制引物储备液、引物混合液和LAMP反应体系。
氢氧化钠（NaOH）溶液，1 NThermo Fisher Scientific, Waltham, MASS266-1在动物源性食品样品中加入BPW后、过夜增菌前，用于调节pH值。
非选择性琼脂（如血琼脂、营养琼脂和胰蛋白胨大豆琼脂）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAR01202用于沙门氏菌培养的固体培养基。
蛋白胨水BD Diagnostic Systems, Sparks, MD218071用于稀释过夜培养的沙门氏菌菌液，以制备阳性对照DNA。
移液器及吸头Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CAPipet Lite LTS系列标准实验室移液器及吸头。
PrepMan Ultra 样品制备试剂Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA4318930一种简易试剂盒，用于快速制备适用于LAMP反应的DNA模板。
沙门氏菌参考菌株 LT2ATCC, Manassas, VA700720作为阳性对照使用的沙门氏菌参考菌株。
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）BD Diagnostic Systems, Sparks, MD211768用于沙门氏菌培养的液体培养基。
涡旋混合器Scientific Industries, Inc., Bohemia, NYSI-0236标准实验室涡旋混合器。
Whirl-pak 滤袋Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WIB01318用于盛装动物源性食品样品进行预增菌的滤袋。

参考文献

  1. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).
  2. Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
  3. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  4. Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
  5. Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
  6. Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
  7. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  8. Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
  9. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
  10. Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
  11. Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  12. WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
  13. Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110(2016).
  14. WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
  15. FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
  16. FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
  17. Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
  18. D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
  19. Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).
  20. D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
  21. Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
  22. Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
  23. Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
  24. Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
  25. Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).
  26. Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
  27. Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
  28. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).

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