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方法文章

一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组BDNF，用于神经元细胞内运输研究

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DOI：

10.3791/61262

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2020年7月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

本文内容

摘要

在HEK293细胞中以低成本表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），并通过亲和层析进行纯化。随后在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接单生物素标记。与 commercially available BDNF 相比，BDNFAvi 及单生物素化BDNFAvi 均保持其生物学活性。

摘要

在HEK293细胞中表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），然后通过亲和层析以较低成本进行纯化。已建立一种可重复的实验方案，可在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接 单一位点生物素标记。在此反应中，单生物素标记的BDNFAvi仍保持其生物学活性。

神经营养因子是一类由靶细胞来源的生长因子，在神经元的发育和维持中发挥重要作用。它们需要通过内吞途径中的快速运输机制，以实现不同神经元区室之间的长距离信号传递。用于研究神经营养因子转运的分子工具的开发，使得在细胞内精确追踪这些蛋白质成为可能 体内 记录。在本方案中，我们开发了一种优化且经济高效的单生物素化BDNF制备流程。通过在HEK293细胞中表达一种含有可生物素化Avi序列的重组BDNF变体（BDNFAvi），以微克级产量生产目标蛋白，随后采用亲和层析技术进行易于放大的纯化步骤。纯化后的BDNF可通过直接单步反应实现均一的单生物素化修饰 体外 在离心管中通过BirA酶进行反应。单生物素化的BDNF（mbtBDNF）可通过链霉亲和素与不同荧光染料偶联而具备生物学活性。BDNFAvi和mbtBDNF均保留其生物学活性，分别通过Western blot检测下游磷酸化靶蛋白以及转录因子CREB的激活得以验证。利用链霉亲和素偶联的量子点，我们能够观察到mbtBDNF的内化过程，并同时检测到CREB的激活，后者使用特异性识别磷酸化CREB的抗体进行检测。此外，与链霉亲和素-量子点偶联的mbtBDNF适用于在微流控培养室中培养的皮层神经元的逆向运输分析。因此，在离心管中制备的mbtBDNF是研究神经元中生理信号内体动态行为与运输过程的可靠工具。

引言

神经元是神经系统的基本功能单位，具有复杂且特化的形态，能够实现突触通信，从而针对多种刺激产生协调而复杂的行为反应。树突和轴突等神经元突起是参与神经元通信的关键结构特征，而神经营养因子在决定这些突起的形态与功能方面起着至关重要的作用1。神经营养因子是一类分泌型生长因子家族，包括NGF、NT-3、NT-4以及脑源性神经营养因子（BDNF）2。在中枢神经系统（CNS）中，BDNF参与多种生物学过程，如神经传递、树突分支形成、树突棘的成熟以及长时程增强等3,4。因此，BDNF在调控神经元功能中发挥着关键作用。

多种细胞过程调控 BDNF 的动态变化及其功能。在神经元表面，BDNF 结合并激活原肌球蛋白受体激酶 B（TrkB）和/或 p75 神经营养因子受体（p75）。BDNF-TrkB 和 BDNF-p75 复合物被内吞，并分选至不同的内吞细胞器5,6,7,8。BDNF/TrkB 复合物的正确胞内运输对于不同神经环路中 BDNF 信号传导的正常功能至关重要9,10,11。因此，深入理解 BDNF 运输动态及其在病理生理过程中的改变，对于阐明 BDNF 在健康与疾病状态下的信号机制具有重要意义。开发新型且特异性的分子工具以监测该过程，将有助于推动该领域的发展，并更深入地揭示其中涉及的调控机制。

目前有多种工具可用于研究神经元中 BDNF 的运输。一种常用的方法是转染带有荧光分子（如绿色荧光蛋白（GFP）或GFP的单体红色荧光变体mCherry）标记的重组BDNF12,13。然而，BDNF过表达的一个主要缺点是无法递送已知浓度的这种神经营养因子。此外，它可能导致细胞毒性，从而干扰实验结果的解释14。另一种策略是转染带有表位标签的TrkB（如Flag-TrkB）。该方法可用于研究TrkB的内化动力学15，但也涉及转染过程，可能导致TrkB功能改变和细胞毒性。为了克服这些方法学上的局限性，研究人员开发了含有Avi序列（BDNFAvi）的重组NGF和BDNF变体，该序列可被生物素连接酶BirA单生物素化16,17。生物素化的重组BDNF可与多种链霉亲和素结合工具偶联，包括荧光染料、微珠、超顺磁性纳米颗粒等，用于检测。在活细胞成像方面，量子点（QD）已成为常用的荧光探针，与小分子荧光染料相比，其具有更高的亮度和抗光漂白能力，非常适合单颗粒追踪18。

利用BDNFAvi通过共转染表达BDNFAvi和BirA的质粒，成功制备了单生物素化BDNF（mbtBDNF），随后通过亲和层析纯化重组蛋白，每20 mL HEK293条件培养基可获得1–2 μg BDNF17. 此处，我们提出对该方案的改进，可从500 mL HEK293条件培养基中纯化BDNFAvi，旨在通过基于层析柱的纯化流程最大化蛋白回收率，同时便于操作。所使用的转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）可在不牺牲转染效率的前提下实现低成本操作。单生物素标记步骤已调整为一种 体外 通过避免共转染带来的复杂性，确保BDNF标记的均一性。mbtBDNF的生物学活性已通过Western印迹和荧光显微镜实验得到验证，包括pCREB的激活以及利用微流控小室进行活细胞成像以研究BDNF的逆行轴突运输。该方案的使用可实现高产率、均一的单生物素化且具有生物学活性的BDNF的优化制备。

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方案

所有实验均按照智利国家科学技术研究委员会（CONICYT）批准的指南进行。本研究中使用的方案已获得智利天主教大学生物安全、生物伦理与动物福利委员会的批准。涉及脊椎动物的实验已获得智利天主教大学生物伦理与动物福利委员会的批准。

注意：以下方案旨在从 HEK293 细胞产生的 500 mL 条件培养基总体积中纯化 BDNFAvi。用于纯化 BDNFAvi 的条件培养基的制备和处理量可根据需要进行放大或缩小。但在这些情况下，可能需要进一步优化。本方案中所用培养基和缓冲液的组成详见补充材料。 

1. 从 HEK293 条件培养基中生产和纯化 BDNFAvi

  1. HEK293 细胞的转染
    1. 在 37 ºC 条件下，使用添加补充剂的 DMEM 培养基（10% 胎牛血清、1× 谷氨酰胺补充剂、1× 抗生素/抗真菌剂）将 HEK293 细胞培养至 15 cm 培养皿中细胞融合度达到 70%。
    2. 将培养基更换为转染缓冲液。
    3. 配制用于转染的 PEI-DNA 混合物。使用两个不同的 15 mL 锥形管分别稀释 DNA 和 PEI 25K。在一个管中将 20 μg 质粒 DNA 稀释至终体积为 500 μL；在另一个管中将 60 μg 线性 PEI 25K 稀释至终体积为 500 μL。室温孵育 5 分钟。 
    4. 小心地将 DNA 溶液用移液器滴加到 PEI 管中，通过上下吹打混合一次。室温孵育 25 分钟。 
    5. 将 1 mL PEI-DNA 混合物均匀滴加至每个 15 cm 培养皿中。在 37 ºC 条件下用 PEI-DNA 混合物孵育细胞 3 小时。
    6. 将培养基更换为新鲜的孵育缓冲液。 
  2. 培养基的收集与保存
    1. 在 HEK293 细胞转染后 48 小时，收集所有培养皿中的培养基。配制 补充文件 1 中“上清液修饰缓冲液”部分所述溶液的浓缩储备液，并将其加入 HEK293 上清液中，以达到所列的终浓度。
      注意：细胞可丢弃或回收用于进一步分析。
    2. 将培养基置于冰上孵育 15 分钟。 
    3. 将培养基分装至离心管中。
    4. 在 4 °C 条件下，以 10,000 x g 离心 45 分钟。此步骤可去除培养基中悬浮的细胞碎片和死亡细胞。 
    5. 收集上清液，加入牛血清白蛋白（BSA），使其终浓度为 0.1%，然后于 -20 °C 保存。在纯化步骤前可先将培养基分装冷冻，以便更快解冻。
      注意：冷冻条件培养基储存时间最长达 2 个月时仍可获得良好结果，更长时间的储存效果尚未评估。
  3. 培养基的浓缩与纯化 
    1. 在 37 °C 恒温水浴中解冻培养基。
    2. 将培养基分装至离心管中。 
    3. 在 4 °C 预冷的离心机中以 3,500 x g 离心 1 小时。此步骤可去除残留的细胞碎片，确保色谱柱的适当流速。
    4. 使用截留分子量为 10 kDa 的蛋白浓缩装置，将 500 mL 培养基浓缩至 100 mL。按照制造商推荐的离心参数进行操作，以实现最佳浓缩效果。
    5. 向浓缩后的培养基中加入 500 μL Ni-NTA 琼脂糖珠，于 4 °C 摇床上孵育过夜。 
    6. 组装色谱装置，并将培养基倒入其中。静置 5 分钟后打开双向旋塞，使培养基流过柱子。
    7. 用 5 mL 洗涤缓冲液洗涤珠子 5 分钟。确保在柱内充分重悬珠子。打开双向旋塞排出洗涤缓冲液。重复此步骤 3 次。
    8. 向柱中加入 1 mL 洗脱缓冲液。确保在柱内充分重悬珠子。孵育 15 分钟后，将洗脱液收集至 1.5 mL 微量离心管中。为实现 BDNFAvi 的完全洗脱，重复此步骤 3 次。
    9. 将每次洗脱液各取 5 μL，以及市售 BDNF 的不同浓度样品（40–160 ng），上样至 15% 聚丙烯酰胺凝胶中。使用抗 BDNF 抗体通过 Western 印迹法检测纯化蛋白。 
    10. 利用市售 BDNF 制备的标准浓度曲线，测定每次洗脱液中纯化 BDNFAvi 的浓度。
    11. 将纯化的 BDNFAvi 分装后于 -80 °C 保存。

2. 体外 利用BirA酶对BDNFAvi进行单生物素标记

  1. 体外单生物素化反应 
    1. 配制生物素化缓冲液试剂的浓缩储备液。使用浓缩储备液可最大限度减少重组蛋白的稀释。 
    2. 取800 ng的BDNFAvi，加入生物素化缓冲液试剂以及与BDNF摩尔比为1:1的BirA酶。例如，对于终体积为200 μL的反应体系，加入：含800 ng BDNFAvi的溶液100 μL、0.5 M pH 8.3 Bicine 20 μL、100 mM ATP 20 μL、100 mM MgOAc 20 μL、500 μM d-生物素 20 μL、0.8–1 μg（或1 μL）BirA-GST，并用超纯水定容至200 μL。 
      注意：已成功使用含约30 ng/μL BDNFAvi的400 μL样品进行生物素化反应，最终获得均一单生物素化的BDNFAvi，终浓度约为20 ng/μL。
    3. 将反应混合物在30 °C杂交炉中孵育1小时，每15分钟轻轻翻转管子混匀内容物。 
    4. 按照步骤2.1.2中相同的体积加入ATP和BirA，并重复步骤2.1.3。 
    5. 反应产物可储存于-80 °C以备后续分析，或暂时置于冰上立即使用（例如进行生物素化质量控制）。
  2. 生物素化分析
    1. 每份BDNF样品使用30 μL链霉亲和素磁珠，加入1 mL封闭缓冲液中进行封闭。在室温下，于微量离心管旋转仪中孵育1小时。 
    2. 使用磁力分离架沉淀磁珠3至5分钟，或直至上清液完全澄清 ，弃去封闭缓冲液。
    3. 向磁珠中加入50 μL新鲜封闭缓冲液和80 ng单生物素化的BDNFAvi（mbtBDNF）样品，通过移液确保磁珠完全重悬。
    4. 在4 °C下，以约20 RPM的速度于微量离心管旋转仪中孵育1小时 。 
    5. 使用磁力分离架收集磁珠3至5分钟，收集上清液，并保留30 μL用于分析。
    6. 用500 μL PBS洗涤磁珠一次，然后使用磁力分离架收集磁珠3至5分钟。回收上清液，并保留30 μL用于分析。 
    7. 向磁珠中加入10 μL 4×上样缓冲液。
    8. 将样品在97 °C加热7分钟，以洗脱mbtBDNF。 
    9. 使用抗BDNF特异性抗体检测mbtBDNF19。

3. mbtBDNF 生物学活性的验证

  1. 通过蛋白质印迹法检测 pTrkB 和 pERK。
    1. 在 60 mm 培养皿中接种 200 万个大鼠皮层神经元。 
    2. 将神经元培养 7 天（DIV7）。实验开始时，更换为无添加物的 Neurobasal 培养基。
    3. 更换培养基 1 小时后，加入 mbtBDNF 至终浓度为 50 ng/mL。在 37 ºC 下孵育 30 分钟。设置阴性对照组（未用 BDNF 刺激）和阳性对照组（用 50 ng/mL 商业来源的 BDNF 处理）。
    4. 收集培养基，并用 1× PBS 轻柔洗涤每个培养皿。收集并弃去 1× PBS。
    5. 将培养皿置于冰上，向每个培养皿中加入 50–80 μL 裂解缓冲液。使用细胞刮棒裂解细胞。 
      注意：裂解步骤应尽快完成，以避免蛋白质去磷酸化和降解。剧烈刮取 1–2 分钟足以在蛋白质印迹中观察到目标蛋白。 
    6. 收集裂解液，并在涡旋振荡器上以最高速度振荡 5 秒。
    7. 将裂解液在 14,000 × g（4 °C）条件下离心 10 分钟，收集上清液。
    8. 使用 BCA 蛋白定量法20测定上清液中的蛋白含量 。
    9. 向每种条件含 30–50 μg 蛋白的样品中加入上样缓冲液，并上样至 12% 聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质印迹。使用特异性磷酸化抗体检测 pTrkB 和 pERK，以验证 BDNFAvi 的生物学活性。
  2. 通过 pCREB 免疫荧光验证 BDNF-QD 的生物学活性。
    1. 将 40,000 个大鼠皮层神经元接种于 10 mm 盖玻片上，盖玻片需预先高压灭菌并用多聚-L-赖氨酸处理，方法如前所述21。
    2. 在 37 ºC 下，于神经元维持缓冲液中（见补充材料）培养神经元 7–8 天。 
    3. 实验开始时，更换为无添加物的 Neurobasal 培养基，并在 37 ºC 下孵育 1 小时。
    4. 通过向一份 mbtBDNF 样品中加入适量的量子点-链霉亲和素偶联物（streptavidin-QD），使 BDNF-QD 达到 1:1 的摩尔比，制备与量子点偶联的 mbtBDNF（BDNF-QD）。然后用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL。用铝箔包裹管子以避光。 
      注意：另准备一支试管，加入相同体积的量子点-链霉亲和素偶联物，并用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL，作为阴性对照。
    5. 将 mbtBDNF 与 streptavidin-QD 的混合物在室温下于摇床上孵育 30 分钟。 
    6. 用 Neurobasal 培养基将 BDNF-QD 稀释至所需终浓度（200 pM 和 2 nM）。
    7. 在无添加物的 Neurobasal 培养基中孵育 1 小时后，用 BDNF-QD 或 streptavidin-QD（对照）刺激神经元，BDNF 的终浓度为 200 pM 和 2 nM，在 37 °C 下孵育 30 分钟。 
    8. 用 1× PBS（37 °C）洗涤盖玻片 3 次，并用含磷酸酶抑制剂的 4% 多聚甲醛溶液处理盖玻片，固定细胞 15 分钟。
    9. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后在封闭/通透缓冲液（5% BSA，0.5% Triton X-100，1× 磷酸酶抑制剂）中孵育 1 小时。
    10. 在 4 °C 下，用抗-pCREB 抗体（1:500，溶于含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的溶液中）孵育过夜。 
    11. 次日，用 1× PBS 洗涤 3 次，然后在含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的溶液中与二抗（1:500）孵育 1 小时。 
    12. 用 1× PBS 洗涤 3 次，加入 Hoechst 核染色液（5 μg/mL）染色 7 分钟。 
    13. 用 1× PBS 洗涤 3 次，封片。
  3. 活体神经元中 BDNF-QD 逆行轴突运输的可视化
    1. 按照先前所述方法制备微流控室并接种神经元16。
    2. 培养 7–8 天后，更换为无添加物的 Neurobasal 培养基。
    3. 通过向一份 mbtBDNF 样品中加入适量的量子点-链霉亲和素偶联物（streptavidin-QD），使 BDNF-QD 达到 1:1 的摩尔比，制备与量子点偶联的 mbtBDNF（BDNF-QD）。然后用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL。用铝箔包裹管子以避光。 
      注意：另准备一支试管，加入相同体积的量子点-链霉亲和素偶联物，并用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL，作为对照。
    4. 将 mbtBDNF 与 streptavidin-QD 的混合物在室温下于摇床上孵育 30 分钟。 
    5. 将 BDNF-QD 稀释至所需终浓度（2 nM）。
    6. 在无添加物的 Neurobasal 培养基中孵育 1 小时后，将 BDNF-QD 或对照混合物加入微流控室的轴突区室中。在 37 ˚C 下孵育 210 分钟，以确保 BDNF-QD 发生净逆行运输。
    7. 进行活细胞成像时，使用适合该用途的显微镜（37 °C 和 5% CO2 条件下），利用 100 倍物镜观察微沟道中靠近胞体区室的轴突逆行运输情况。以每秒 1 帧的速度采集图像。 

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结果

基于层析柱的实验方案可实现对大量HEK293条件培养基的处理。在 图1，从500 mL条件培养基中纯化BDNFAvi的结果如图所示。连续从Ni-NTA琼脂糖珠上洗脱BDNFAvi，其浓度逐渐降低（图1A）。经过四次连续洗脱（每次持续15分钟）后，磁珠捕获的大部分BDNF得以回收。洗脱液的浓度范围为6至28 ng/μL，总产量约为 60 μg BDNFAvi的表1）。所产生的BDNFAvi随后通过一种高效的方式被生物素化 体外 由BirA-GST介导的反应，表现为上清液中缺乏非生物素化的BDNFAvi（图1B）请注意，此处介绍的生物素标记方法 图1B 对应于产生的总BDNF的一个等分试样，但反应可根据需要放大以适用于更大的体积。 

随后，采用两种不同的实验方法评估了mbtBDNF的生物学活性。首先...

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讨论

本文描述了一种基于亲和层析技术的mbtBDNF蛋白制备与纯化流程的优化方法，该方法基于Sung及其合作者的研究工作17。优化内容包括使用一种成本较低的转染试剂（PEI），同时保持了脂质体转染试剂（如lipofectamine）等更昂贵转染方法的高效性。这一优化显著降低了实验方案的整体成本，实现了可扩展性的同时保持了高性价比。该方案还考虑了操作便利性，例如可将条件培养基冷冻保存长达2个月。这些优化使该流程能够适应不同实验室的具体需求，提升成本效益，并获得均一且具有生物活性的重组BDNF蛋白。此外，该方案也可通过将层析装置替换为在锥形管中利用重力沉降磁珠的方式，适用于小规模生产。尽管这是一种可行的方法，但其耗时较长，且根据我们的经验，产量较低。随后，生物素标记的BDNF可偶联至多种链霉亲和素结合探针，包括荧光染料和超顺磁性纳米颗粒，从而成为研究BDNF内吞后运输过程的有力工具。因此，这一经过优化且操作简便的蛋白制备方案对于从事该领域研究的实验室具有重要应用价值。

在原核系统中表达具有复杂翻译后修饰的重组蛋白（如BDNF

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者衷心感谢以下机构提供的经费支持：Fondecyt（1171137）（FCB）、科学与技术基础卓越中心（AFB 170005）（FCB）、千禧年中心（P07/011-F）（FCB）、惠康信托资深研究员奖（107116/Z/15/Z）（GS）以及英国痴呆症研究中心基金会资助（GS）。本研究得到了天主教大学先进显微镜单元（UMA UC）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二通旋塞阀BioRad7328102层析装置组件
2-巯基乙醇SigmaM6250BDNF 洗脱缓冲液
丙烯酰胺/双丙烯酰胺BioRad1610154SDS-PAGE 凝胶制备
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF 浓缩
过硫酸铵SigmaA9164SDS-PAGE 凝胶制备
抗 B-III-微管蛋白抗体SigmaT8578用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 BDNF 抗体AlomoneAGP-021用于定量 BDNF 的 Western 印迹实验
抗 BDNF 抗体AlomoneANT-010用于定量 BDNF 的 Western 印迹实验
抗 ERK 抗体Cell Signaling9102用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 pCREB 抗体 (S133)Cell Signaling9198用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 pERK 抗体 (T202, Y204)Cell Signaling4370用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗 pTrkB 抗体 (Y515)Abcamab109684用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验
抗生素/抗真菌剂Gibco15240-062HEK293 细胞维持
ATPSigmaA26209BDNF 单生物素化缓冲液
B-27 添加剂Gibco17504-044神经元维持
双(2-羟乙基)亚氨基三乙酸（Bicine）SigmaB3876BDNF 单生物素化缓冲液
BirA-GSTBPS Bioscience70031用于 BDNF AviTag 单生物素化的酶
胎牛血清HyCloneHC.SH30396.02HEK293 细胞维持
牛血清白蛋白Jackson ImmunoResearch001-000-162BDNF 缓冲液修饰组分，Western 印迹和免疫荧光实验的封闭缓冲液
D-生物素SigmaB4639BDNF 单生物素化缓冲液
DMEM 高糖培养基Gibco11965-092神经元接种
DMEM 培养基Gibco11995-081HEK293 细胞维持
Econo 柱漏斗BioRad7310003层析装置组件
EDTAMerck108418
EZ-ECL 试剂盒Biological Industries1633664通过 Western 印迹检测蛋白质
GlutamaxGibco35050-061神经元和 HEK293 细胞维持
甘油Merck104094BDNF 洗脱缓冲液，Western 印迹实验的裂解缓冲液
Hettich Rotina 46R 离心机Hettich已停产用于清除培养基中碎片的离心机
Hettich Universal 32R 离心机Hettich已停产用于蛋白浓缩器离心的离心机
马血清Gibco16050-122神经元接种
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western 印迹图像采集
咪唑SigmaI55513BDNF 缓冲液修饰组分
KClWinklerBM-1370PBS 组分
KH2PO4Merck104873PBS 组分
层粘连蛋白Invitrogen23017-015用于分隔式神经元的盖片包被
Luer 接头管适配器BioRad7323245层析装置组件
Luminata™ Forte Western HRP 底物MilliporeWBLUF0100通过 Western 印迹检测蛋白质
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF 单生物素化缓冲液
Mowiol 4-88Calbiochem475904免疫荧光实验的封片试剂
MyOne C1 链霉亲和素磁珠Invitrogen65001生物素化验证
Na2HPO4Merck106586BDNF 缓冲液修饰组分
NaClWinklerBM-1630PBS 组分，BDNF 缓冲液修饰组分
NaH2PO4Merck106346BDNF 缓冲液修饰组分
Neurobasal 培养基Gibco21103-049神经元维持
Ni-NTA 琼脂糖珠Qiagen30210BDNF AviTag 纯化
Nikon Ti2-ENikon用于荧光成像的显微镜
硝酸纤维素膜BioRad1620115Western 印迹中的蛋白转膜
ORCA-Flash4.0 V3 数字 CMOS 相机HamamatsuC13440-20CU用于落射荧光成像的相机
P8340 蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340BDNF 缓冲液修饰组分
多聚甲醛Merck104005免疫荧光实验的固定剂
青霉素/链霉素Gibco15140-122神经元维持
多聚-D-赖氨酸CorningDLW354210用于分隔式神经元的盖片包被
多聚-L-赖氨酸MilliporeP2363用于非分隔式神经元的盖片包被
Poly-Prep 层析柱BioRad7311550层析装置组件
聚乙烯亚胺 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 转染
量子点 655 链霉亲和素偶联物InvitrogenQ10121MP用于活细胞和固定细胞实验的单生物素化 BDNF AviTag 标记
皂苷SigmaS4521免疫荧光实验用去垢剂
Syldgard 184 硅酮弹性体基质Poirot4019862微流控腔室制备
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE 凝胶制备
TrisWinklerBM-2000裂解缓冲液组分
Triton X100Merck108603免疫荧光和 Western 印迹实验中的细胞通透化
0.5% 胰蛋白酶-EDTAGibco15400-054HEK293 传代

参考文献

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
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