本方案描述了一种非放射性检测方法，用于测定多核苷酸激酶（PNKs）在小型DNA和RNA底物上的激酶活性。
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摘要
摘要
多核苷酸激酶（PNKs）是一类催化DNA和RNA寡核苷酸5'羟基末端磷酸化的酶。PNK活性可通过直接或间接方法进行定量。本文介绍一种基于荧光标记寡核苷酸底物和聚丙烯酰胺凝胶电泳的直接体外检测方法。该方法可有效分离磷酸化产物，同时避免使用放射性标记底物。本实验方案详细描述了磷酸化反应体系的建立、大尺寸聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳操作，以及反应产物的定量分析。该检测中最具有技术挑战性的环节是大尺寸聚丙烯酰胺凝胶的灌制与电泳运行，因此提供了克服常见困难的关键技术细节。本方案已针对Grc3（一种与Las1核酸酶结合形成必需的前体核糖体RNA加工复合物的PNK）进行了优化。然而，该方案亦可适用于其他PNK酶活性的测定。此外，本检测方法还可进一步修改，用于研究反应体系中不同组分（如核苷三磷酸、金属离子和寡核苷酸）对酶活性的影响。
引言
多核苷酸激酶（PNK）在许多DNA和RNA加工通路中发挥关键作用，例如DNA修复和核糖体组装1,2,3,4,5。这些基础性酶可催化将核苷三磷酸（NTP，最常见为ATP）末端的（γ位）单磷酸基团转移至核苷酸底物的5'羟基末端。其中研究最深入的PNK之一是T4噬菌体PNK，其具有广泛的底物特异性，并被分子生物学实验室广泛用于将放射性同位素标记引入DNA或RNA底物的5'末端6,7,8,9,10,11,12。另一种PNK酶的例子是CLP1，存在于真核生物、真细菌和古菌中，并参与多种RNA加工通路4,13,14,15。
传统上，大多数检测多核苷酸激酶活性的实验方法依赖于放射性同位素标记及随后的放射自显影技术5,16。近年来，已开发出多种其他方法用于检测PNK活性，包括单分子检测、微芯片电泳、分子信标以及基于比色法和发光法的检测方法17,18,19,20,21,22。尽管这些新方法中的许多能够提高检测灵敏度并避免使用放射性物质，但每种方法均存在某些缺点，例如成本较高、依赖固定化树脂以及底物选择受限等。
Grc3 是一种多核苷酸激酶，在前体核糖体 RNA 的加工过程中发挥关键作用2,3,23。Grc3 与内切核糖核酸酶 Las1 形成一种必需复合物，该复合物可切割前体核糖体 RNA 中的内转录间隔区 2（ITS2）3。Las1 对 ITS2 的切割产生一个带有 5' 羟基的产物，随后该产物被 Grc3 激酶磷酸化3。为了研究 Grc3 的核苷酸和底物特异性，需要建立一种经济的检测方法，以测试不同的寡核苷酸底物。因此，开发了一种使用荧光标记底物的 PNK 磷酸化检测方法。该方法已成功用于确定 Grc3 可利用任何 NTP 进行磷酸基团转移反应，但优先选择 ATP24。本实验方案对原始方法进行了改进，用于检测 Grc3 在其前体核糖体 RNA 底物的 RNA 模拟物（SC-ITS2，表 1）上的 PNK 活性。这种基于荧光的方法的一个难点在于需要使用大型聚丙烯酰胺凝胶，以有效分离磷酸化与非磷酸化的底物。本方案详细说明了如何制备这些大型凝胶，并避免在此过程中常见的问题。
RNA 操作需要特别谨慎，因为 RNA 极易降解。为减少核糖核酸酶污染，可采取一些简单的预防措施。设立专门用于 RNA 操作的工作站，并使用含有 RNase 抑制剂的清洁剂进行常规处理，通常十分有效。操作样品时必须始终佩戴手套，并使用经认证无 RNase 的耗材。由于水是常见的污染源之一，建议使用 freshly purified water，并通过 0.22 μm 滤膜对所有溶液进行除菌处理。
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方案
1. 准备
- 配制缓冲液和试剂。
- 通过混合以下成分制备1×反应缓冲液：20 µL 1 M Tris（pH = 8.0）、40 µL 5 M 氯化钠、2.5 µL 2 M 氯化镁、100 µL 50%（v/v）甘油，并用无RNase水定容至总体积1 mL。
- 通过混合以下成分制备尿素上样染料：4.8 g 尿素、200 µL 1 M Tris（pH = 8.0）、20 µL 0.5 M EDTA（pH = 8.0）、0.5 mL 1%（w/v）溴酚蓝，并用无RNase水定容至总体积10 mL。
- 通过混合以下成分制备10×TBE缓冲液：108 g Tris碱、55 g 硼酸、40 mL 0.5 M EDTA（pH = 8.0），并用无RNase水定容至总体积1 L。
- 制备10%（w/v）过硫酸铵（APS）溶液：称取0.5 g APS，加入3 mL无RNase水溶解固体，再用无RNase水定容至总体积5 mL。将管子用铝箔包裹，并将溶液储存在4 °C。
注意：溶解后的APS会随时间降解，每两周需更换一次10% APS储备液。
- 获取多核苷酸激酶酶。
- 获取纯化的Las1-Grc3 PNK酶2，该酶以反应缓冲液（见步骤1.1.1）保存，储备浓度为20 μM。储存缓冲液可能因具体的PNK而异。
- 准备核酸底物。
注意：本方案监测含有Las1-Grc3加工位点（C2位点）的27 nt RNA底物的5'-磷酸化，该位点位于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）前核糖体内部转录间隔区2（SC-ITS2；见表1）中2,25,26。- 化学合成一条具有5'-羟基末端和3'-荧光标记的RNA寡核苷酸底物。荧光团将用于RNA的可视化检测。确保荧光团位于不被磷酸化的RNA末端。除商业来源外，也可采用经济高效的方案在实验室内部对RNA底物进行内部或末端荧光标记27。
- 通过高效液相色谱（HPLC）纯化去除RNA标记反应中过量的荧光团28。
- 用无RNase水将冻干的RNA重悬至500 nM。
- 将RNA分装后于-80 °C长期保存，或于-20 °C短期保存。
- 制备ATP浓度梯度。
- 使用反应缓冲液（见步骤1.1.1）配制20 mM ATP工作液。用此工作液进行连续稀释，制备浓度范围为20 mM至0.02 mM的四个稀释梯度。
- 制备浓度梯度的第一步稀释：取1 μL 20 mM ATP工作液与9 μL反应缓冲液混合，得到10倍稀释的ATP溶液，终浓度为2 mM。
- 使用步骤1.4.2中制得的2 mM ATP储备液进行下一步稀释：取1 μL 2 mM ATP溶液与9 μL反应缓冲液混合，得到新的ATP储备液浓度为0.2 mM。
- 继续每次取前一步ATP储备液1 μL与9 μL反应缓冲液混合，依次制备后续浓度的ATP储备液。
2. 体外RNA激酶反应
注意：该检测可用于测量多个变量，例如时间、核苷酸水平或酶浓度。本实验的目的是在 Las1-Grc3 复合物浓度恒定而 ATP 水平变化的条件下，评估磷酸化 RNA 的含量。
- 对于每个RNA-酶激酶反应，混合1 μL的500 nM RNA底物、8.3 μL的130 nM Las1-Grc3以及0.2 μL的5 mM EDTA。
注意：若进行多个反应，可先配制RNA-酶混合物的主储备液，然后将9.5 μL该主混合液分装至各反应管中。 - 开始检测。
- 将加热金属块预热至37 °C。
- 每隔10秒，取0.5 μL步骤1.4中配制的ATP浓度系列中的一个ATP子储备液，与一份RNA-酶混合物混合，并将反应管放入37 °C加热金属块中。
注意：对于PNK阴性对照，用0.5 μL反应缓冲液代替ATP加入一份RNA-酶混合物中。同时设置其他必要对照（例如，无PNK酶时的RNA底物）。 - 在37 °C下孵育反应60分钟。
注意：荧光标记的RNA对光敏感，因此需用铝箔覆盖反应管。 - 按照步骤2.2.2相同的顺序，每隔10秒向反应体系中加入10 μL尿素上样染料（见步骤1.1.2）以终止每个反应。
注意：除4 M尿素外，此步骤也可加入蛋白酶K以降解酶。请根据供应商提供的说明确定所需蛋白酶用量及反应条件。 - 立即使用终止后的体外RNA激酶反应产物进行后续分析（见第3节），或储存于-20 °C以备后续分析。
3. 凝胶电泳
- 配制15%丙烯酰胺/8 M尿素凝胶溶液。
警告：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时必须小心。处理丙烯酰胺时务必佩戴手套、实验服和护目镜。- 在150 mL玻璃烧杯中，加入22.5 mL预混的40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、6 mL 10x TBE（见步骤1.1.3）、28.8 g尿素，并用无RNase水定容至总体积59 mL。轻轻搅拌溶液。
注意：根据RNA底物的长度，调整聚丙烯酰胺的百分比可能有助于提高未磷酸化与磷酸化RNA之间的分辨率。 - 为溶解尿素，将溶液放入微波炉中加热20秒，搅拌液体后立即再次放入微波炉加热20秒。继续轻轻搅拌，直至尿素完全溶解。
- 将玻璃烧杯置于盛有冷水的浅水浴中，缓慢冷却溶液。确保水浴中的冷水液面高于烧杯内溶液的液面，以促进有效传热。静置5分钟。
注意：若玻璃烧杯仍感觉温热，则不得继续本实验步骤；此时水温应低于25 °C。若5分钟后仍感觉温热，请更换水浴中的冷水并再等待5分钟。 - 使用0.22 μm一次性过滤装置对溶液进行过滤和脱气，以去除颗粒物和微小气泡。
- 在150 mL玻璃烧杯中，加入22.5 mL预混的40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、6 mL 10x TBE（见步骤1.1.3）、28.8 g尿素，并用无RNase水定容至总体积59 mL。轻轻搅拌溶液。
- 灌制变性凝胶。
- 使用肥皂和温水清洗专用于尺寸为31.0 cm × 38.5 cm凝胶的长、短玻璃板。将每块玻璃板喷洒95%乙醇，并擦拭以去除任何水分。
注意：两块玻璃板中的一块可进行硅化处理，以防止在分离玻璃板夹心结构时损坏凝胶。但本步骤非必需，因为本实验方案设计为无需分离玻璃板即可直接观察RNA。 - 将长玻璃板水平放置于一个盒子上，使其高于实验台面。
警告：丙烯酰胺有毒，因此灌胶操作区域必须铺上吸水实验台纸，以吸收任何溢出液体，并在操作完成后立即将其放入废物袋中。 - 沿长玻璃板的长边放置干净的0.4 mm间隔垫片。
- 将短玻璃板叠放在长玻璃板之上，确保短板、长板和间隔垫片的边缘对齐。使用三个等距分布的金属夹子固定两侧。
- 向步骤3.1中配制的15%丙烯酰胺/8 M尿素溶液中加入24 μL TEMED，并混合均匀。
- 向步骤3.2.5中的溶液中加入600 μL 10%（w/v）APS（见步骤1.1.4），并轻轻混匀。
- 立即把溶液倒入两块玻璃板之间。
注意：为避免产生气泡，倾倒溶液时可轻敲玻璃板。 - 小心地将一个干净的0.4 mm、32孔梳子插入玻璃板夹心结构的顶部。
- 让丙烯酰胺至少聚合30分钟。
- 使用肥皂和温水清洗专用于尺寸为31.0 cm × 38.5 cm凝胶的长、短玻璃板。将每块玻璃板喷洒95%乙醇，并擦拭以去除任何水分。
- 电泳运行变性凝胶。
- 将加热块温度设定为75 °C。
- 取下固定玻璃板夹心结构的金属夹子，彻底清洗并干燥玻璃板夹心结构。
- 将玻璃板夹心结构放入电泳装置中，短玻璃板朝内。
- 通过将100 mL 10x TBE与1.9 L无RNase水混合，配制0.5x TBE电泳缓冲液。向电泳装置的上下槽各加入600 mL运行缓冲液。
- 小心拔出梳子，并用注射器彻底冲洗加样孔。
注意：此步骤对于清除加样孔中的尿素至关重要。 - 以50 W功率预电泳30分钟。电压约为2,000 V。
警告：该电泳装置工作于高功率状态，使用者应谨慎操作。 - 用注射器彻底冲洗加样孔。
注意：此步骤对于样品均匀加载至加样孔中至关重要。 - 短暂离心步骤2.2.5中终止的反应产物，然后将离心管在75 °C孵育3分钟。再次进行短暂离心。
- 立即每孔上样10 μL样品，并在50 W功率下电泳运行3小时。
注意：荧光标记的RNA对光敏感，因此需用铝箔覆盖电泳装置。
- 成像变性凝胶。
- 关闭电源，排空电泳装置上槽的缓冲液。
- 用肥皂和水清洗并干燥玻璃板夹心结构的外侧。在运输凝胶过程中用铝箔覆盖玻璃板夹心结构。
- 将玻璃板夹心结构安装到具备定量和高灵敏度荧光检测能力的激光扫描仪载物台上。
注意：该凝胶极薄，以实现最大分辨率。因此，本实验方案设计为无需将凝胶从玻璃板夹心结构中取出，而是直接透过玻璃板观察荧光标记的RNA，从而避免操作困难。使用市售低荧光背景玻璃板可通过提高信噪比来增强检测信号。 - 根据目标荧光染料设定激光扫描仪的激发和发射波长。
注意：不同荧光染料的最佳激发和发射波长可能不同。对于FAM荧光染料，其激发波长和发射波长分别为495 nm和535 nm。 - 在激光扫描仪载物台上定义待成像区域，并按照制造商说明对凝胶进行成像（图1）。
4. 图像分析与信号定量
- 将步骤 3.4.5 中获得的数字凝胶图像载入图像处理软件（参见 材料表）。
- 使用鼠标左键点击并拖动，绘制一个矩形以定义模板框，在数字凝胶图像上标定用于定量每条 RNA 条带的边界区域。通常，可在未添加 PNK 酶的反应体系中观察到的 RNA 条带是生成该模板的合适选择。
注意：为避免背景信号带来的偏差，必须确保每个被测 RNA 条带周围的区域完全相同。因此，最好使用相同的模板框来界定每条 RNA 条带。 - 在 "工具" 下打开 ROI 管理器，并通过点击 "添加" 标记模板框的位置。
注意：定量分析程序也可根据软件用户手册自动绘制框选区域。 - 使用鼠标左键点击并拖动模板框至下一个 RNA 条带，并重复步骤 4.3。持续此过程，直至标记出每个反应中所有未磷酸化和磷酸化 RNA 条带的位置。
- 在 ROI 管理器中点击 "测量"，测量每个框内的积分密度。
- 为计算反应中磷酸化 RNA 的相对含量，将磷酸化 RNA 条带的积分密度除以同一反应中未磷酸化与磷酸化 RNA 条带积分密度之和。该方法同样适用于计算未磷酸化 RNA 的相对含量。
- 为可视化 ATP 浓度梯度下磷酸化 RNA 产物的累积情况及相应未磷酸化 RNA 底物的消耗情况，将步骤 4.6 中计算得到的 RNA 相对含量对 ATP 浓度作图。
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结果
一个成功的代表性变性凝胶电泳图显示了在固定量的Las1-Grc3复合物条件下，ATP滴定的结果 图1加入酶后，由Las1介导对SC-ITS2 RNA底物进行切割，产生一条明确的RNA片段（5-OH C2 RNA）。加入ATP后，该C2 RNA片段被Grc3 PNK磷酸化，形成5-P C2 RNA。在变性凝胶中，磷酸化的RNA比未磷酸化的对应片段迁移更快。如图所示 图2通过绘制未磷酸化和磷酸化的C2 RNA相对含量随ATP浓度的变化，可以观察到C2 RNA片段的磷酸化情况。Grc3 PNK也能以较低的速率磷酸化未切割的SC-ITS2底物的5'末端。这证实了先前的研究结果，表明Grc3 PNK对其C2 RNA底物具有底物偏好性。24. 一次不成功的变性凝胶电泳结果如图所示 图3该凝胶实验未成功，因为21 nt RNA底物含有降解产物（
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讨论
本文描述了一种用于测定Grc3 PNK在荧光标记核苷酸底物上激酶活性的实验方法。通过调整反应缓冲液和寡核苷酸底物，该方案也可用于表征其他PNK酶。例如，本方案要求加入痕量EDTA。添加EDTA具有两个优点：首先，该方法通过防止酶与混合物中痕量污染金属结合，有利于镁离子结合态Grc3的形成；其次，少量EDTA可抑制依赖金属离子的污染性核糖核酸酶活性，而不会干扰与之共存的不依赖金属离子的Las1核糖核酸酶活性。EDTA的浓度可根据特定PNK的来源进行调整。与依赖短半衰期放射性同位素标记寡核苷酸的传统PNK磷酸化检测方法（例如，磷-32的半衰期为2周）相比，本实验方法具有优势。该方案还可用于测定酶的比活性和米氏动力学参数，并确定磷酸化反应对各种因素的依赖性，例如核苷酸、底物和金属离子的性质。
本方案依赖于运行大尺寸变性聚丙烯酰胺凝胶，以获得足够的分辨率来区分未磷酸化的底物与其磷酸化产物。灌制和操作这些凝胶是该方案中的关键步骤。例如，丙烯酰胺溶液必须加热以溶解尿素，然后在灌胶前缓慢冷却。若此溶液冷却过快，可能导致晶体形成。在灌胶和凝胶固化过程中，还必须小心避免引入气泡和灰尘。建议在不拆卸玻...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Andrew Sikkema 博士和 Andrea Kaminski 对本稿件的审阅。本工作由美国国立卫生研究院院内研究计划、美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS；项目编号 ZIA ES103247，授予 R.E.S）以及加拿大卫生研究院（CIHR；项目编号 146626，授予 M.C.P）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4 mm 34孔梳 | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm 间隔器 | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M 氯化镁 | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M 氯化钠 | KD Medical | RGF-3720 | |
| 过硫酸铵（APS） | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| 硼酸 | Sigma | B0394 | |
| 溴酚蓝钠盐 | Sigma | B5525-5G | |
| 玻璃板 | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 测序仪 | Hoefer | N/A | |
| Image J 软件 | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| 标记的RNA寡核苷酸 | IDT | 定制订购 | |
| Pharmacia EPS 3500 电源 | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0.22 µm 滤器 | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Tris 碱 | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 凝胶成像系统 | GE Healthcare | N/A | |
| 超纯DEPC水 | Invitrogen | 750023 | |
| 超纯甘油 | Invitrogen | 19E1056865 | |
| 尿素 | Fisher Chemical | U15-500 |
参考文献
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