本方法描述了一种从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）样品中高通量制备蛋白提取物并进行后续共免疫沉淀的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
共免疫沉淀方法常用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。验证假设的蛋白质-蛋白质相互作用或发现新的相互作用，可为感兴趣蛋白的功能提供宝贵信息。传统的提取物制备方法通常需要耗费大量人力且耗时较长的技术。本文描述了一种使用珠磨机均质器和金属珠的改良提取物制备方案，作为传统蛋白质制备方法的快速替代方案。该提取物制备方法适用于后续的共免疫沉淀研究。例如，该方法已成功用于共免疫沉淀 C. elegans microRNA Argonaute蛋白ALG-1以及两个已知的ALG-1相互作用蛋白：AIN-1和HRPK-1。本方案包括动物样本收集、提取物制备、提取物澄清以及蛋白质免疫沉淀的详细描述。所述方案可适用于在多种遗传背景下，检测任意两个或多个内源性、内源性标记或过表达的C. elegans蛋白质之间的相互作用。
引言
确定目标蛋白的大分子相互作用对于深入了解其功能至关重要。免疫沉淀和共免疫沉淀实验可用于通过大规模蛋白质组学方法鉴定蛋白的完整相互作用组1，或专门检测该蛋白是否能够与假设的相互作用分子共沉淀。在C. elegans中，这两种方法均已成功用于研究多种蛋白的功能，包括那些与microRNA密切协作以调控基因表达的蛋白2,3,4。共免疫沉淀实验的优势在于可在天然细胞环境中检测蛋白-蛋白相互作用，但样品提取的制备可能具有挑战性且耗时较长。有效的样品裂解是必需的，同时必须尽量减少对蛋白-蛋白相互作用的破坏。已有研究采用玻璃匀浆器研磨5、超声处理6、Balch匀浆法7以及氧化锆珠匀浆法8,9成功制备了C. elegans的总蛋白提取物。除 氧化锆珠匀浆法外，这些方法在可同时处理的样品数量方面均存在局限性。本文介绍一种可轻松放大的替代方法，适用于高通量、快速地从C. elegans样品中制备蛋白提取物，并随后进行共免疫沉淀。该方法可同时处理多达24个样品，显著缩短提取物制备所需时间。相比之下，例如玻璃匀浆器研磨通常一次仅能处理一个样品。该提取方法适用于制备来自C. elegans任何发育阶段的蛋白提取物。
本文介绍了一种用于动物样本采集、提取物制备、免疫沉淀以及Western blot数据展示的分步操作流程，以确认目标蛋白的有效拉取及共免疫沉淀蛋白的成功检测。为验证该实验方案的有效性，分别进行了两组共免疫沉淀实验： 1）microRNA Argonaute蛋白ALG-1与AIN-1（一种GW182同源蛋白）之间的相互作用；2）ALG-1与HRPK-1之间的相互作用，其中HRPK-1为新鉴定出的ALG-1互作蛋白2。ALG-1和AIN-1是构成microRNA诱导的沉默复合体（miRISC）的核心蛋白， 二者之间的相互作用已有充分研究证实10,11。提取物制备方案在ALG-1与AIN-1的共免疫沉淀实验中效果良好。本方案也成功验证了ALG-1与其新鉴定互作蛋白HRPK-1之间的相互作用2。
综上所述，该论文描述了一种秀丽隐杆线虫（C. elegans）提取物制备方案，该方案可 扩展至同时处理24个样品，并结合共免疫沉淀实验方案，可用于 发现新的或验证假设的蛋白质间相互作用。该提取物制备方案适用于多种后续实验，包括蛋白质免疫沉淀2 和 microRNA 沉淀实验12。此外，该免疫沉淀方案可针对多种遗传背景下的任意两种或多种内源性、内源性标记或过表达的 C. elegans 蛋白质，用于检测其相互作用。
方案
1. 蛔虫样品采集
- 在所需温度下，将混合发育阶段或同步化13的线虫接种于NGM固体培养板上，使其生长至目标发育阶段。有关C. elegans的基本培养与维持方法，请参见Stiernagle等和Porta-de-la-Riva等的研究14,13。
- 用M9缓冲液冲洗线虫培养板，将线虫收集至15 mL锥形离心管中。
- 在室温（RT）下以400 × g 离心2分钟，使线虫沉淀，并弃去上清液。
注意：用于提取的线虫沉淀体积应在100 µL至500 µL之间。建议免疫共沉淀实验使用300 µL压紧的线虫沉淀，通常可获得约4.5 mg总蛋白；500 µL沉淀则可获得约7.5 mg总蛋白。 - 用M9缓冲液再清洗3–5次（见表1），或直至上清液不再浑浊。
- 最后用ddH2O清洗一次。
- 将松散的线虫沉淀转移至1.5 mL微量离心管中，在室温下以400 × g 离心2分钟。弃去残留上清液，获得压紧的线虫沉淀，随后进行提取制备。
注意：本方案可在此处暂停。线虫沉淀可立即在液氮中速冻，并保存于-80 °C或液氮中。请注意，线虫沉淀仅能解冻一次，不可再次冷冻。
2. 虫体沉淀物的提取制备
注意：提取制备应在冰上或 4 °C 下进行。
- 如果为冷冻样品，将线虫沉淀物置于冰上解冻。
注意：如果未获得预期的300 µL浓缩蠕虫沉淀体积 在样品采集过程中，可将多个较小的沉淀物合并，直至获得足量材料用于后续提取。 - 加入等体积预冷的2倍裂解缓冲液（60 mM HEPES，pH = 7.4，100 mM 氯化钾，0.1% Triton X，4 mM 氯化镁，10% 甘油，2 mM DTT，含RNase抑制剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂；参见 表1）并涡旋振荡或用移液器反复吹打以混匀。离心管子，使混合液聚集于管底。
- 将混合物转移至含有金属珠的1.5 mL无RNase离心管中（参见 材料表）并将样品放入珠磨均质器中（参见 材料表在4 °C下进行。确保管盖拧紧，并且样品在匀浆器内保持平衡。
- 以最高转速（设定为12）均质化样品，持续4分钟。
- 将样品从珠子中移出，放入一个新的1.5 mL微量离心管中。或者，可使用均质仪配套的磁铁将珠子从样品中移除。
- 在19,000 x g下离心提取物 g 在 4 °C 下离心 20 分钟以澄清蛋白提取物。
- 将上清液转移至预冷的1.5 mL离心管中，置于冰上，注意避免转移样本顶部形成的白色浑浊沉淀。此时上清液即为澄清的提取物。
注意：保留 10 µL 澄清提取液用于测定总蛋白浓度。 - 立即使用提取物进行后续实验，或在液氮中速冻提取物并置于 -80 °C 保存。
注意：此处可暂停实验流程。提取物可于超低温（-80 °C 冰箱或液氮）保存约6个月。冷冻提取物仅可解冻一次，不可再次冻存。 - 使用适用于去垢剂的蛋白质浓度检测试剂盒测定提取物的总蛋白浓度（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。
3. 免疫沉淀
注意：提取物制备的所有免疫沉淀步骤均应在冰上或 4 °C 下进行。建议每次免疫沉淀使用 2 mg 总蛋白。然而，使用 0.8–1 mg 总蛋白的免疫沉淀实验也已成功完成。请始终使用新鲜或 freshly thawed 的蛋白提取物。以下方案以 2 mg 总蛋白进行免疫沉淀，或进行一次免疫沉淀实验为基础。若处理多个样品或使用不同量的蛋白提取物，可相应增加或减少磁珠和抗体的用量。
- 将蛋白提取物置于冰上或在冰上解冻。可用预冷的1×裂解缓冲液将样品稀释至10 mg/mL或5 mg/mL（见表1）。
- 通过倒置重悬磁珠，并将150 µL的50%磁珠悬液转移至1.5 mL离心管中。将离心管置于冰上的磁力架上，静置1分钟或直至溶液澄清，使磁珠充分吸附。弃去上清液。
- 从磁力架上取下离心管，用1×裂解缓冲液洗涤磁珠，洗涤液体积为磁珠悬液的2倍（即300 µL）。重复洗涤2次，共洗涤3次。
- 用150 µL预冷的裂解缓冲液重悬磁珠。
- 取75 µL磁珠悬液加入2 mg蛋白提取物中，于4 °C轻柔振荡孵育1小时。将剩余的磁珠悬液保存在冰上以备后续使用。
注意：此步骤旨在减少免疫沉淀过程中非特异性蛋白与磁珠的结合。 - 将含有样品的离心管置于冰上的磁力架上1分钟，或直至磁珠完全吸附且溶液澄清。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，注意不要扰动磁珠。此即为预清除的蛋白裂解液。保留10%样品用于Western blot分析。
- 向预清除的裂解液中加入20 µg亲和纯化的抗体，于4 °C轻柔振荡孵育1小时。
注意：免疫沉淀所用抗体的用量因抗体和靶蛋白而异，应通过实验优化以确保目标蛋白的有效沉淀。 - 向抗体/裂解液混合物中加入剩余的75 µL预洗涤磁珠悬液（步骤3.5），于4 °C轻柔振荡孵育1小时。
- 将离心管置于冰上的磁力架上1分钟，或直至磁珠完全吸附且溶液澄清。可选择性地保留上清液用于Western blot分析。
- 在冰上用450 µL洗涤缓冲液（30 mM HEPES，pH = 7.4，100 mM氯化钾，0.1% Triton X，2 mM氯化镁，10%甘油，1 mM DTT；见表1）洗涤含有免疫沉淀物的磁珠3次。
注意：如需更严格的洗涤条件，可增加洗涤次数。 - 用20 µL 2× SDS/BME蛋白上样缓冲液重悬磁珠沉淀（见材料表），在95 °C煮沸5分钟以变性蛋白，随后即可上样至SDS-PAGE凝胶。或者，变性后的样品可在-20 °C保存数月。
注意：如需进行下游RNA提取，可保留部分免疫沉淀磁珠样品。
4. IP 样品的 Western 印迹检测
- 将IP样品加入SDS-PAGE凝胶中（参见材料表）。上样前，将IP管置于磁力架上1分钟，以避免转移磁珠。
- 进行蛋白质印迹15,16和抗体染色16，并作如下修改：将ALG-1抗体17用5%脱脂奶粉（NFDM）按1:500稀释；将HRPK-1抗体2用5% NFDM按1:1,000稀释；将AIN-1抗体18用5% NFDM按1:10,000稀释。二抗（参见材料表）按制造商说明书使用。
- 使用基于HRP的化学发光法检测条带（参见材料表）。
结果
本方案（示意图见图1）已成功用于制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）的总蛋白提取物（图2），以进行多种蛋白的后续免疫共沉淀实验2（图3和图4）。本研究所采用的珠磨均质器提取方法在总蛋白得率方面与Dounce法相当（图2），并能高效提取核蛋白（COL-19::GFP(NLS)）（图2）和胞质蛋白（图3和图4）。该方法可同时处理多个不同规模的样品（图2）。Argonaute蛋白可与GW182蛋白家族成员相互作用，形成miRISC复合物，进而结合靶标信使RNA并抑制其表达10。图3显示了核心miRISC组分ALG-1与AIN-1的成功共免疫沉淀，结果与先前报道一致11,17。近期研究进一步致力于鉴定Argonaute蛋白ALG-1的其他相互作用蛋白3，以深入了解辅助因子如何调控microRNA的生成与功能。RNA结合蛋白HRPK-1在ALG-1的免疫沉淀物中被鉴定到3。该相互作用已在近期的反向HRPK-1免疫沉淀实验中得到验证2。本研究所提供的蛋白提取与免疫沉淀方案成功在HRPK-1特异性共免疫沉淀中回收到ALG-1蛋白（图4）。此外，ALG-1与AIN-1的相互作用在多种遗传背景下进行了检测，结果表明HRPK-1对ALG-1/AIN-1 miRISC复合物的组装并非必需2（图3）。补充图中提供了完整膜条检测结果（补充图1）。
图1：C. elegans 提取物制备与免疫沉淀的实验流程示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：核定位 GFP（COL-19::GFP(NLS)）在 250 µL 和 100 µL 线虫沉淀样品中经 Dounce 法与珠磨法处理后的 Western blot 比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：GW182 同源蛋白 AIN-1 与 ALG-1 共免疫沉淀。 对 ALG-1 免疫沉淀物中的 ALG-1 和 AIN-1 蛋白进行 Western blot 检测。ALG-1 与 AIN-1 的共免疫沉淀不受 hrpk-1 缺失的影响。Input = IP 的 10%。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：ALG-1 与 HRPK-1 共免疫沉淀。 显示了 HRPK-1 免疫沉淀物中 HRPK-1 和 ALG-1 的 Western 印迹结果。上样量 = 免疫沉淀样品的 10%。* 表示抗体重链。请点击此处查看该图的放大版本。
| M9 缓冲液（1 L） | |
| KH2PO4 | 3 g |
| Na2HPO4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| 1 M MgSO₄4 | 1 mL |
| ddH₂O2O | 最多1 L |
| 2x 裂解缓冲液（5 mL） | |
| HEPES（pH 7.4） | 200 µL |
| 2 M KCl | 250 µL |
| 10% TritonX | 100 µL |
| 1 M MgCl2 | 20 µL |
| 100% 甘油 | 1 mL |
| ddH₂O2O | 最多 5 mL |
| 加入新鲜的： | |
| 1 M DTT | 20 µL |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂 | 1片 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 2 | 100 µL |
| 磷酸酶抑制剂混合物3 | 100 µL |
| 1x 裂解缓冲液 | |
| 将2倍浓度裂解缓冲液与等体积的ddH2O混合稀释。 | |
| 1×洗涤缓冲液 10 mL | |
| HEPES（pH 7.4） | 300 µL |
| 2 M KCl | 500 µL |
| 10% TritonX | 100 µL |
| 1 M MgCl2 | 20 µL |
| 100% 甘油 | 1 mL |
| ddH₂O2O | 最多 10 mL |
| 1 M DTT | 20 µL （添加新鲜的） |
表1：配方
补充图1. 用于生成图2-4的完整探针Western印迹膜如图所示。（A）图2所用的探针膜。注意：该膜被切割以同时检测GFP和Tubulin，从而减小了整体印迹尺寸。（B）图3所用的探针膜。（C）图3所用的另一张探针膜。*表示抗体重链。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
C. elegans 是研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学基本问题的优秀模式生物19。除了作为遗传学研究模型的强大优势外，C. elegans 还适用于多种生化研究方法，包括但不限于蛋白质免疫沉淀和共免疫沉淀。在进行免疫沉淀实验时可能遇到的一个潜在障碍是缺乏针对目标蛋白的特异性抗体。若无现成可用的抗体，可定制多克隆或单克隆抗体。然而，近年来基因组编辑技术的进步使得研究人员能够快速引入突变或对内源性 C. elegans 基因进行标记20,21，从而推动了对基因及其编码蛋白之间的遗传、功能和物理相互作用的研究。特别是，通过 CRISPR/Cas9 技术在内源位点对 C. elegans 基因进行标记，已显著降低了免疫沉淀实验对抗体可获得性的依赖，使共免疫沉淀实验变得更加可行。C. elegans 基因可标记多种标签，从 GFP 或 mCherry 等荧光标签到 FLAG 和 HA 等小分子标签均可选择。针对这些标签的抗体均可商业获取，从而便于通过免疫沉淀方法研究蛋白质-蛋白质相互作用。
本方案如图1所示，既可用于少量样本，也可进行规模放大，每次最多可同时制备24个样品。尽管通过免疫沉淀对蛋白质-蛋白质相互作用的初步表征通常在野生型背景下于正常生长条件下进行，但后续研究往往需要在多种遗传背景或不同生长条件下检测这些相互作用。能够同时制备多个提取物不仅节省时间，更重要的是确保了不同样品间提取过程的一致性。实验中必须设置阴性对照，理想的对照应为编码目标免疫沉淀蛋白的基因发生无效突变的样本（示例见图3和图4）。
该提取方案可快速制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）样品的蛋白质提取物，其效果可与基于氧化锆珠的均质化方法相媲美8。通常情况下，珠磨均质化可通过多种珠磨均质器或类似设备实现多个样品的同时制备，具有良好的可扩展性。然而，一些成本较低的珠磨均质器可能限制了可同时处理的样品数量。作为替代方案，本方案所述的提取方法也可与Dounce均质器为基础的提取制备兼容，后者是一种经济性更优的替代选择。尽管本研究未对不同类型的珠磨均质器进行测试，但大多数 设备只要能够实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）样品的完全裂解，就很可能适用于本蛋白质提取方案。
如上所述，该提取制备方案适用于多种下游实验，包括蛋白质免疫共沉淀2和microRNA下拉实验12，并允许后续同时收集蛋白质和RNA组分。该方法还能高效提取核蛋白和胞质蛋白（图2、图3和图4）。同样，所介绍的免疫共沉淀方案也允许从蛋白质相关的免疫沉淀物中分离RNA。尽管该免疫共沉淀方案最初是为鉴定ALG-1蛋白相互作用分子而开发的，但该方法可经调整用于检测任何目标蛋白之间的相互作用。事实上，本方案所用的免疫共沉淀条件在沉淀ALG-1（图3）和HRPK-1（图4）时均表现出良好效果。该方案是进行RNA结合蛋白免疫纯化的理想起点。然而需要注意的是，针对其他目标蛋白，可能需要对缓冲液组成进行某些调整。具体调整应根据目标蛋白的物理和生物化学特性而定，并需视具体情况逐一优化。
在目标蛋白（此处为 ALG-1 或 HRPK-1）被免疫沉淀后，可通过蛋白质印迹检测共免疫沉淀物中是否存在特定的蛋白相互作用分子。
此外，共纯化的免疫沉淀物也可用于质谱分析，以鉴定所有可能的相互作用蛋白。确认的共免疫沉淀相互作用可在多种遗传背景或条件下进一步检测，以确定该特定相互作用的潜在调控机制。例如，为验证hrpk-1是否在ALG-1/AIN-1 miRISC复合物组装中发挥作用，分别在野生型背景以及HRPK-1缺失的情况下检测了ALG-1与AIN-1的共沉淀情况（图3）。结果表明，hrpk-1对于ALG-1与AIN-1之间的相互作用并非必需2（图3）。此外，可利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在目标蛋白中引入单点突变或结构域缺失突变。通过重新检测这些突变体与其相互作用蛋白的共沉淀能力，可揭示介导该物理相互作用的关键结构域或残基。此类后续研究将为蛋白功能及其调控机制提供极为宝贵的信息。结合秀丽隐杆线虫（C. elegans）遗传学的强大优势，这些方法有助于深入理解调控动物发育和细胞功能的基本分子过程。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了堪萨斯州INBRE项目的支持，资助编号为P20GM103418（授予Li和Zinovyeva）以及R35GM124828（授予Zinovyeva）。我们感谢Min Han慷慨分享抗AIN-1抗体。本研究中使用的一些菌株由由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室资助的Caenorhabditis遗传中心（CGC，资助编号P40 OD010440）提供。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | VWR | 89039-664 | 步骤 1.2 |
| 2× Laemmli 样品缓冲液 | BioRed | 1610737 | 步骤 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶 | BioRed | 4561096 | 步骤 4.1 |
| 抗 AIN-1 单克隆抗体 | 定制生成 | n/a | 步骤 4.2，参见 Zhang 等，2007 |
| 抗 ALG-1 单克隆抗体 | 由 PRF&L 定制生成 | n/a | 步骤 4.2 |
| 抗 HRPK-1 单克隆抗体 | 由 PRF&L 定制生成 | n/a | 步骤 4.2 |
| Bullet Blender Storm 匀浆仪 | MidSci | BBY24M | 步骤 2.3 |
| DL-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | D9779-5G | 表 1 |
| 用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A | Thermo Fisher | 10002D | 步骤 3.2 |
| DynaMag-2 磁力架 | Thermo Fisher | 12321D | 步骤 3.2 |
| 无 EDTA 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | 表 1 |
| GFP 抗体（FL） | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | 图 2 |
| 甘油 | Thermo Fisher | G33-500 | 表 1 |
| 山羊抗兔二抗，HRP 标记 | BioRed | 1662408 | 步骤 4.2 |
| 山羊抗大鼠 IgG（H+L）二抗，HRP 标记 | Thermo Fisher | 31470 | 步骤 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | 表 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM 化学发光底物，100 mL 套装 | LI-COR | 926-95000 | 步骤 4.3 |
| 六水合氯化镁 ACS 级 | VWR | VWRV0288-500G | 表 1 |
| 无水硫酸镁 | Thermo Fisher | M65-500 | 表 1 |
| 微量离心管，1.5 mL | VWR | 20170-333 | 步骤 1.6 |
| N2 野生型 | CGC | ||
| Navy RINO RNA 裂解试剂盒，50 个装（1.5 mL） | MidSci | NAVYR1-RNA | 步骤 2.3 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 2 | Sigma | P5726-1ML | 表 1 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 3 | Sigma | P0044-1ML | 表 1 |
| 氯化钾 | Thermo Fisher | P217-500 | 表 1 |
| 磷酸二氢钾 | Thermo Fisher | P285-3 | 表 1 |
| RC DC 蛋白定量试剂盒 I | BioRed | 5000121 | 步骤 2.9 |
| RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | 10777019 | 表 1 |
| 氯化钠 | Thermo Fisher | S271-500 | 表 1 |
| 无水磷酸氢二钠 | Thermo Fisher | S374-500 | 表 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | 表 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | 可按要求提供 | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | 可按要求提供 | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | 可按要求提供 |
参考文献
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