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方法文章

一种用于研究三尖瓣功能的新型右心室容量与压力负荷猪心模型

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DOI：

10.3791/61251

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2020年7月28日

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1Division of Pediatric Cardiology, Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Department of Surgery, University of Alberta, 3Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Alberta, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alberta, 5Department of Civil Engineering, University of Calgary, 6Faculty of Kinesiology, University of Calgary

本文内容

摘要

本文描述了一种新型的恢复期仔猪心脏模型，该模型通过在右心室同时施加压力和容量负荷，用于研究三尖瓣功能。

摘要

三尖瓣（TV）承受容量或压力负荷增加的心脏疾病与瓣膜过早失效相关。为增进我们对这些疾病的 mechanistic 研究 对导致三尖瓣过早失效的潜在病理生理机制尚缺乏深入了解。由于无法在人体中开展此类研究，因此需要借助动物模型。本文中，我们介绍了一种新型的可长期存活的幼猪心脏模型的操作方案，用于研究三尖瓣在同时承受容量和压力负荷时发生的变化。在该模型中，通过增加右心室的容量负荷 通过破坏肺动脉瓣实现三尖瓣反流，随后通过放置肺动脉环带来实现压力负荷。术后四周通过超声心动图、心内压力测量以及心脏标本的病理学检查来评估该模型的成功程度。

引言

正常三尖瓣（TV）处于低容量和低压力负荷的环境中发挥作用。然而，在某些儿童及成人心脏病中，三尖瓣可能存在先天性畸形，或心脏生理状态导致右心室和三尖瓣承受增高的容量（前负荷）和/或压力（后负荷）负荷，例如法洛四联症、埃布斯坦畸形、先天性矫正型大动脉转位、接受过心房调转手术的大动脉转位患者、特发性肺动脉高压以及左心发育不全综合征。在这些心脏疾病中，三尖瓣易于发生过早的瓣膜功能衰竭，从而增加发病率和死亡率1,2,3,4,5。尽管可以假设在这些心脏病变中三尖瓣的过早衰竭可能与其暴露于增高的容量和/或压力负荷有关，但其确切病因尚不明确。过去十年的研究表明，作为另一个房室瓣的二尖瓣能够对各种应力刺激产生结构上的适应性改变6,7,8。然而，目前的文献缺乏针对三尖瓣对负荷刺激适应机制的研究。这一空白部分原因可能在于尚缺乏合适的动物心脏模型以支持此类研究。

在文献中，存在一些单独对右心室进行容量负荷或压力负荷的模型。然而，实现右心室慢性压力负荷与容量负荷的联合模型更具挑战性。文献中已有动物模型通过放置肺动脉环缩带来对右心室施加压力负荷，同时制造房间隔缺损以实现右心室的容量负荷9。但该技术难以实现右心室长期同步承受压力和容量负荷的目标，因为较紧的肺动脉环缩 可能导致经房间隔缺损的右向左分流。这将导致房间隔缺损不再对右心室产生容量负荷作用。房间隔水平的右向左分流会引起动物出现紫绀10。为避免这一并发症，该模型需排除本身存在天然房间隔缺损的动物。

其他模型已采用杂交一期姑息手术治疗猪的左心发育不全综合征11。这是一种可恢复的模型，可实现右心室的压力和容量双重负荷。然而，该手术需要昂贵的球囊扩张支架，可能因费用过高而难以实施。Zeltser 等人12和 Lambert 等人13的研究涉及切开右心室流出道和肺动脉瓣，然后在其上方缝合聚四氟乙烯补片，模拟跨瓣环补片的法洛四联症修复技术，以实现右心室的容量负荷。随后通过放置肺动脉环缩带来实现右心室的压力负荷。该模型在技术上具有挑战性，且存在在右心室流出道留下心室切口瘢痕的缺点，可能影响右心室功能，进而影响三尖瓣功能。

本研究描述了一种创新的可恢复性幼猪心脏模型，该模型可在不进行心室切开的情况下，诱导右心室同时承受压力和容量负荷的增加。该模型将有助于开展三尖瓣对压力和容量负荷长期双重增加所引起适应性变化的机制研究。

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方案

本手稿中所述的方案和操作均在兽医的监督下制定，并依照加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）以及《实验动物护理与使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）的规定执行。该方案已获得阿尔伯塔大学（University of Alberta）机构动物护理委员会的批准。所有参与本手稿所述操作的人员均接受了适当的生物安全培训。

1. 术前准备、麻醉与通路建立

  1. 动物纳入与排除标准。
    1. 纳入标准：使用4至5周龄的杜洛克杂交猪仔，雌雄均可。此年龄段的猪仔其人体成熟度相当于4至6个月大的婴儿。
    2. 排除标准：排除存在房间隔缺损和/或动脉导管未闭（通过超声心动图评估）、心脏或心外畸形，或疑似患有传染性疾病的猪仔。
  2. 手术前至少5至7天将猪仔转移至饲养设施，以适应环境。
  3. 手术前一天，检查猪仔以确认其适合手术，且无咳嗽、呕吐、腹泻、苍白、虚弱、嗜睡或皮肤病变等疾病迹象。
  4. 手术前至少禁食固体饲料3小时，但可自由饮水直至手术开始前。
  5. 将猪仔转移至手术操作室。
  6. 通过肌肉注射给予术前用药：阿托品（0.04 mg/kg）、咪达唑仑（0.2 mg/kg）和氯胺酮（2 mg/kg）。同时皮下注射缓释型丁丙诺啡（0.01 mg/kg）以提供围手术期镇痛。
  7. 在手术台上放置循环水毯，并将水温初始设定为约40 °C。调节水毯温度以维持猪仔核心体温在38.0至39.5 °C之间。
  8. 待下颌完全松弛后，用1%利多卡因喷洒喉部。在便携式脉搏血氧仪监测下进行标准经口气管插管。
  9. 检查、连接并确保监测设备正常工作：脉搏血氧仪、二氧化碳监测仪、心电遥测导联和体温探头。
  10. 术中通过吸入异氟烷（2-5%）维持麻醉，根据麻醉深度调整浓度。通过心率、呼吸频率和呼吸模式、血氧饱和度、眼睑反射及肢体回缩反射评估麻醉深度。
  11. 采用以下初始呼吸机设置：呼气末正压（PEEP）为4 cmH2O，潮气量为8-10 mL/kg，吸气与呼气时间比为1:1。呼吸频率设定为26-36次/分钟，根据床旁血气分析仪测得的动脉血气结果调整至使pCO2维持在35-42 mmHg。
  12. 将猪仔置于仰卧位。术中在双眼涂抹无菌眼用软膏以保持润滑。
  13. 剃除手术区域的毛发。使用无菌纱布和消毒液（7.5%聚维酮碘）从内向外以环形方式消毒胸部三次。用无菌纱布擦去多余的消毒液。采用无菌技术铺巾，覆盖手术区域（颈部和胸部左侧）及周围区域。
  14. 采用改良Seldinger技术，在颈动脉（3.5 French单腔导管或24号静脉留置针）和颈内静脉（5或6 French双腔或三腔导管）置入中心导管，用于术中压力监测、采血以及给药所需的静脉通路。
  15. 静脉给予头孢唑林（30 mg/kg）以预防围手术期败血症，同时给予雷尼替丁（1 mg/kg）以预防应激性溃疡。通过中心静脉导管开始静脉输注维持液（5%葡萄糖生理盐水）。

2. 生物活检钳破坏肺动脉瓣瓣叶

  1. 确认手术平面后，在第三肋间行左胸廓切开术，以充分暴露主肺动脉。
  2. 使用无菌凝胶和套管，经左胸廓切开处进行心外膜超声心动图检查，评估是否存在房间隔缺损、动脉导管未闭，并扫查肺动脉瓣和三尖瓣，以排除先天性异常。
  3. 经左胸廓切口，在主肺动脉（MPA）上放置荷包缝线，并连接至套索。
  4. 使用穿刺针导引器，在荷包缝线中央穿刺主肺动脉并送入导丝。沿导丝将定制的带法兰七法式导管鞘经主肺动脉切口送入。通过将荷包缝线缠绕在导管法兰上，将导管牢固锚定于主肺动脉表面，并收紧套索（图1）。
  5. 将活检钳经导管鞘送入，并在心外膜超声心动图引导下推进至肺动脉瓣。
  6. 在直接心外膜超声心动图可视化下，使用活检钳夹取肺动脉瓣瓣叶组织，撤出活检钳导致瓣叶撕裂，从而破坏肺动脉瓣功能。
    1. 根据需要重复此操作，以实现中至重度肺动脉反流。通过肺动脉分支的脉冲波多普勒检查进行评估。本操作旨在使反向与正向血流速度时间积分（VTI）比值达到0.6至0.7之间。确认达标后，撤出活检钳。
  7. 术中根据需要静脉输注肾上腺素（0.05 – 0.15 µg/kg/min）和/或去甲肾上腺素（0.05 – 0.15 µg/kg/min），以维持术中正常血压（体循环动脉平均压介于60 – 80 mmHg）。

3. 肺动脉带的放置

  1. 通过先前放置的鞘管插入一根单腔五法式脐带导管，并将其推进至右心室（RV），用于在放置肺动脉束带期间监测右心室压力。
  2. 将丝线或合成编织的不可吸收缝线穿过硅胶带中间，以增强其强度和牢固性。将该硅胶带环绕于主肺动脉（MPA）上，位置位于肺动脉瓣与导管穿刺点近端之间。
  3. 通过直接测量右心室压力，收紧肺动脉束带，并使用血管夹进行调整，使右心室收缩压达到或超过体循环系统收缩压的60%。达到目标压力后，打结固定缝线以锁紧肺动脉束带。
  4. 将脐带导管穿过肺动脉束带，进入远端主肺动脉，用于回撤测量肺动脉束带前后压力梯度。随后取出脐带导管和鞘管。
  5. 结扎荷包缝线，闭合主肺动脉穿刺部位（图2）。
  6. 以不可吸收缝线缝合左开胸切口的第一层，再用可吸收缝线逐层关闭肌肉组织，最后使用皮肤钉合器闭合皮肤层。
  7. 在皮肤切口周围浸润布比卡因（0.5%，最大剂量2 mg/kg）以提供局部镇痛。术后除此前已给予的皮下缓释布托啡诺外，另给予一次静脉注射美洛昔康（0.2 mg/kg）作为术后镇痛。
  8. 拔除动脉和静脉中心导管，并结扎相应血管以确保止血。
  9. 在切口处涂抹Hibitane乳膏（1%氯己定），并覆盖敷料包扎固定。
  10. 关闭吸入式异氟烷。待仔猪自主呼吸恢复且气道保护机制充分后，拔除气管插管，并进行术后复苏监护与护理。
  11. 为预防切口感染，给予仔猪经验性口服头孢氨苄30 mg/kg，每日两次，疗程五天。

4. 超声心动图评估

  1. 通过彩色多普勒定性评估肺动脉反流，按0至4级进行分级[0 = 无，1 = 极轻度（单束狭窄射流），2 = 轻度（单束稍宽射流，射流长度 < 10 mm，近端射流宽度与右心室流出道比值 < 0.25）；3 = 中度（单个或多个射流，近端射流宽度与右心室流出道比值介于0.25至0.65之间）；4 = 重度（宽大射流，近端射流宽度与右心室流出道比值） > 0.65)].
    1. 在干预组中，通过脉冲波多普勒测量肺动脉分支处的反向与正向血流速度时间积分（VTI）比值，对肺动脉反流进行半定量评估。图3).
    2. 通过彩色多普勒评估，将三尖瓣反流的严重程度定性分级为0至4级［0 = 无，1 = 极轻度（单束窄喷流），2 = 轻度（多束窄喷流），3 = 中度（宽喷流达右心房中部），4 = 重度（宽喷流达右心房后壁）］。肺动脉瓣和三尖瓣反流分级系统均符合现行指南。14,15,16,17,18,19.
  2. 使用右心室面积变化率评估右心室收缩功能右心室面积变化率（RV FAC），通过在心尖四腔切面中描记舒张末期和收缩末期右心室内膜边界的限定面积来测量。将两个面积之差除以舒张末期右心室面积，以百分比形式计算右心室面积变化率。RV FAC 值 < 35% 表示右心室收缩功能异常20.

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结果

为验证模型，将接受左侧开胸术、肺动脉瓣破坏及肺动脉束带置入的10只幼猪（5只雄性，5只雌性，干预组，IP）与接受相同左侧开胸术但未进行进一步干预的10只年龄和性别匹配的对照幼猪（对照组，CP）进行比较。在基线水平（干预前），所有幼猪均无或仅有极轻微的肺动脉反流，右心室几何结构和功能正常。对照组中有1只幼猪存在轻度三尖瓣反流，其余幼猪均无或仅有极轻微的三尖瓣反流。对照组在开胸术后，三尖瓣或肺动脉反流未出现急性变化。干预后，干预组所有幼猪均出现中至重度肺动脉反流，其中1只幼猪的三尖瓣反流由极轻微进展为轻度。两组的右心室收缩功能均正常。在干预组中，不同性别的幼猪在手术可行性或成功实施干预的难易程度方面均无差异。

经过四周的恢复期后，仔猪接受第二次麻醉，通过胸骨切开术切口进行右心室（RV）压力的直接心内测量，并使用超声系统配备的矩阵X-7经胸探头进行心外膜三维超声心动图（3DE）成像，以获取三尖瓣的三维图像。随后实施安乐死并取出心脏用于后续分析。干预组仔猪仍持续存在重度肺动脉反流（表1）。在第二次麻醉期间的超声心动图检查中，反流血流与前向血流的速度时间积分...

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讨论

在开发这种新型心脏模型的过程中，多个因素影响了最终的模型设计。

仔猪年龄与手术暴露
在建立当前仔猪模型之前，研究团队曾使用年龄介于一周至六周之间的仔猪尸体进行研究，旨在确定适合手术操作和解剖暴露的年龄范围。由于手术过程需要直接的心脏超声引导，因此仔猪必须具有合适的体型，以便将超声探头放置于心外膜，同时为手术器械的操作留出足够的空间。通过上述研究，我们确定左侧开胸术可为本手术提供对主肺动脉的最佳暴露效果。此外，我们发现年龄约为3至4周的仔猪体型适中，适合实施手术。在与负责繁育仔猪的阿尔伯塔大学猪只研究与技术中心（SRTC）的研究兽医及同事讨论后，确定四周围龄的仔猪在手术耐受性、术后恢复及中间生长方面具有最佳的生存特征，因为该年龄是仔猪能够稳定断奶并自主进食的最早时间点。自主进食能力对于实现成功的术后护理至关重要，可避免使用额外的肠外营养支持，后者需要在术后继续留置附加的器械和导管，从而增加感染风险。

此外，约四周龄的仔猪其成熟度相当于人类4至6个月大的婴儿，因此可提供一个具有快速生长...

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致谢

本研究工作得到了通过妇女和儿童医院研究所由斯托利儿童医院基金会提供的慷慨资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
药物
1% 利多卡因喷雾WDDC103365Lidodan 30 mL
硫酸阿托品注射液WDDC/Rafter 8 Products0.5 mg/mL
布比卡因WDDC/Sterimax5 mg/mL
盐酸丁丙诺啡缓释注射液Chiron Compounding Pharmacy1 mg/mL
常规盐酸丁丙诺啡WDDC/Champion Alstoe121378Vetergesic 0.3 mg/mL
头孢唑林WDDC/Fresenius Kabi1020161 g/瓶
头孢氨苄胶囊WDDC/NovopharmNovo-Lexin 250 mg/胶囊
肾上腺素WDDCAdrenalin (1:1000) 1 mg/mL
呋塞米片WDDC/Novopharm10 mg 片剂
碘伏消毒液/喷雾Cardinal HealthKF22422Betadine 品牌
盐酸氯胺酮注射液WDDC/Vetoquinol131771Narketan 100 mg/mL
咪达唑仑WDDC/Sandoz1011005 mg/mL
去甲肾上腺素WDDC1 mg/mL
戊巴比妥钠WDDC/Bimeda-MTC127189Euthanyl 240 mg/mL
雷尼替丁注射液WDDC25 mg/mL
雷尼替丁片Sanis300 mg 片剂
外科消毒海绵Stevens333-3774794% 葡萄糖酸氯己定外科皂液刷
设备
24G 外周静脉导管BDInsyte-N
5Fr 双腔中心静脉导管ArrowCS-1450220cm
5Fr 单腔脐血管导管Covidien/Kendall8888160333Argyle 15 英寸
6" 胸部牵开器RRSMRI
6Fr 三腔中心静脉导管ArrowJR-42063-HPHNM20cm
7Fr 带法兰导管鞘Dr. Coe 定制设计
艾迪生镊RRSMRI
Aestiva/5 麻醉机GE Datex Ohmeda
无创镊Teleflex351865
心肌活检钳Dr. Coe 实验室Mansfield 活检钳
弯止血钳RRSMRI
弯蚊式止血钳RRSMRI
Debakey 镊（长型）Teleflex351804
Debakey 镊（窄型）Teleflex351802
Debakey 镊（右弯）Teleflex351800
超声探头套Civco
气管导管Stevens180-112082055Rusch Murphy Eye 低压气囊
虹膜弹簧剪Fisher ScientificNC0127560
iSTAT 1 血气分析仪Abbott LaboratoriesMN:300-G
iSTAT CG4+ 试剂盒Abbott Laboratories03P85-50
Kelly 止血钳Fine Science Tools1301914
Kocher 镊RRSMRI
大型 Army/Navy 牵开器RRSMRI
喉镜MACO CE Miller#4 刀片LA6226-4Macolaryngoscope.com
Liga-clip 施夹器 L 型EthiconLC430
Liga-clip 施夹器 M 型EthiconLX210
Liga-clip 施夹器 S 型EthiconLX110
金属吸引头RRSMRI
Metzenbaum 剪（大号）RRSMRI
Metzenbaum 剪（中号）RRSMRI
Mixter 钳——长/中宽RRSMRI
Mixter 钳——长/窄RRSMRI
Mixter 钳——长/宽RRSMRI
Mixter 钳——短/窄RRSMRI
持针器 10"RRSMRI
持针器 6"RRSMRI
持针器 7"RRSMRI
Philips iE33 超声心动图仪PhilipsX7 和 S12 探头
压力监测管路及三通旋塞Dr. Freed 实验室
鼠齿钳RRSMRI
硅胶增强片材BioplexusSH-21001-0406" × 8" × 0.040" 光面
小型 Army/Navy 牵开器RRSMRI
直止血钳RRSMRI
直蚊式止血钳RRSMRI
缝线：4-0 和 5-0 合成非吸收性缝线，2-0 丝线Dr. Freed 实验室
巾钳RRSMRI
血管止血带Dr. Freed 实验室
Weitlaner 牵开器（中号）RRSMRI
Weitlaner 牵开器（小号）RRSMRI
Zoll R Series 监护除颤仪Zoll technologies

参考文献

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