MRM 微线圈性能校准及在 22 T 条件下对Medicago truncatula根部的应用演示

摘要

介绍了一种利用微线圈进行超高场磁共振显微成像（MRM）以高空间分辨率研究生物组织的实验方案。文中提供了微线圈表征的逐步操作指南。最后，以植物根系为例，展示了成像参数的优化过程。

摘要

本方案描述了一种用于螺线管微线圈与生物样本结合的信噪比（SNR）校准及样本制备方法，适用于高分辨率磁共振成像（MRI），亦称为磁共振显微成像（MRM）。该方法可用于临床前MRI波谱仪，已在 Medicago truncatula 根样品. 微型线圈通过将射频谐振器的尺寸与目标样品的尺寸相匹配，从而在给定的数据采集时间内实现更高的成像分辨率，提高检测灵敏度。由于结构相对简单，螺线管式微型线圈易于构建、成本低廉，并可根据样品需求进行灵活调整。本文系统阐述了如何使用标准参考溶液对新型或自制微型线圈进行校准。校准步骤包括：通过进动曲线确定脉冲功率；评估射频场的均匀性；以及利用标准脉冲序列计算体积归一化的信噪比（SNR）。文中还讨论了小生物样品制备过程中的关键步骤，以及磁化率差异等可能影响成像质量的因素。通过优化后的螺线管线圈，实现了高分辨率（13 × 13 × 13 μm）成像，展示了其在实际应用中的性能。³_, 2.2 pL）根样本的三维成像。

引言

Magnetic resonance imaging is a versatile tool to noninvasively image a wide variety of biological specimens, ranging from humans to single cells^1,2,3. While MRI-scanners for medical imaging applications typically use magnets with a field strength of 1.5 T to 3 T, single-cell applications are imaged at much higher field strengths^1,3,4. The study of specimens at resolutions below a hundred micrometers is referred to as magnetic resonance microscopy (MRM)⁵. However, MRM suffers from a low signal-to-noise ratio (SNR) compared to other available microscopy or imaging techniques (e.g., optical microscopy or CT). Several approaches can be pursued to optimize SNR⁶. One approach is to use a higher magnetic field strength, while a complementary approach is to optimize the signal detector for individual samples. For the latter, the dimensions of the detector should be adjusted to match the dimensions of the sample of interest. For small samples that are ≈0.5-2 mm in diameter (e.g., root tissues), microcoils are useful as the SNR is inversely proportional to the coil diameter^6,7. Resolutions as high as 7.8 x 7.8 x 15 µm³ have been attained on animal cells using dedicated microcoils⁸. A variety of microcoil types exist, with planar and solenoid coils most commonly used depending on the application and tissue geometry⁹. Planar coils have high sensitivity close to their surface, which is useful for applications on thin slices. For example, a method designed specifically for imaging perfused tissue has been described for planar microcoils¹⁰. However, planar coils have a high falloff of sensitivity and no well-defined reference pulse power. Solenoid coils, being cylindrical, have a wider area of application and are more favored for thicker samples. Here, we describe the characteristics of the solenoid coil, a protocol to prepare samples for microcoil MRI, as well as the calibration of a solenoid microcoil (Figure 1A).

The solenoid coil consists of a conducting wire coiled, like a corkscrew, around a capillary holding the sample (Figure 1B). Microcoil assemblies can be constructed using only enameled copper wire, an assortment of capacitors, and a suitable base for soldering the components (Figure 1B). The major advantages are the simplicity and low cost, combined with good performance characteristics in terms of SNR per unit volume and B₁ field homogeneity. The ease of construction enables fast iteration of coil designs and geometries. The specific requirements of solenoid microcoil design and probe characterization (i.e., the theory of electronics, workbench measurements, and spectrometer measurements for a variety of coil geometries) have been described extensively elsewhere^{7,11,12,13,14}.

A solenoid coil can be built by keeping in mind design rules for the desired dimensions according to the guidelines described elsewhere^15,16. In this specific case, a coil was used with an inner diameter of 1.5 mm, made from enameled copper wire, 0.4 mm in diameter, looped around a capillary of 1.5 mm outer diameter. This solenoid is held on a base plate on which a circuit is made, comprised of a tuning capacitor (2.5 pF), a variable matching capacitor (1.5-6 pF) as well as copper connecting wires (Figure 1A, 1C). The tuning capacitor is chosen to achieve the desired resonant frequency of 950 MHz, while the matching capacitor is chosen to achieve the maximum signal transmission at an impedance of 50 Ohm. The larger capacitor is variable to allow for finer adjustment. In regular operation, tuning and matching are performed using capacitors in the probe base. The assembled microcoil needs to be mounted on a probe so that it can be inserted into the magnet. An additional holder may be required, depending on the system. Here we use a 22.3 T magnet combination with a Bruker Console Avance III HD in combination with a Micro5 probe. In this case, we used a modified support insert equipped with the necessary connections to connect to the ¹H channel of the probe (Figure 1A).

The susceptibility-matched design of the coil includes a reservoir with perfluorinated liquid to reduce susceptibility mismatches, arising from the copper coil being in close proximity to the sample¹⁷. A reservoir was made from a plastic syringe to enclose the coil and filled with fomblin. As the perfluorinated liquid needs to enclose the coil, the available diameter for a sample is reduced to an outer diameter of 1 mm. For ease of sample changing, the sample was prepared in a capillary with an outer diameter of 1 mm and an inner diameter of 700 µm. The necessary tools for sample preparation are shown in Figure 2A.

Basic experimental MR parameters are highly dependent on the hardware of the system used, including gradient system, field strength, and console. Several parameters can be used to describe the system performance, of which 90° pulse length and power, B₁-homogeneity and SNR per unit volume (SNR/mm³), are the most practically relevant. SNR/mm³ is useful to compare the performance of different coils on the same system¹⁸. While hardware differences across systems may exist, the uniform application of a benchmarking protocol also facilitates the comparison of system performance.

This protocol focuses on calibration and sample preparation. The stepwise characterization of the performance of solenoid microcoils is shown: calibrating the 90° pulse length or power; assessing the RF- field homogeneity; and calculating SNR per unit volume (SNR/mm³). A standardized spin-echo measurement using a phantom is described to facilitate a comparison of coil designs, which allows for the optimization of distinct applications. Phantom and biological specimen sample preparations, specific for microcoils, are described. The protocol may be implemented on any suitable narrow-bore (≤60 mm) vertical magnet equipped with a commercially available microimaging system. For other systems, it can serve as a guideline and can be used with some adjustments.

Biological specimen preparation for MRI measurements is usually not very extensive since the specimen is imaged as intact as possible. However, air spaces in biological tissue can cause image artifacts due to differences in magnetic susceptibility¹⁹. The effect increases with increasing magnetic field strength²⁰. Thus, air spaces should be avoided at high field strengths, and this might require the immersion of the sample in a fluid to avoid air around the tissue and the removal of air spaces within the tissue structures. Specifically, when microcoils are employed, excision of the desired sample tissue might be required, followed by submerging it in a suitable fluid. This is followed by insertion of the sample into a pre-cut capillary, and finally sealing the capillary with capillary wax. Using wax as a sealant instead of glue, flame-sealing or alternatives, means that the sample may be easily extracted. This procedure is demonstrated on the root of Medicago truncatula, a small leguminous plant. An advantage of this protocol is the potential for subsequent co-registration of MRI data with optical microscopy, since the sample is not destroyed during the MRI measurement.

The presented protocol is suitable for high spatial resolution in situ measurements, and more elaborate designs could allow for imaging in vivo samples, where challenges related to life support systems would need to be addressed.

方案

注意：本方案描述了内径（ID）为 1.5 mm 的螺线管线圈的使用方法及其特性评估流程（图 1）。用于演示该方案的线圈安装在磁化率匹配的储液池中，但本方案同样适用于未匹配磁化率的线圈。该方案可调整用于其他尺寸及不同的波谱仪装置。

1. 参照样品制备

1. 准备 100 mL 的灵敏度参考溶液：将 156.4 mg 的 CuSO₄ ∙ 5 H₂O 溶解于 100 mL GL45 瓶中盛装的 80 mL D₂O 内。硫酸铜可缩短 T₁ 和 T₂ 弛豫时间，从而实现更快的测量；而 D₂O 可防止辐射阻尼和饱和效应。手动搅拌至固体完全溶解。
   1. 用去离子水定容至 100 mL，得到终浓度为 1 g/L 的 CuSO₄（无水，6.3 mM）。该浓度足以缩短 T₁ 和 T₂ 弛豫时间，但又不会过高而引起沉淀。密封参考样品，以防止 H₂O:D₂O 比例发生变化。
2. 可选步骤：将探头连接至网络分析仪，检测线圈是否在目标共振频率下共振。进行 S₁₁ 反射测试，以测量调谐所达到的频率范围，并用于 Q 值测定，具体方法详见 Haase 等人¹⁴ 的描述。使用同轴电缆将微线圈连接至网络分析仪。如有需要，可使用 BNC 转接电缆。
   1. 根据线圈设计所对应的目标磁场强度，在网络分析仪上设定中心频率。随后，将扫描宽度设为 10 MHz。如有，调节微线圈组件上的可变电容，使反射峰的最低点精确对准目标频率。
   2. 记录中心频率处的反射水平，以及 -7 dB 水平处的频率 f₁ 和 f₂。根据 Haase 等人¹⁴ 提供的方法，利用这些数据计算 -7 dB 水平下的 Q 值。

2. 样品制备

1. 若准备用于线圈校准的参考样品，需在体视显微镜下将1 mL的CuSO₄溶液转移至表面皿中。
2. 若准备生物样品，需在体视显微镜下将1 mL全氟十氢化萘（PFD）转移至表面皿中，用于浸没样品。使用PFD的原因在于其可填充样本中的空气间隙，但不会进入生物细胞，且在质子磁共振成像（MRI）中不可见。在尚未使用PFD前，应立即用培养皿盖覆盖表面皿，以防止挥发损失。
   注意：PFD具有高度挥发性，是一种强效的长期温室气体²¹。当无需利用其溶氧特性及低黏度时，可用Fomblin（一种全氟聚醚）替代，后者同样不产生可观测的¹H信号，且挥发速度较慢¹⁷。
3. 根据微线圈支架（18 mm）的内径，裁剪合适外径的毛细管，以便插入并可重新定位（图1C）。使用陶瓷切割器每隔10–12 mm划痕，并在划痕处小心折断。
4. 若准备参考样品，使用镊子和体视显微镜将已预切的毛细管接触表面皿内的CuSO₄溶液表面，利用毛细作用使毛细管完全充满溶液。
5. 若准备生物样品，使用镊子和体视显微镜将已预切的毛细管接触表面皿内PFD的液面，利用毛细作用使毛细管完全充满，并将毛细管释放至表面皿中，使其完全浸没。
   1. 小心地从生长基质（如珍珠岩替代土壤）中取出一个五周龄的完整根系。彻底清除根样上的根鞘。使用镊子去除大颗粒土壤，若存在较小颗粒，则用蒸馏水冲洗根系以去除。如有需要，可拍照以供后续参考。使用解剖刀选取并切下一小段无根鞘的纤维状根。
   2. 进行真空处理时，将样品放入含有适当固定液的1.5 mL离心管中。打开管盖，用封口膜密封管口，再用尖锐工具在膜上打孔，以实现通气。
   3. 将样品管放入真空室，密封真空室，并连接实验室隔膜真空泵。对样品进行最多30分钟的真空处理，以减少生物样品内部的气泡。当观察不到气泡从样品中逸出时，停止真空处理。
   4. 在体视显微镜下，使用镊子将样品浸入先前准备好的浸润介质中，并清洗可能存在的碎屑。
   5. 使用镊子将样品插入毛细管中，操作时确保毛细管和样品均完全浸没，以避免引入气泡。可使用更细的毛细管或注射器针头作为推杆（图2B）。
   6. 使用镊子从介质表面皿中取出含样品的毛细管。若使用PFD，应盖上培养皿盖。
6. 将滤纸捻成细尖状，用于从毛细管两端各去除约1 mm的液体。
7. 使用蜡笔熔化少量毛细管封蜡，并在毛细管两端涂蜡。蜡凝固后会变为不透明。注意避免在毛细管中引入气泡（图2C）。
   注意：避免过度加热蜡或毛细管，否则可能导致样品在冷却过程中发生剧烈沸腾或产生空化气泡。
8. 随后，使用解剖刀刮除毛细管外壁多余的蜡，并用细滤纸擦拭干净。

3. 样品的安装

1. 将微线圈置于体视显微镜下方，用镊子夹取样品插入微线圈中，同时保持微线圈稳定（图 2D).
2. 使用玻璃棒推动毛细管内的样品，使其在螺线管线圈内居中。
3. 可选地，使用胶带固定毛细管的位置。
4. 检查毛细管，确保溶剂线圈内部无可见气泡，以避免因磁化率差异导致的磁共振信号破坏。
5. 将微线圈连接至探针底座的插口，同时保持微线圈竖直向上（图3A,3B).
6. 小心地将三轴梯度线圈滑过微线圈，同时对齐梯度线圈的水冷连接器与探头基座的水冷连接器。图3C将探头底座上的螺纹拧紧，以固定梯度位置。
   注意：此步骤仅适用于 Micro5 探头。对于 Micro2.5 或 Biospect 等其他系统，梯度线圈与探头的连接位于不同的接口插座上。

4. 确定线圈特性

1. 如果线圈为首次测试，应使用参考样品溶液制备均匀样品，用于功率校准 B₁ 均一性测试。由于线圈导线可能引起的敏感性问题，可使用此参考样品轻松检测。
2. 将探头插入磁体，并连接必要的电缆：射频发射/接收电缆、水冷管路、热电偶电缆和空气冷却管路。
3. 设定水冷装置所需的冷却水温度（推荐为298 K）。
4. 设定目标温度（298 K）和目标气体流速（300 L/h）。对于不同的线圈设计或样品体积，气体流速可能有所不同。此步骤仅适用于配备温度控制系统 的系统。
   注意：仅在测试新型（自制）线圈时才需要执行以下步骤。
5. 使用50 Ω同轴电缆将探头连接至网络分析仪，设置合适的扫描带宽（400 MHz），中心频率对准预期的共振频率。
6. 通过调节探头基座中的可变匹配电容和调谐电容来观察共振模式。
7. 调节并匹配共振模式至目标频率。
8. 可选地，使用网络分析仪测定线圈的品质因数（Q值）。一种获取品质因数的方法是使用耦合网络，并将中心频率除以f_c）与反射凹陷在 -7 dB 处的宽度 Q = f_c /(f₁ - f₂)¹⁴设置 f_c 与磁体的工作频率相匹配，同时 f₁ 和 f₂ 左右两侧均设置为 -7 dB 点 f_c，分别。一些网络分析仪内置有Q因子测定功能。
9. 在扫描仪上启动反射测试（通常称为wobble曲线），并根据需要调整调谐和匹配。对于新线圈，建议将所有调谐和匹配电容设置为其调节范围的中点，因此应首先设置较高的频谱扫描宽度。在某些情况下，使用网络分析仪在磁体外对线圈进行调谐和匹配可能更为方便。
10. 如果可用，请为成像探头中体积最大的线圈选择一个匀场文件。如果从之前使用过的线圈开始，则使用现有的匀场文件。如果上述两种选择均不可用，则将所有匀场值设置为0后开始。
11. 如果成像软件中提供微线圈的正确线圈配置，请选择该配置（即, ParaVision）。否则，请根据系统手册创建与线圈规格（如单调谐或双调谐）相匹配的新线圈配置。本研究中使用的内径为1.5 mm的螺线管微线圈，其安全使用限值估计为：峰值功率1 W时持续1 ms，连续功率1 mW。
    注意：微线圈所需的小型电容器（通常尺寸为 1 mm）对高电压极为敏感，容易受损。自动脉冲功率测定在非标准线圈上可能无法正常工作，过高的功率可能导致线圈或其他光谱仪部件损坏。因此，建议进行手动调节。
12. 为新线圈记录摆动曲线，以确定该线圈所需的合适射频功率（图4）。如果线圈的安全限值未知，请从10 µs的脉冲宽度和0.6 W的低脉冲功率开始，然后每次逐步增加1 µs的脉冲长度，直至信号出现。
    1. 在无梯度编码的FID实验中，保持射频脉冲功率恒定，系统性地改变脉冲持续时间。理想的脉冲长度是信号强度达到最大值时的脉冲长度。若测试新线圈，应首先使用10 µs、极低功率的脉冲，并逐步增加脉冲功率。
       注意：如果功率远高于根据线圈特性和波谱仪组合所预期的值，则表明已选择错误的共振模式。
    2. 对于一个具有均匀磁场的线圈 B₁-场，如螺线管线圈，用于确定信号强度降至零的180°脉冲²².
13. 将确定的90°脉冲功率输入所创建实验的调节卡片中。在ParaVision中，可使用参考功率调节卡片来设置硬脉冲功率。
14. 使用定位扫描，设置3个切片，分别位于三个主要轴向上，以确定线圈在磁体中的位置。为此，从光谱仪的默认程序库中加载一个定位扫描序列。建议起始时采用大视野且无偏移的设置。执行自动接收增益调节，并手动启动测量。
    注意：如果样本恰好位于梯度系统的中心，定位扫描将显示样本。如果线圈或样本在图像切片中未居中或缺失，则需要调整定位扫描，此时需重新执行步骤 4.12。
15. 或者，采用一种基于图像评估的互补方法来确定正确的90°脉冲。在利用进动曲线找到近似的脉冲功率后，逐步调整脉冲功率，以检查图像中的B₁-磁场均匀性。对于某些磁场不均匀的线圈 B₁ 在该区域，利用进动曲线确定的90°脉冲功率可能会被高估，从而导致线圈理想热点处的过度翻转。此时，应降低参考脉冲功率，并将新图像与先前图像进行对比检查（图5).
16. 根据FID信号手动调节磁场匀场。初始匀场的推荐顺序为Z-Z²-Z-X-Y-Z-Z²-Z-XY-XZ-YZ-Z。对于螺线管而言，其主对称轴位于XY平面内。因此，不同方向的补偿线圈可能实现更强的校正效果 B₀ 该线圈构型的匀场性良好。高阶匀场线圈影响甚微，可忽略不计。
17. 根据制造商方案改编，计算体积归一化的信噪比，以实现不同系统间微线圈特性的比较¹⁸对于此处使用的微线圈，我们采用自旋回波序列，参数如下：视野（FOV）6 mm × 6 mm，重复时间（TR）1000 ms，回波时间（TE）7 ms，矩阵 256 × 256，层厚 = 0.5 mm。调整层厚直至接收增益为单位值。接着，调整层数，使切片范围延伸至目标区域之外 B₁-磁场均匀性。若可能，记录图像时不进行信号平均。
    1. 确定体积归一化的信噪比（SNR/mm）³）分两步进行。首先，计算体素体积（V_体素)(公式 1)：
          (1)
       注意：单位为 D_x, D_y 和 D_切片 单位为毫米。同样可对一系列切片进行此计算。
    2. 选择感兴趣区域以确定信号强度（µ_{感兴趣区域}样品的信号强度（µ_噪声）和标准差（σ_噪声）用于样本外部区域（即, 信号取自图像中心区域，而噪声信号则通过角部区域计算得出（图6）可使用光谱仪控制软件或通用图像处理软件进行这些计算。如有可能，应使用单次重复，以保持不同线圈之间的可比性。
    3. 使用这些值计算体积归一化的信噪比（公式 2）：
          (2)
       对于此处与参考溶液结合使用的线圈，采用公式2可得到如下解：
          (3)
       注意：在比较不同磁场强度下线圈的信噪比（SNR）时，需要测量模体的弛豫特性²³除非使用非常长的重复时间和非常短的回波时间。
18. 检查由于磁场不均匀性引起的磁敏感性问题：加载并运行多梯度回波（MGE）序列（图7）。由于磁化率差异导致的磁场不均匀性在较长回波时间的图像中可见，因为梯度回波无法重聚焦因静态磁场不均匀性而失相的自旋。因此，样品中的不均匀性（由样品中的空气间隙引起）以及B₀ 由线圈材料引入的磁场不均匀性。使用以下参数，并根据所用波谱仪和线圈的具体规格进行调整：TR 200 ms，TE 3.5 ms，48次回波，回波间隔3.5 ms，翻转角30度。矩阵大小128 x 128。
    注意：如果在共振（摆动）曲线中观察到多个（潜在的）共振模式或反射凹陷，则需针对每个共振模式重复上述步骤，以确定最敏感的模式。根据微线圈的不同，微线圈组件的各个部分可能容易出现非预期的共振模式。

5. 高分辨率成像

1. 使用以下参数运行3D-FLASH实验：TR 70 ms，TE 2.5 ms，矩阵大小为128 x 64 x 64，视场（FOV）1.6 x 0.8 x 0.8 mm，翻转角30°，接收带宽50 kHz。
2. 根据先前确定的参考脉冲功率推导各脉冲功率；大多数成像软件中此步骤可自动完成。使用自动调节方式确定接收增益。如有必要，调整视场（FOV），确保在两个相位编码方向上完全覆盖整个样品，以避免混叠伪影。若系统支持，运行梯度占空比模拟，以确认实验的占空比在梯度线圈的技术规格范围内。
   注意：这些参数针对演示所用线圈设定；必须根据本地系统的具体情况进行优化。

6. 恢复样本以供进一步研究或储存

1. 从微线圈上取下样品毛细管。
2. 使用镊子在体视显微镜下移除石蜡塞。
3. 使用注射器以选定的溶液将样品从毛细管中冲洗出来。或者，使用玻璃推杆将样品推出。
4. 为防止样品脱水，应将其保存在适当的储存介质中。

结果

线圈表征
在成功调节并匹配线圈后，可通过线圈的品质因数（Q因子）、90°参考脉冲以及每立方毫米信噪比（SNR/mm³）来表征其性能。对于本实验中展示的内径为1.5 mm的磁化率匹配螺线管线圈，测得的无负载Q因子为244，而5 mm鸟笼线圈的Q因子为561。

参考90°脉冲在0.6 W功率下的持续时间为12 µs；参见 5 mm鸟笼线圈在45 W下的5 µs（图4 和 图5）。根据公式 ，这对应于微线圈的射频脉冲场强（B₁）为0.53 mT，鸟笼线圈为1.17 mT¹⁴，其中γ为旋磁比，τ为脉冲持续时间。由于脉冲功率（P）不同，可通过发射效率 对线圈进行比较：微线圈和鸟笼线圈的发射效率分别为0.69 mT/W^1/2 和0.18 mT/W^{1/2 14}。通过90°脉冲进行比较，微线圈的灵敏度约为鸟笼线圈的4倍。

磁化率匹配的影响
在超高场强下，样品和线圈的磁化率成为影响图像质量的主要因素，这一点在 图7A,7B与没有磁化率匹配流体储液器的线圈相比，参考样品中的信号保持时间更长且更均匀。然而，由于磁化率储液器的存在，相对于无储液器的线圈，样品的最大尺寸有所减小。

高分辨率成像
在20小时23分钟内，获得了分辨率为13 × 13 × 13 μm³的Medicago truncatula根样本图像（图8）。从根表面开始，可观察到根皮层以及根外部残留的一些水分。此外，木质部呈现为包围韧皮部的暗带。一些气隙表现为完全信号丢失的暗斑。

M. truncatula 的共生根瘤也可使用本方案进行成像（图9）。使用稍大一些的非匹配线圈（长度约 3500 µm，内径 1500 μm），可在 33 分钟内获得分辨率达到 16 × 16 × 16 μm³ 的图像。

图1：螺线管微线圈。（A）螺线管线圈由螺旋缠绕的导线构成，通常缠绕在毛细管周围。导线的几何参数，如其厚度、直径、匝数和线间距，会影响线圈的特性。（B）自制的螺线管微线圈，带有用于磁化率匹配液体（Fomblin）的储液池。该线圈采用直径为0.4 mm的包覆铜线，在外径为1500 µm的毛细管上绕制六圈，线圈长度为3500 µm。线圈浸没在一个由注射器制成的储液池中。可插入外径最大为1000 µm的样品毛细管。使用两个电容器：一个1.5 pF电容器与电感器串联，另一个可变电容器（1.5–6 pF）与电感器并联。所有元件均焊接在一块玻璃纤维板（黄色）上。该装置安装在一个商用支架（灰色聚合物）上，该支架经过改装以支撑储液池。（C）螺线管线圈设计的组成部分：1. 螺线管线圈，2. 样品毛细管，3. 1.5 pF调谐电容器，4. 可变匹配电容器，5. 玻璃纤维基板，6. 铜导线引线。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：体视显微镜下的样品制备。（A）制备微线圈所需的物品。从左到右：1. CuSO₄ 参比溶液，2. 全氟十氢化萘，3. 微线圈，4. 手术刀，5. 正张力镊子，6. 镊子，7. 毛细管外径 = 1000 μm，8. 蜡笔，9. 毛细管封蜡，10. 腈手套，11. 体视显微镜，12. 培养皿盖上的表玻璃皿，13. 生长基质中的植物材料。未显示：2 mL 注射器配 ø 0.8 x 40 mm 针头及细组织纸。（B）使用镊子将样品插入毛细管的特写，操作过程中两者均保持浸没状态。（C）使用熔融石蜡密封毛细管。（D）将制备好的毛细管插入微线圈中。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：显微成像探头的组成部分。（A）Micro5探头底座，包含水冷、加热、温度传感器、梯度功率、射频（可见同轴连接器）以及可选的探头识别（PICS）所需的所有连接部件。探头底座下方设有旋钮，可用于调节可变调谐和匹配电容器，以及固定螺丝，用于将探头稳定固定在波谱仪内部。（B）自制微线圈安装在探头底座上方。注意探头底座上安装的可变电容器（白色陶瓷），用于实现调谐与匹配。（C）集成的三轴梯度线圈安装在探头底座上，配有水冷接口和镀金接地触点。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：倾倒曲线。 通过获取倾倒曲线以确定参考脉冲功率。参考脉冲功率（90°脉冲）定义为产生一个 B₁ 场所需的功率与脉冲长度的组合，该场可将 z 方向上的所有可用磁化矢量翻转至横向平面。在无梯度编码的情况下记录一系列脉冲信号，每次实验中固定脉冲长度或逐步增加脉冲功率。此处脉冲功率设为 0.6 W，脉冲长度每次递增 1 µs。最大信号强度对应 90°脉冲，约为 12 µs。180°脉冲也可通过信号最小强度以此方式确定。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：90°脉冲功率的视觉判定。 在利用进动曲线找到近似的参考脉冲功率后，可通过改变脉冲长度进行目视验证。根据线圈的不同，B₁ 场对变化的敏感程度可能有所差异。（A）11 µs 脉冲长度。（B）12 µs 脉冲长度，适用于此线圈的最佳值。（C）13 µs 脉冲长度。（D）20 µs 脉冲长度。若脉冲功率设置过高，可能发生过度翻转，从而降低线圈中心区域的图像强度（箭头所示）。增强的 B₁ 场还会扩大线圈的作用范围，这可从图像的宽度变化中观察到。请点击此处查看此图的高清版本。

图6：感兴趣区域的放置。 可见用于体积归一化信噪比（SNR）计算的感兴趣区域（ROI）。样品平均强度取自位于参考溶液样品区域内的一个ROI。平均噪声和标准差则通过计算图像角落中一个或多个ROI的数值获得。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：通过梯度回波成像评估射频均匀性。 采用多梯度回波（MGE）序列，利用一系列梯度回波评估射频（B­_1­ 场）的均匀性。基本参数如下：重复时间 200 毫秒，回波时间 3.5 毫秒，回波数量 48，回波间隔 3.5 毫秒，信号平均 64 次，采集时间 27 分 18 秒，翻转角 30°。视野为 5 × 5 毫米，矩阵 128 × 128，分辨率为 39 × 39 × 200 µm。（A）磁化率匹配线圈。围绕射频线圈的磁化率匹配液体（Fomblin）可减少线圈导线引起的磁化率效应。随着回波时间增加，微小气泡导致信号丢失。（B）直径相同的未进行磁化率匹配的线圈。在较长的回波时间下，可观察到由 B₀ 场不均匀性引起的逐渐加重的伪影。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：Medicago truncatula 根切片的三维成像。（上图）FLASH图像。可分辨根切片的多个结构特征，包括表皮（e）、皮层（c）、韧皮部（ph）和木质部（xy）。根部的气隙（a）导致信号完全丢失。基本参数如下：重复时间70 ms，回波时间2.5 ms，累加次数256次，采集时间20小时23分钟。分辨率为13 × 13 × 13 µm³_­。矩阵大小为128 × 64 × 64，视场为1.6 × 0.8 × 0.8 mm。接收带宽50 kHz。（下图）MSME图像。基本参数如下：重复时间500 ms，回波时间5.2 ms，累加次数28次，采集时间15小时55分钟。分辨率为13 × 13 × 13 µm³_­。矩阵大小为128 × 64 × 64，视场为1.6 × 0.8 × 0.8 mm。接收带宽70 kHz。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 9：Medicago truncatula 根瘤的三维成像。（上图）低分辨率图像。基本参数如下：重复时间 60 ms，回波时间 2.3 ms，累加次数 4 次，采集时间 4 分钟。分辨率为 31 × 31 × 31 µm³_­。矩阵大小为 64 × 32 × 32，视野范围为 2 × 1 × 1 mm。接收带宽 50 kHz。（下图）高分辨率图像。基本参数如下：重复时间 60 ms，回波时间 2.3 ms，累加次数 8 次，采集时间 33 分钟。分辨率为 16 × 16 × 16 µm³_­。矩阵大小为 128 × 64 × 64，视野范围为 2 × 1 × 1 mm。接收带宽 50 kHz。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该方案最适合用于生物样品，因为许多材料和地质样品的 T₂ 弛豫时间显著更短，无法通过本实验所用的序列进行成像。即使某些表现出较高磁化率异质性的生物组织，在超高场下也难以成像，因为这些效应与磁场强度相关²⁴。该方案不仅适用于新线圈，还可用于排查和诊断潜在问题。在测试新型或未知样品前，可先对参考溶液执行本方案，以验证实验装置是否按预期正常运行。这有助于故障排查，因为可排除波谱仪本身作为伪影或故障来源的可能性。此外，该过程还可将探头上的调谐和匹配电容设置为微线圈典型的数值。

当首次实验未记录到信号时，可扩大定位扫描的视野以检查是否能观察到样品。接着，重新检查线圈是否已正确调谐，并尝试再次进行定位扫描。线圈可能存在额外的非预期共振模式，此时需要确定正确的共振模式。如果仍然无法获得图像，应取出样品检查其在微线圈组件中的位置，并确认样品完好无损（即密封处无气泡或泄漏）。最后，有可能样品制备时误用水代替了全氟化碳（PFD）。在这种情况下，即使样品本身在定位扫描中信号微弱，毛细管周围的水仍可能被检测到。

由于微线圈理想状态下非常接近样品，空气与导线之间的磁化率差异可能导致额外的信号损失，如图所示 图7B潜在的伪影包括空间错配和异常的信号强度变化。尤其是梯度回波类脉冲序列易受这种不均匀信号丢失的影响。因此，我们提出了一种磁化率匹配的线圈，即将导线浸入氟化惰性液体（Fomblin 或 FC-43）中。 B₁ 本方案中包含的估算方法可用于确定是否 B₁ 磁化率差异的存在要求在设计线圈组件时纳入磁化率匹配策略。构建磁化率匹配线圈的另一种方法是使用磁化率匹配的导线。²⁵此外，该方法仅解决了由线圈引起的磁化率问题。样品内部的磁化率不匹配（例如，由于空气间隙所致）仍然具有挑战性。

气穴或气泡会带来实验挑战，由于空气与液体或样本界面处的磁化率差异，导致严重的信号丢失¹⁹（图5A）。成功制备样本的一个关键环节是确保样本和毛细管均完全浸入液面以下。然而，即使微小的气泡也可能引起信号损失，尤其是梯度回波类序列更为敏感。可通过轻微倾斜毛细管（使其一端略高于另一端）来减轻部分影响。倾斜可使潜在的气泡滞留在较高的一端，从而避免干扰样本。此外，还需确保毛细管封蜡形成良好的密封，因为脱水可能导致形成较大的气泡。

对于样品内部的气隙，采用 PFD 填充细胞间隙中的空气空间，而不会穿透细胞膜²⁶。然而，即使采用这种方法，我们仍无法完全去除所有气隙。此外，这种方法意味着需要引入额外的试剂，而通常出于尽可能非侵入性地研究系统的需求，这种方法并不理想。

毛细管的圆柱形结构意味着灌流装置应当是可行的，尤其适用于易降解的组织，例如活检样本或对活体根系材料中过程的研究。实现灌流装置可分为两个步骤：首先，在毛细管两端分别连接培养基供给管和引流管，即可构建一个恒化器系统；其次，在样品毛细管内增加一个凹陷结构，可使样品在流体流动方向上固定就位。这一点类似于已发表的平面微线圈实验方案¹⁰。

磁共振成像的非侵入性，结合本实验方案中使用的惰性液体（PFD 或 Fomblin），意味着实验完成后，样品可从毛细管中取出，用于进一步研究。可结合的技术包括光学显微镜、电子显微镜及其他破坏性成像技术。我们近期已成功将该方法与光学显微镜联用，用于研究Medicago truncatula根瘤²⁷。

我们展示了一种在超高场核磁共振波谱仪上使用专用微线圈对植物材料进行成像的方法。该方法可在射频场均匀性良好的条件下，以高分辨率研究相对较大的样品体积。此外，光谱成像的分辨率可达到常规条件下无法实现的水平。通过一种高效的方法确定线圈性能参数，有助于根据样品特点优化微线圈设计。该螺线管线圈方法也可便捷地应用于植物以外的其他样品，包括动物组织。 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
参比溶液制备
CuSO4	Sigma-aldrich	469130	用于制备参比溶液的结晶粉末
D2O	Sigma-aldrich	151882	用于制备参比样品的液体
电子天平	Sartorius	PRACTUM513-1S	用于称量化合物的天平
样品制备
毛细管 1000 μm（外径）	Hilbenberg GmbH	1408410	样品毛细管
封蜡	Hampton Research	HR4-328	用于密封样品的固体蜡
一次性手术刀片	Swann-Morton	No. 11	用于切除样品
全氟十氢化萘	Sigma-aldrich	P9900	用于浸没样品的液体
体视显微镜	Olympus	SZ40	台式双目显微镜
注射器	通用	-	用于添加PFD并操作样品
真空泵	Vacuubrand	MZ2C	两级膜式真空泵，用于去除样品中的气泡
蜡笔枪	Hampton Research	HR4-342	手持式蜡笔枪，用于熔化并涂抹毛细管封蜡
成像硬件
22.3 T 磁体	Bruker GmbH	950 US2	窄孔超导磁体
空气冷却器	Bruker GmbH	-	用于调节探头温度
控制台	Bruker GmbH	Avance III HD	控制波谱仪运行
Micro5梯度线圈	Bruker GmbH	Mic5	可拆卸梯度线圈，安装于Micro5探头主体上
Micro5探头主体	Bruker GmbH	Mic5	用于固定微线圈和梯度线圈
射频微线圈	自制	-	内含Fomblin
矢量网络分析仪	Copper Mountain Technologies	TR1300/1	用于执行S11反射率测试，频率范围为300 kHz至1.3 GHz
水冷却器	Bruker GmbH	BCU-20	开环水冷系统，用于耗散梯度线圈工作时产生的热量