本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了一种可扩展的、网状工程化心肌组织（ECT）的制备方法，该组织由人诱导多能干细胞（hiPSC）分化而来的心血管细胞构成，旨在实现临床应用目标。将hiPSC来源的心肌细胞、内皮细胞和血管壁细胞与凝胶基质混合后，注入具有矩形交错柱结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）组织模具中。培养至第14天时，ECT成熟为1.5 cm × 1.5 cm的网状结构，包含直径为0.5 mm的肌纤维束。心肌细胞沿每束长轴方向排列，并能自发同步搏动。该方法可扩展至更大尺寸（3.0 cm × 3.0 cm）的网状ECT，同时保持组织结构的成熟度和功能。因此，由hiPSC来源心脏细胞生成的网状ECT可能适用于心脏再生研究范式。
引言
大量临床前研究和临床试验已证实基于细胞的心脏再生疗法对衰竭心脏的有效性1,2,3。在多种细胞类型中，人诱导性多能干细胞（hiPSCs）因其具有增殖能力、可分化为多种心血管谱系细胞4,5以及同种异体移植潜力，成为极具前景的细胞来源。此外，组织工程技术的发展使得将数百万个细胞递送至受损心脏成为可能5,6,7,8。
此前，我们报道了利用一种商业化的三维生物人工组织培养系统，由人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心血管谱系细胞生成三维（3D）线性工程化心肌组织（ECTs）5,7。我们发现，ECTs中血管内皮细胞与壁细胞和心肌细胞共存，可促进组织在结构和电生理方面的成熟。此外，我们在免疫耐受的大鼠心肌梗死模型中验证了....
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方案
1. 人诱导多能干细胞的维持与心血管分化
- 在薄层包被的基底膜基质（生长因子减少型，1:60 稀释）上，使用从小鼠胚胎成纤维细胞中提取的条件培养基（MEF-CM）并添加人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）来扩增和维持 hiPSCs4。
注意：我们使用了一种 hiPSCs（四因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）细胞系：201B6）。针对不同细胞系，需添加适当浓度的 hbFGF。也可使用层粘连蛋白-511 片段替代基底膜基质对培养皿进行包被。市面上可购得的专为无饲养层培养 hiPSCs 设计的培养基可替代 MEF-CM 使用。 - 当细胞融合度达到 90‒100% 时，使用 Versene（0.48 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液）使细胞脱离并解离。
注意：也可使用其他市售的细胞解离产品。 - 将细胞以 10,000 个细胞/mm2 的密度接种于基质包被的细胞培养板中，使用含 hbFGF 的 MEF-CM 培养 2 至 3 天。
- 当培养物完全融合后，用基质（以 MEF-CM 1:60 稀释）覆盖细胞一天。
- 将 MEF-CM 更换为 RPMI 1640 + B27 培养基，并向其中添加 100 ng/mL Activin A 和 100 ng/mL Wnt3A，继续培养一天。
注意：此为分化的第 0 天。为上....
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结果
图1A,B展示了CM+EC和MC方案的示意图。通过CM+EC方案诱导出心肌细胞（CMs）和内皮细胞（ECs），通过MC方案诱导出间质细胞（MCs）后，将细胞混合，并调整终末MC浓度，使其占总细胞数的10%至20%。2 cm宽的组织模具根据设计图纸，使用0.5 mm厚的PDMS片材制作而成（图2A,B）。将六百万个CM+EC+MC细胞与I型胶原蛋白混合形成基质，并浇注到预先涂有泊洛沙姆407（poloxamer 407）的组织模具中（图2C）。在初步实验中，我们制作了具有不同柱长和间距图案的组织模具，并确认了工程化心肌组织（ECTs）的最终几何形态（图3）。本研究选用柱长为7 mm、间隔宽度为2.5 mm的模具。
泊洛沙姆407可防止细胞黏附到模具上，并在14天内快速凝胶收缩后促进.......
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讨论
在完成对线性结构的由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的工程化心肌组织（ECT）5的研究后，我们优化了实验方案，将hiPSC来源的心肌细胞（CMs）、内皮细胞（ECs）和心外膜细胞（MCs）混合，以促进ECT中血管细胞的体外扩增，并实现ECT与受体心肌组织之间的体内血管耦合。
为了促进可植入式大尺寸网格状工程化心肌组织（ECT）结构的构建，我们采用薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）板材设计了具有交错排列加载柱的三维模具。在初步实验中，我们发现ECT在凝胶收缩过程中会黏附于PDMS加载柱上，因此改进了方法，在每个模具表面涂覆表面活性剂泊洛沙姆（poloxamer），以防止细胞黏附，这是本实验方案中的关键步骤9。在体外成熟过程中，ECT保持与内部加载柱及模具底部不黏连，这有利于凝胶的收缩以及后续将ECT从模具中完整取出。本方案的另一个关键步骤是在细胞-凝胶基质混合物凝固之前，将其均匀地倒入PDMS模具中。该操作必须在短时间内完成。同时应避免混合物中产生气泡，因为气泡可能导致ECT结构出现空泡化并.......
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披露
作者没有需要披露的财务或科学利益冲突。
致谢
本工作获得了路易斯维尔大学Kosair慈善儿科心脏研究计划和理化学研究所生物系统动力学研究中心类器官项目在资金上的支持。我们已发表方案中使用的人诱导多能干细胞（HiPSCs）由日本京都大学京都iPS细胞研究所提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 细胞培养皿 100x20 mm 型 | Falcon / Thomas Scientific | 9380C51 | |
| 细胞培养多孔板 6 孔 50 个/箱 | Falcon / Thomas Scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒 | 道康宁 | 761036 | |
| <强>试剂 | |||
| Accumax | 创新细胞技术 | AM-105 | |
| BMP4，重组（10µg) | R&研发 | RSD-314-BP-010 | |
| 来自大鼠尾部的I型胶原蛋白溶液 | Sigma | C3867 | |
| 生长因子减少型Matrigel | 康宁 | 356231 | |
| 人源VEGF（165）IS，优级 | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm 过滤（水中 10% 溶液） | 分子探针 | P-6866 | |
| 重组人bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| 重组人/小鼠/大鼠 ActivinA (50µg) | R&研发 | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a（10µg) | R&研发 | 5036-WN | |
| Versene溶液 | Gibco | 15040066 | |
| <强>培养基与添加剂 | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2-巯基乙醇 | SIGMA | M6250 | |
| B27 补充剂（不含胰岛素） | Gibco | A1895601 | |
| DMEM，高糖 | Gibco | 11965084 | |
| 胎牛血清（500 ml） | 任何 | ||
| 胎牛血清（500 ml） | 任何 | ||
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO₃ | 任何 | ||
| PBS 1× | Gibco | 10010-031 | |
| 青霉素-链霉素（5000 U/mL） | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 培养基 | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| <强>流式细胞术 | |||
| 抗TRA-1-60，FITC，克隆号：TRA-1-60，BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| 抗心肌肌钙蛋白T抗体，克隆：13-11，Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS 清洁液 | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow 鞘液 | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse 溶液 | BD | 340346 | |
| EDTA | 任何 | ||
| 带细胞过滤帽的Falcon管（每箱500个） | 康宁 | 352235 | |
| 胎牛血清（500 ml） | 任何 | ||
| LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒（适用于405 nm激发） | 分子探针 | L34957 | |
| PDGFRb；抗-CD140b，R-PE，克隆号：28D4，BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC；抗CD144，FITC，克隆号：55-7H1，BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 小鼠 IgG1 标记试剂盒 | 分子探针 | Z25002 |
参考文献
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E.
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重印与许可
