一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组BDNF，用于神经元细胞内运输研究

摘要

在HEK293细胞中以低成本表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），并通过亲和层析进行纯化。随后在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接单生物素标记。与 commercially available BDNF 相比，BDNFAvi 及单生物素化BDNFAvi 均保持其生物学活性。

摘要

在HEK293细胞中表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），然后通过亲和层析以较低成本进行纯化。已建立一种可重复的实验方案，可在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接 单一位点生物素标记。在此反应中，单生物素标记的BDNFAvi仍保持其生物学活性。

神经营养因子是一类由靶细胞来源的生长因子，在神经元的发育和维持中发挥重要作用。它们需要通过内吞途径中的快速运输机制，以实现不同神经元区室之间的长距离信号传递。用于研究神经营养因子转运的分子工具的开发，使得在细胞内精确追踪这些蛋白质成为可能 体内 记录。在本方案中，我们开发了一种优化且经济高效的单生物素化BDNF制备流程。通过在HEK293细胞中表达一种含有可生物素化Avi序列的重组BDNF变体（BDNFAvi），以微克级产量生产目标蛋白，随后采用亲和层析技术进行易于放大的纯化步骤。纯化后的BDNF可通过直接单步反应实现均一的单生物素化修饰 体外 在离心管中通过BirA酶进行反应。单生物素化的BDNF（mbtBDNF）可通过链霉亲和素与不同荧光染料偶联而具备生物学活性。BDNFAvi和mbtBDNF均保留其生物学活性，分别通过Western blot检测下游磷酸化靶蛋白以及转录因子CREB的激活得以验证。利用链霉亲和素偶联的量子点，我们能够观察到mbtBDNF的内化过程，并同时检测到CREB的激活，后者使用特异性识别磷酸化CREB的抗体进行检测。此外，与链霉亲和素-量子点偶联的mbtBDNF适用于在微流控培养室中培养的皮层神经元的逆向运输分析。因此，在离心管中制备的mbtBDNF是研究神经元中生理信号内体动态行为与运输过程的可靠工具。

引言

神经元是神经系统的基本功能单位，具有复杂且特化的形态，能够实现突触通信，从而针对多种刺激产生协调而复杂的行为反应。树突和轴突等神经元突起是参与神经元通信的关键结构特征，而神经营养因子在决定这些突起的形态与功能方面起着至关重要的作用¹。神经营养因子是一类分泌型生长因子家族，包括NGF、NT-3、NT-4以及脑源性神经营养因子（BDNF）²。在中枢神经系统（CNS）中，BDNF参与多种生物学过程，如神经传递、树突分支形成、树突棘的成熟以及长时程增强等^3,4。因此，BDNF在调控神经元功能中发挥着关键作用。

多种细胞过程调控 BDNF 的动态变化及其功能。在神经元表面，BDNF 结合并激活原肌球蛋白受体激酶 B（TrkB）和/或 p75 神经营养因子受体（p75）。BDNF-TrkB 和 BDNF-p75 复合物被内吞，并分选至不同的内吞细胞器^5,6,7,8。BDNF/TrkB 复合物的正确胞内运输对于不同神经环路中 ....

方案

所有实验均按照智利国家科学技术研究委员会（CONICYT）批准的指南进行。本研究中使用的方案已获得智利天主教大学生物安全、生物伦理与动物福利委员会的批准。涉及脊椎动物的实验已获得智利天主教大学生物伦理与动物福利委员会的批准。

注意：以下方案旨在从 HEK293 细胞产生的 500 mL 条件培养基总体积中纯化 BDNFAvi。用于纯化 BDNFAvi 的条件培养基的制备和处理量可根据需要进行放大或缩小。但在这些情况下，可能需要进一步优化。本方案中所用培养基和缓冲液的组成详见补充材料。 

1. 从 HEK293 条件培养基中生产和纯化 BDNFAvi

1. HEK293 细胞的转染
   1. 在 37 ºC 条件下，使用添加补充剂的 DMEM 培养基（10% 胎牛血清、1× 谷氨酰胺补充剂、1× 抗生素/抗真菌剂）将 HEK293 细胞培养至 15 cm 培养皿中细胞融合度达到 70%。
   2. 将培养基更换为转染缓冲液。
   3. 配制用于转染的 PEI-DNA 混合物。使用两个不同的 15 mL 锥形管分别稀释 DNA 和 PEI 25K。在一个管中将 20 μg 质粒 DNA 稀释至终体积为 500 μL；在另一个管中将 60 μg 线性 PEI 25K 稀释至终体积为 500 μL。室温孵育 5 分钟。 
   4. ....

结果

基于层析柱的实验方案可实现对大量HEK293条件培养基的处理。在 图1，从500 mL条件培养基中纯化BDNFAvi的结果如图所示。连续从Ni-NTA琼脂糖珠上洗脱BDNFAvi，其浓度逐渐降低（图1A）。经过四次连续洗脱（每次持续15分钟）后，磁珠捕获的大部分BDNF得以回收。洗脱液的浓度范围为6至28 ng/μL，总产量约为 60 μg BDNFAvi的表1）。所产生的BDNFAvi随后通过一种高效的方式被生物素化 体外 由BirA-GST介导的反应，表现为上清液中缺乏非生物素化的BDNFAvi（图1B）请注意，此处介绍的生物素标记方法 图1B 对应于产生的总BDNF的一个等分试样，但反应可根据需要放大以适用于更大的体积。 

随后，采用两种不同的实验方法评估了mbtBDNF的生物学活性。首先.......

讨论

本文描述了一种基于亲和层析技术的mbtBDNF蛋白制备与纯化流程的优化方法，该方法基于Sung及其合作者的研究工作¹⁷。优化内容包括使用一种成本较低的转染试剂（PEI），同时保持了脂质体转染试剂（如lipofectamine）等更昂贵转染方法的高效性。这一优化显著降低了实验方案的整体成本，实现了可扩展性的同时保持了高性价比。该方案还考虑了操作便利性，例如可将条件培养基冷冻保存长达2个月。这些优化使该流程能够适应不同实验室的具体需求，提升成本效益，并获得均一且具有生物活性的重组BDNF蛋白。此外，该方案也可通过将层析装置替换为在锥形管中利用重力沉降磁珠的方式，适用于小规模生产。尽管这是一种可行的方法，但其耗时较长，且根据我们的经验，产量较低。随后，生物素标记的BDNF可偶联至多种链霉亲和素结合探针，包括荧光染料和超顺磁性纳米颗粒，从而成为研究BDNF内吞后运输过程的有力工具。因此，这一经过优化且操作简便的蛋白制备方案对于从事该领域研究的实验室具有重要应用价值。

在原核系统中表达具有复杂翻译后修饰的重组蛋白（如BDNF

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二通旋塞阀	BioRad	7328102	层析装置组件
2-巯基乙醇	Sigma	M6250	BDNF 洗脱缓冲液
丙烯酰胺/双丙烯酰胺	BioRad	1610154	SDS-PAGE 凝胶制备
Amicon Ultra-15 10K	Millipore	UFC901024	BDNF 浓缩
过硫酸铵	Sigma	A9164	SDS-PAGE 凝胶制备
抗 B-III-微管蛋白抗体	Sigma	T8578	用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 BDNF 抗体	Alomone	AGP-021	用于定量 BDNF 的 Western 印迹实验
抗 BDNF 抗体	Alomone	ANT-010	用于定量 BDNF 的 Western 印迹实验
抗 ERK 抗体	Cell Signaling	9102	用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 pCREB 抗体 (S133)	Cell Signaling	9198	用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 pERK 抗体 (T202, Y204)	Cell Signaling	4370	用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 pTrkB 抗体 (Y515)	Abcam	ab109684	用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗生素/抗真菌剂	Gibco	15240-062	HEK293 细胞维持
ATP	Sigma	A26209	BDNF 单生物素化缓冲液
B-27 添加剂	Gibco	17504-044	神经元维持
双(2-羟乙基)亚氨基三乙酸（Bicine）	Sigma	B3876	BDNF 单生物素化缓冲液
BirA-GST	BPS Bioscience	70031	用于 BDNF AviTag 单生物素化的酶
胎牛血清	HyClone	HC.SH30396.02	HEK293 细胞维持
牛血清白蛋白	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	BDNF 缓冲液修饰组分，Western 印迹和免疫荧光实验的封闭缓冲液
D-生物素	Sigma	B4639	BDNF 单生物素化缓冲液
DMEM 高糖培养基	Gibco	11965-092	神经元接种
DMEM 培养基	Gibco	11995-081	HEK293 细胞维持
Econo 柱漏斗	BioRad	7310003	层析装置组件
EDTA	Merck	108418
EZ-ECL 试剂盒	Biological Industries	1633664	通过 Western 印迹检测蛋白质
Glutamax	Gibco	35050-061	神经元和 HEK293 细胞维持
甘油	Merck	104094	BDNF 洗脱缓冲液，Western 印迹实验的裂解缓冲液
Hettich Rotina 46R 离心机	Hettich	已停产	用于清除培养基中碎片的离心机
Hettich Universal 32R 离心机	Hettich	已停产	用于蛋白浓缩器离心的离心机
马血清	Gibco	16050-122	神经元接种
ImageQuant LAS 500	GE Healthcare Life Sciences	29005063	Western 印迹图像采集
咪唑	Sigma	I55513	BDNF 缓冲液修饰组分
KCl	Winkler	BM-1370	PBS 组分
KH2PO4	Merck	104873	PBS 组分
层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015	用于分隔式神经元的盖片包被
Luer 接头管适配器	BioRad	7323245	层析装置组件
Luminata™ Forte Western HRP 底物	Millipore	WBLUF0100	通过 Western 印迹检测蛋白质
Mg(CH3COO)2	Merck	105819	BDNF 单生物素化缓冲液
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904	免疫荧光实验的封片试剂
MyOne C1 链霉亲和素磁珠	Invitrogen	65001	生物素化验证
Na2HPO4	Merck	106586	BDNF 缓冲液修饰组分
NaCl	Winkler	BM-1630	PBS 组分，BDNF 缓冲液修饰组分
NaH2PO4	Merck	106346	BDNF 缓冲液修饰组分
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049	神经元维持
Ni-NTA 琼脂糖珠	Qiagen	30210	BDNF AviTag 纯化
Nikon Ti2-E	Nikon		用于荧光成像的显微镜
硝酸纤维素膜	BioRad	1620115	Western 印迹中的蛋白转膜
ORCA-Flash4.0 V3 数字 CMOS 相机	Hamamatsu	C13440-20CU	用于落射荧光成像的相机
P8340 蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340	BDNF 缓冲液修饰组分
多聚甲醛	Merck	104005	免疫荧光实验的固定剂
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122	神经元维持
多聚-D-赖氨酸	Corning	DLW354210	用于分隔式神经元的盖片包被
多聚-L-赖氨酸	Millipore	P2363	用于非分隔式神经元的盖片包被
Poly-Prep 层析柱	BioRad	7311550	层析装置组件
聚乙烯亚胺 25K	Polysciences Inc.	PLY-0296	HEK293 转染
量子点 655 链霉亲和素偶联物	Invitrogen	Q10121MP	用于活细胞和固定细胞实验的单生物素化 BDNF AviTag 标记
皂苷	Sigma	S4521	免疫荧光实验用去垢剂
Syldgard 184 硅酮弹性体基质	Poirot	4019862	微流控腔室制备
TEMED	Sigma	T9281	SDS-PAGE 凝胶制备
Tris	Winkler	BM-2000	裂解缓冲液组分
Triton X100	Merck	108603	免疫荧光和 Western 印迹实验中的细胞通透化
0.5% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400-054	HEK293 传代