本方案描述了制备幼虫和成虫 Drosophila 视叶用于成像的三个步骤：1）脑解剖，2）免疫组织化学染色，3）封片。重点放在第3步，因为观察特定的视叶结构需要不同的封片方向。
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本文内容
摘要
摘要
由视叶、髓质、小叶和小叶板这四个神经复合体组成的黑腹果蝇（Drosophila）视叶，是研究产生神经多样性和驱动神经环路组装的发育机制的理想模型系统。鉴于其复杂的三维结构，对视叶的分析需要明确成体神经复合体与幼虫前体细胞之间的相对位置关系，以及它们与中央脑的相对位置。本文介绍了一种用于视叶成像的幼虫和成体脑组织的解剖、免疫染色及封片实验方案。特别强调了封片方向与视叶空间结构之间的关系。我们描述了三种适用于幼虫的封片策略（腹面朝上、背面朝上和侧面朝上）以及三种适用于成体的封片策略（腹面朝上、背面朝上和水平方向），每种方法均可为特定的视叶结构提供理想的成像角度。
引言
Drosophila 视觉系统由复眼及其下方的视叶组成，是研究神经回路发育与功能的优秀模型。近年来，视叶尤其成为一个强大的系统，可用于研究神经发生和神经回路连接等神经发育过程1,2,3,4,5,6,7,8。视叶由四个神经节构成： lamina、medulla、lobula 和 lobula plate（后两者组成 lobula 复合体）1,2,3,4,5,6。来自复眼的光感受器投射至 lamin....
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方案
1. 准备幼虫大脑用于共聚焦成像
- 解剖
注意：开始解剖前，请准备好固定液（4% 多聚甲醛溶于磷酸盐缓冲液（PBS））和 PBT 溶液（含 0.1–0.3% Triton 的 PBS）。解剖过程中，固定液应置于冰上。尽管本实验方案使用多聚甲醛（PFA）作为固定剂，但已有文献报道针对特定抗原表位可采用其他固定方法（如使用 PLP20 或 PEM21）。进行幼虫解剖时，需准备两对镊子（Dumont #5 或 #55s）。详见材料表。- 首先，在解剖皿的每个孔中加入 400 µL 的 1× PBS。用一对镊子轻轻夹取在培养瓶内壁爬行的三龄游走期幼虫，将其放入 PBS 填充的解剖皿第一孔中。
- 取一只幼虫转移至中间孔。用非惯用手将幼虫身体压在孔底固定。
- 用惯用手轻轻夹住幼虫口钩并向外拉离身体。幼虫脑组织应附着于口钩及附属组织上，随拉扯而完整分离。
- 去除附属的成虫盘组织，并将幼虫脑转移至解剖皿的第三孔。成虫盘为围绕幼虫脑的上皮组织，将来发育为成体结构，如触角、眼、足和翅20。若未去除，成虫盘可能阻碍幼虫脑的正常免疫染色。
- 去除成虫盘时，用一对镊子通过腹神经索牢固夹住脑组织，再用另一对镊子轻轻拔除成虫盘。 ....
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结果
按照本方案中所述方向安装的幼虫和成虫视叶的共聚焦图像分别如图1和图2所示。
图1展示了幼虫大脑在前、后和侧面方向定位的示意图及代表性共聚焦切片。在前向安装方向中，外侧增殖中心（OPC）上皮（DE-钙黏蛋白）、髓质神经母细胞（deadpan>βgal）和原足神经元（Dachshund）以环绕大脑的细胞带形式出现在表面（图1B、D）。OPC沿其背腹轴通过转录因子的差异表达实现空间模式化6,11,12。Vsx1标记中央OPC（cOPC），Optix标记主OPC（mOPC），而Rx在后部OPC（pOPC）中表达，后者代表新月形结构的末端<.......
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种对幼虫和成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑进行免疫染色并以多种方向封片的方法。尽管此前已有文献报道过对幼虫和成年果蝇大脑进行染色的方法22,23,24,27,28，但针对特定视叶结构最佳观察效果的封片策略却较少受到关注28。预计本文所述方案将有助于研究人员更深入理解封片方向与所观察视叶结构之间的关系。
除了本方案中描述的取向外，还可以通过将视叶与中央脑分离，实现成虫和幼虫视叶观察的其他替代角度。可以使用昆虫剪刀、镊子或钨针将视叶从中央脑分离。在成虫中，当中央脑的曲率阻碍视叶的平整封片，导致成像时角度不均匀时，此方法尤为有用。需要注意的是，孤立的视叶在缺少中央脑.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Claude Desplan与我们分享了Bsh抗体的一份样品。DE-钙黏蛋白、Dachshund、Eyes Absent、Seven-up和Bruchpilot单克隆抗体购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）创建，并由爱荷华大学生物系（美国爱荷华州爱荷华市，邮编52242）负责维护。本研究工作得到了授予T.E.的加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金的资助。U.A.获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金的资助。P.V.获得了安大略省研究生奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% 甲醛 | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488（山羊）二抗 | Invitrogen | A-11055 | 使用稀释比例为 1:500 |
| Alexa Fluor 555（小鼠）二抗 | Invitrogen | A-31570 | 使用稀释比例为 1:500 |
| Alexa Fluor 647（豚鼠）二抗 | Invitrogen | A-21450 | 使用稀释比例为 1:500 |
| Alexa Fluor 647（大鼠）二抗 | Invitrogen | A-21247 | 使用稀释比例为 1:500 |
| 盖玻片 | VWR | 48366-067 | |
| 解剖镊 - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| 解剖镊 - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| 解剖皿 | Corning | 722085 | |
| 干擦纸 | Kimbery Clark | 34155 | |
| 山羊抗-Bgal 一抗 | Biogenesis | 使用稀释比例为 1:1000 | |
| 豚鼠抗-Bsh 一抗 | 由 Claude Desplan 惠赠 | 使用稀释比例为 1:500 | |
| 豚鼠抗-Vsx1 一抗 | Erclik 等，2008 | 使用稀释比例为 1:1000 | |
| 实验室封口膜 | Parafilm | PM-996 | |
| 微量离心管 | Sarstedt | 72.706.600 | |
| 显微镜载玻片 | VWR | CA4823-180 | |
| 小鼠抗-dac 一抗 | 发育研究杂交瘤库（DSHB） | mabdac2-3 | 使用稀释比例为 1:20 |
| 小鼠抗-eya 一抗 | DSHB | eya10H6 | 使用稀释比例为 1:20 |
| 小鼠抗-nc82 一抗 | DSHB | nc82 | 使用稀释比例为 1:50 |
| 小鼠抗-svp 一抗 | DSHB | Seven-up 2D3 | 使用稀释比例为 1:100 |
| 聚合粘土 | 可使用任意类型的粘土 | ||
| 兔抗-GFP 抗体 | Invitrogen | A-11122 | 使用稀释比例为 1:1000 |
| 大鼠抗-DE-Cadherin 一抗 | DSHB | DCAD2 | 使用稀释比例为 1:20 |
| Slowfade 封片剂 | Invitrogen | S36967 | 也可使用 Vectashield 封片剂（货号 H-1000） |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
参考文献
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
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重印与许可
