利用转基因钙离子荧光报告蛋白Aequorin进行正向遗传筛选以鉴定钙信号通路中的新靶点

摘要

基于Ca²⁺浓度升高的正向遗传筛选可鉴定参与植物钙依赖性信号通路的遗传组分。

摘要

正向遗传筛选一直是无偏见地鉴定参与多种生物通路的遗传组分的重要工具。该筛选方法的基础是构建一个突变群体，并针对感兴趣的表型进行筛选。EMS（乙基甲烷磺酸盐）是一种常用的烷基化试剂，在经典的正向遗传筛选中用于诱导随机突变，以鉴定参与特定生物学过程的多个基因。细胞质钙离子（Ca²⁺）²⁺) 升高是应激感知后激活的关键早期信号通路。然而，介导 Ca²⁺ 在许多研究体系中仍然难以捉摸。Aequorin 是一种从细胞中分离得到的钙离子报告蛋白 Aequorea victoria 并在拟南芥中稳定表达。利用这一特性，我们设计了一个正向遗传筛选实验，对表达水母素的转基因植株进行EMS诱变。收集突变植株的种子（M₁）并对分离群体（M₂) 群体。使用96孔高通量Ca²⁺ 测量方案中，可鉴定出多个具有不同钙响应特征的新型突变体，并实现实时检测。具有目标表型的突变体将被拯救并扩繁，直至获得纯合突变体植株群体。本方案提供了一种在Ca²⁺ 报告背景并鉴定新型 Ca²⁺ 受调控的靶点

引言

细胞在感知生物或非生物刺激后，胞质钙离子（Ca²⁺）浓度的变化是一种被广泛研究的早期信号事件，可激活多种信号通路^1,2,3,4。细胞在基础静息状态下，胞质中的Ca²⁺浓度较低，并将多余的Ca²⁺隔离在不同的细胞内细胞器及细胞外的质外体中，从而形成显著的Ca²⁺浓度梯度^5,6。在信号感知后，由于细胞外和/或细胞内来源的Ca²⁺流入，胞质中的Ca²⁺水平上升，并产生特定于刺激的钙信号特征^7,8,9。多种刺激均可引发胞质Ca²⁺的升高，但特异性由不同的钙库释放Ca²⁺、独特的Ca²⁺信号模式以及相应的感受器蛋白共同维持^10,11。

使用烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）进行诱变是经典正向遗传筛选中用于鉴定参与特定生物学过程的多个独立基因的有力工具。EMS是一种化学诱变剂，主要在整个基因组中随机诱导C到T以及G到A的转换，平均每125 kb基因组产生1个碱基对的改变。EMS诱变可诱导 ≈每基因组1000个单碱基对变化，包括插入/缺失（InDel）或单核苷酸多态性（SNP）¹². EMS诱导的突变为多个点突变，突变频率在每个位点约为1/300至1/30000。这减少了M₁ 找到特定基因突变所需的植株数量。M₁ 2000–3000 粒种子的群体规模通常用于获得感兴趣的突变 拟南芥^13,14.

Arabidopsis 哥伦比亚-0（Col-0）生态型植物为表达细胞质中 p35S-apoaequorin（pMAQ2）的水母蛋白转基因植株¹⁵。水母蛋白是一种由脱辅基蛋白和包含荧光素分子腔肠素的辅基组成的 Ca²⁺ 结合蛋白 。Ca²⁺ 与水母蛋白上三个 Ca²⁺ 结合 EF-手结构域的结合，导致腔肠素被氧化并环化形成二氧杂环丁烷中间体，随后蛋白质发生构象变化，并释放二氧化碳和单线态激发的腔肠酰胺¹⁶。所产生的腔肠酰胺发射蓝光（λ_max，470 nm），可通过发光仪检测¹⁷。因此，可实时测量极其快速的 Ca²⁺ 升高，并用于快速正向遗传筛选。本方案旨在利用钙响应的特异性，鉴定参与 Ca²⁺ 信号特征的新关键因子。为实现该目标，我们在转基因水母蛋白植株中采用 EMS 诱变，并鉴定与 Ca²⁺ 信号改变相关的单核苷酸多态性（SNPs）。该方案可鉴定出在施加刺激后无或降低 Ca²⁺ 升高的突变体。随后可通过定位这些突变体，鉴定出负责 Ca²⁺ 响应的基因。该方法适用于任何在植物中引起 Ca²⁺ 升高的液体刺激。由于 Ca²⁺ 升高是植物防御信号通路中的早期响应之一，鉴定其上游响应组分可为遗传工程提供候选基因，以培育抗逆性更强的植物。

方案

1. EMS诱变及基于单系谱的种子收集（1-3个月）

1. 称取150 mg（约7500粒）aequorin种子用于EMS诱变（M₀种子），另称取150 mg种子作为对照。
2. 将种子转移至50 mL离心管中，加入25 mL 0.2% EMS（v/v）（注意：具有危险性）（处理组），或加入25 mL高压灭菌水（对照组）。
   注：乙基甲磺酸（Ethyl-methane sulfonate）是一种用于植物材料诱变的化学试剂。
3. 用Parafilm封口，并用铝箔纸包裹试管。在室温下翻转旋转处理18小时。
4. 静置使种子沉降。小心移除EMS溶液，并将其与等体积的1 M NaOH混合后弃置于废液容器中（NaOH有助于中和/失活EMS，确保安全 disposal）。使用过的塑料器皿应弃入含1 M NaOH的溶液中。
   注： 24小时后，按照实验室危险品处理规范处置废弃物。
5. 用40 mL高压灭菌水彻底清洗诱变处理的种子，至少清洗8次。含EMS的废液按上述方法弃入含NaOH的废液容器中。
6. 最后一次清洗时，加入40 mL 100 mM硫代硫酸钠溶液，冲洗3次，以去除残留的EMS。
7. 将种子在40 mL高压灭菌水中浸泡约1小时，以促进EMS从种子中扩散出来，然后将种子置于滤纸上直至完全干燥。
8. 将种子转移至微量离心管中，在40 mL高压灭菌水中于4 °C进行层积处理2–4天。此步骤有助于打破种子休眠，确保生长一致性。
9. 将诱变处理的种子（M₀）和对照种子分别播种于土壤中（土壤配比：agropet : soilrite = 1 : 1），并转移至生长室，培养条件为16小时光照/8小时黑暗光周期、光照强度150 μmol∙m⁻²∙s⁻¹，相对湿度约70%。
10. 为判断诱变是否成功，观察种子萌发速度是否减慢、幼苗生长是否受抑制以及是否出现叶绿素嵌合现象¹⁸（图1A）。将诱变植株与对照植株进行比较，以识别这些生理和发育差异。
    注：可采用多种方法从M₁代植株收获种子。本实验方案采用单系谱来源的种子收集方法。每株M₁植株编号唯一，编号从A1至A3500。
11. 将编号独立的植株作为独立的品系进行培养（图1B）。
12. 植株成熟后，分别收获每株突变体的种子，并作为独立的M₁品系保存（图2）。通过单系谱种子收集法，共获得约5000个M₁品系，其中3500个M₁品系用于后续筛选。

2. 高通量筛选以选择突变体（8个月）

1. 基于Ca鉴定新型突变体²⁺ 对选定刺激的反应。在此，我们使用了 H₂O₂ 例如。
2. 用于鉴定突变体，筛选M₂ 世代。由于隐性突变体在M中以1/8的频率分离₂ EMS诱变后的世代¹⁴，8-12 M 的筛选₂-分离植株覆盖一个M₁ 系中鉴定出纯合隐性突变体（使用12株幼苗可提高发现突变体的概率）。从每个独立的M₁ 线，测试 12 M₂ 用于Ca的幼苗²⁺ 对 H 的反应₂O₂ (12 M₂ 每 M 的幼苗数₁ 线。
3. 使用高通量种子灭菌与水培植物生长方案¹⁹. 放置约12-15个M₂ 每 M 粒种子₁ 在24孔组织培养板的各个孔中划线，并在通风橱中，将培养板置于干燥器内，用氯气（12%次氯酸钠与盐酸按3:1体积比混合，总体积40 mL）熏蒸4小时进行灭菌。操作完成后，打开干燥器，静置过夜，使氯气完全挥发。
4. 灭菌后，将培养板移至室外，向各孔中加入液体1/2 MS培养基（不含琼脂的半强度MS培养基）。用封口膜密封培养板，在4 °C条件下对种子进行2-4天的分层处理，随后将种子转移至培养室，于20-22 °C、70%相对湿度、10小时光照/14小时黑暗光周期条件下培养。
5. 待幼苗生长至8-12天后，放入12 M₂ 将每种品系的幼苗分别接种于96孔发光检测板中。用于检测Ca²⁺ 对 H 的反应₂O₂使用化学发光仪微孔板读数仪。
6. 幼苗转移后，在避光或弱光环境下，向各孔中加入150 µL 5–10 µM 腔肠素溶液（用无菌水将5 mM甲醇储备液稀释而成）（注意），并于21 °C避光孵育8小时。
   注意：腔肠素是一种辅基，可与脱辅基水母素（apo-aequorin）结合，使其恢复为具有功能的水母素（aequorin）。腔肠素对光敏感，因此需保存在避光的深色瓶中，并避免光照。
7. 第二天，使用 10 mM H 进行突变体筛选₂O₂ 作为刺激物并测量随后的 Ca²⁺ 反应
8. 为同时测量24个孔，创建一个自动化的动力学程序：先测量背景1分钟，随后加入刺激物（40 μL），测量10分钟，接着进行总腔肠素完全释放（2 M CaCl₂）。₂ 在150 µL 20%乙醇中孵育1-2分钟。
   注意：需要对总的aequorin进行末端放电，以量化所测得的Ca²⁺ 并作为功能性aequorin的额外对照。末端放电过程持续时间较短，为1-2分钟，不会导致明显的植株死亡。若植株在放电步骤后死亡，则需对特定M重新筛选₁ 不中断培养并进行挽救。此类突变体可在M中确认₃ 和 M₄ 使用放电步骤进行传代。
9. 采用24孔板格式的扫描方法，每行以7秒间隔进行测量，每个孔位每次测量点的积分时间为300毫秒。每行中均使用野生型幼苗作为对照，用于与突变体进行比较和评估。
   注意：一个96孔板中含有M₂ 幼苗将覆盖8个独立的M₁ 线（8 M₁*12= 96 M₂）可在2.5小时内完成筛选，每天可筛选32 M₁ 将筛选菌株，640 M₁ 每月处理若干株植物。植物准备就绪后的整个筛选过程大约需要8个月。
10. 根据钙信号的缺失或减弱来鉴定突变体²⁺ H应答₂O₂通过基于抗生素的洗涤过程挽救所选突变体。用25 mg/L头孢噻肟溶液清洗幼苗两次，然后转移至含有25 mg/L头孢噻肟的1/2 MS琼脂挽救培养基中。
11. 在10小时光照/14小时黑暗的光周期条件下培养平板，以获得突变植株。头孢噻肟洗涤有助于去除幼苗上的有害微生物。由于重组后的幼苗处于未密封状态，在将其转移回无菌条件时应尽量减少污染。
12. 将突变植株转移至土壤中以获得纯合的M₃ 群体

3. 数据分析与突变体鉴定（1-3 个月）

注意：上述方法提供的读数单位为相对光单位（RLU）。

1. 为计算[Ca²⁺]_cyt浓度，请使用以下浓度方程²⁰。
   pCa = 0.332588(−log (L/L_max)) + 5.5593
   其中L为发光计数，L_max为总剩余计数。
2. 将获得的pCa值乘以10⁶，换算为以μM表示的[Ca²⁺]_cyt值。然后与等长蛋白（转基因Col-0等长蛋白）对照进行图示比较，以鉴定对H₂O₂处理在Ca²⁺响应方面存在潜在突变的植株。
3. 对表现出对H₂O₂处理无响应或响应减弱的幼苗进行回补实验。
4. 待植株成熟后，收获回补突变体的种子，并在M₃代幼苗中重新筛选对H₂O₂的响应。若全部12株M₃代幼苗的Ca²⁺响应均与母本植株相似，则可认定该群体为纯合M₃代突变体群体；若并非全部12株幼苗均表现出该响应，则继续培育至M₄代并重新筛选，以获得纯合群体。
5. 一旦获得纯合植株系，可利用下一代测序技术鉴定导致表型改变的基因。

结果

通过过氧化氢（H₂O₂）诱导的钙离子（Ca²⁺）升高表型对EMS突变群体进行筛选。如前所述，从每个M₁家系中筛选12株独立的M₂幼苗。在图3中，展示了其中一个M₁家系的结果，每个图示面板包含12株独立的M₂幼苗。以野生型水母素作为对照，用于比较和评估突变体的响应。隐性突变体的分离比例为1:7（突变体:非突变体）。在每个M₁家系筛选12株幼苗的情况下，每家系可鉴定出1至2个突变体。我们已从12株M₂幼苗中鉴定出2个候选突变体（图3）。这些突变体进一步繁殖至M₃和M₄代，并建立纯合群体。随后对纯合突变体进行基因定位，以鉴定其致变基因。

讨论

EMS诱变是群体中产生突变的一种强大工具。利用EMS进行经典正向遗传筛选之所以能有效鉴定新基因，主要有两个原因：首先，该方法无需对基因身份进行任何先验假设；其次，它不会引入任何偏好性偏差。目前已有多种方法可用于构建筛选群体，例如EMS诱变、T-DNA插入、辐射等。在所有这些方法中，基于EMS的诱变具有若干优势。第一，通过本方案所述方法暴露于EMS即可相对容易地构建突变体群体^21,22。第二，可产生足够大规模的突变种子群体，从而可用于针对一种或多种刺激的多重筛选。第三，可鉴定出由于错义突变而产生的必需基因的弱等位基因。第四，通过EMS筛选可识别一系列基因功能变化，包括完全功能缺失、部分功能丧失、功能改变以及组成型基因功能。该方法还有助于鉴定其他诱变方法难以实现的双突变体^23,24,25。 本方案中采用的基于单系谱的M...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板	Jetbiofil	11024	用于幼苗培养
96孔白色Cliniplate板	Thermo Scientific	9502887	用于发光仪检测
Aequorin
Agropet	Lab Chem India		用于植物生长
氯化钙	Fisher Scientific	12135	用于放电溶液
腔肠素	PJK	55779-48-1	aequorin的辅基
乙基甲磺酸	Sigma Aldrich	M0880-5G	用于种子诱变
乙醇	分析纯试剂	1170	用于放电溶液
盐酸	Merck Life Sciences	1.93001.0521	消毒溶液
过氧化氢	Fisher Scientific	15465	作为诱导钙离子升高的刺激物
Luminoskan ascent	Thermo Scientific	5300172	aequorin发光检测
MES缓冲液	Himedia	RM1128-100G	用于植物生长
MS培养基	Himedia	PT021-25L	用于植物生长
氢氧化钠	Fisher Scientific	27805	用于中和EMS
次氯酸钠	Merck Life Sciences	1.93607.5021	消毒溶液
硫代硫酸钠	Fisher Scientific	28005	用于步骤1.6中的种子洗涤
土壤基质（Soilrite）	Lab Chem India		用于植物生长
方形培养盆	Lab Chem India		用于植物生长
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389	用于植物生长
Taxim	Alkem	7180720	用于幼苗挽救