本方案描述了制备幼虫和成虫 Drosophila 视叶用于成像的三个步骤：1）脑解剖，2）免疫组织化学染色，3）封片。重点放在第3步，因为观察特定的视叶结构需要不同的封片方向。
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本文内容
摘要
摘要
由视叶、髓质、小叶和小叶板这四个神经复合体组成的黑腹果蝇（Drosophila）视叶，是研究产生神经多样性和驱动神经环路组装的发育机制的理想模型系统。鉴于其复杂的三维结构，对视叶的分析需要明确成体神经复合体与幼虫前体细胞之间的相对位置关系，以及它们与中央脑的相对位置。本文介绍了一种用于视叶成像的幼虫和成体脑组织的解剖、免疫染色及封片实验方案。特别强调了封片方向与视叶空间结构之间的关系。我们描述了三种适用于幼虫的封片策略（腹面朝上、背面朝上和侧面朝上）以及三种适用于成体的封片策略（腹面朝上、背面朝上和水平方向），每种方法均可为特定的视叶结构提供理想的成像角度。
引言
Drosophila 视觉系统由复眼及其下方的视叶组成，是研究神经回路发育与功能的优秀模型。近年来，视叶尤其成为一个强大的系统，可用于研究神经发生和神经回路连接等神经发育过程1,2,3,4,5,6,7,8。视叶由四个神经节构成： lamina、medulla、lobula 和 lobula plate（后两者组成 lobula 复合体）1,2,3,4,5,6。来自复眼的光感受器投射至 lamina 和 medulla 的靶神经元，这些神经元处理视觉输入并将其传递至 lobula 复合体的神经节1,2,3,4,5,6。随后，lobula 复合体中的投射神经元将视觉信息传送到中枢脑内的高级处理中心1,5,9。视叶复杂的组织结构是为了维持视网膜拓扑映射（retinotopy）以及处理不同类型的视觉刺激而形成的，这使其成为研究复杂神经回路如何组装的理想系统。值得注意的是，medulla 在组织结构和发育过程方面与神经视网膜具有显著相似性，而后者长期以来一直是脊椎动物神经回路发育研究的模型3,8。
视叶的发育始于胚胎发生阶段，由约35个外胚层细胞特化形成视泡2,4,5,6,7,8。幼虫孵化后，视泡进一步分化为两个不同的原基：1）外增殖中心（OPC），产生视叶外层的视网膜和外髓质神经元；2）内增殖中心（IPC），产生内髓质和叶状复合体的神经元4,5,6,10。在二龄幼虫晚期，OPC和IPC的神经上皮细胞开始转变为神经母细胞，随后通过中间神经节母细胞生成神经元4,5,11,12。视叶神经母细胞的发育模式受空间和时间上特异性表达的转录因子调控，这些因子协同作用，使其子代细胞产生神经多样性11,12,13,14。在蛹期，视叶神经纤维网的神经回路通过多种过程的协调组装而成，包括程序性细胞死亡11,15、神经元迁移12,16、轴突/树突靶向10,17、突触形成18,19以及神经纤维网的旋转10,17。
本文介绍了幼虫和成虫大脑的解剖、免疫染色及制片方法，用于视叶成像。由于视叶具有复杂的三维结构，对其分析需要了解成虫神经 Neuropil 以及幼虫前体细胞相对于中央脑的定位关系。因此，我们特别强调了制片时样本的朝向与视叶结构空间排列之间的关系。我们描述了三种适用于幼虫大脑的制片方式（腹面朝上、背面朝上和侧面朝上）以及三种适用于成虫大脑的制片方式（腹面朝上、背面朝上和水平放置），每种方法均可为特定视叶前体细胞群或神经 Neuropil 的成像提供最佳观察角度。
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方案
1. 准备幼虫大脑用于共聚焦成像
- 解剖
注意：开始解剖前，请准备好固定液（4% 多聚甲醛溶于磷酸盐缓冲液（PBS））和 PBT 溶液（含 0.1–0.3% Triton 的 PBS）。解剖过程中，固定液应置于冰上。尽管本实验方案使用多聚甲醛（PFA）作为固定剂，但已有文献报道针对特定抗原表位可采用其他固定方法（如使用 PLP20 或 PEM21）。进行幼虫解剖时，需准备两对镊子（Dumont #5 或 #55s）。详见材料表。- 首先，在解剖皿的每个孔中加入 400 µL 的 1× PBS。用一对镊子轻轻夹取在培养瓶内壁爬行的三龄游走期幼虫，将其放入 PBS 填充的解剖皿第一孔中。
- 取一只幼虫转移至中间孔。用非惯用手将幼虫身体压在孔底固定。
- 用惯用手轻轻夹住幼虫口钩并向外拉离身体。幼虫脑组织应附着于口钩及附属组织上，随拉扯而完整分离。
- 去除附属的成虫盘组织，并将幼虫脑转移至解剖皿的第三孔。成虫盘为围绕幼虫脑的上皮组织，将来发育为成体结构，如触角、眼、足和翅20。若未去除，成虫盘可能阻碍幼虫脑的正常免疫染色。
- 去除成虫盘时，用一对镊子通过腹神经索牢固夹住脑组织，再用另一对镊子轻轻拔除成虫盘。
- 小心去除眼盘，因其覆盖在脑叶表面。去除眼盘时，用一对镊子将脑组织轻压在皿底。此时不要通过腹神经索夹持脑组织，而应轻轻夹住脑叶，注意避免挤压脑叶。再用另一对镊子轻轻拉离眼盘。
注意：眼成虫盘最终将发育为视网膜的感光细胞。若研究者关注视网膜与视叶之间的神经连接，可保留眼盘；但若仅关注视叶结构，则建议去除眼盘，因其位于脑表面可能影响成像质量。
- 重复步骤 1.1.2–1.1.4，直至收集到足够数量的脑组织（或解剖时间达到 30 分钟）。解剖过程不应超过 30 分钟，以确保组织完整性不受影响。
- 解剖结束后，使用 P200 移液器小心吸除第三孔中的 PBS，确保孔内保留少量液体以维持脑组织始终浸没。
注意：在整个实验流程中，必须始终保持脑组织浸没于液体中。若组织干燥，可能导致共聚焦图像中出现非特异性自发荧光，影响染色质量。 - 向第三孔中加入 500 µL 冰冷的固定液。用镊子轻轻搅动液体，使脑组织在皿中旋转。用载玻片盖住解剖皿，并置于冰上固定 30 分钟。
- 吸除固定液，用 400 µL PBT 溶液清洗脑组织，共洗 5 次。
注意：PBT 中的 Triton 是一种去垢剂，可防止脑组织相互粘连或粘附皿壁，并有助于抗体充分渗透组织。
- 免疫组织化学染色
注意：发育研究杂交瘤库（DSHB）提供多种可用于标记特定视叶结构或细胞类型的初级抗体。DE-Cadherin 可标记 IPC 和 OPC 神经上皮，Bruchpilot（Brp）标记发育中的神经毡，Dachshund 标记视叶和叶状体神经元（以及少量髓质神经元）。此外，Elav 可用于标记神经元，Prospero 用于标记成神经节母细胞，Repo 用于标记胶质细胞。- 将抗体加入 PBT 中，配制总体积为 100 µL 的初级抗体溶液。可添加封闭剂（10% 正常山羊血清）以防止初级抗体与组织发生非特异性结合20,22,23。但本实验方案中所用抗体可在无需封闭剂的情况下特异性标记脑组织。
- 吸除最后一次固定后清洗液，加入初级抗体溶液。加抗体前，确保孔中仅残留少量 PBT。加入后，用镊子轻轻搅动脑组织 5–10 次。盖上载玻片，用封口膜密封，于 4 °C 过夜孵育。
- 若具备冷藏轨道摇床，可将解剖皿置于摇床上以优化过夜孵育效果。
注意：初级抗体孵育及后续所有步骤也可在 1.5 mL 微离心管中进行。初级和次级抗体孵育体积仍可保持为 100 µL，但洗涤步骤应使用 800 µL 或更多 PBT。
- 若具备冷藏轨道摇床，可将解剖皿置于摇床上以优化过夜孵育效果。
- 孵育结束后，按前一节步骤 1.1.8 的方法用 PBT 洗去初级抗体。
注意：初级抗体溶液应保存并储存在 4 °C，可用于后续实验。许多初级抗体可重复使用多达四次。 - 向脑组织中加入 400 µL PBT 进行最终清洗。盖上载玻片并用封口膜密封，置于轨道摇床上，室温（RT）低速（100 rpm）孵育约 4 小时。
注意：本步骤可暂停。脑组织可在清洗液中于 4 °C 保存 2–3 天。 - 配制总体积为 100 µL 的次级抗体溶液。
注意：本实验方案中，所有次级抗体均以 1:500 稀释，无需添加封闭剂。 - 吸除孔中 PBT 清洗液，加入次级抗体溶液。用镊子轻轻混匀组织。盖上载玻片和封口膜，置于轨道摇床上室温孵育至少 2 小时。由于次级抗体含有光敏荧光基团，需用铝箔包裹解剖皿避光。
注意：本步骤可暂停。脑组织可在次级抗体溶液中于 4 °C 过夜孵育。 - 按步骤 1.2.3 所述方法洗去次级抗体。向脑组织中加入 400 µL PBT 进行最终清洗。盖上载玻片、封口膜和铝箔，置于摇床上室温孵育 4 小时。
注意：本步骤可暂停。脑组织可在清洗液中于 4 °C 保存 2–3 天。
- 封片
- 吸除最终的 PBT 清洗液，替换为两滴抗荧光淬灭封片剂。将一滴封片剂置于载玻片中央。
- 用镊子将脑组织从孔中转移至载玻片上的封片剂液滴中。为避免损伤视叶，转移时可通过腹神经索夹持脑组织。
- 按照以下封片策略进行封片（图 1A）。
- 腹面朝上
注意：若研究者希望观察前髓质、视叶或叶状体栓神经元，此封片方向最为理想。区分腹面与背面封片的最佳方法是观察腹神经索相对于脑叶的位置。- 采用腹面朝上方向时，可见腹神经索从脑叶上方延伸而出（图 1B）。
- 背面朝上
注意：若研究者希望观察 OPC（pOPC）或 IPC 的后端结构，推荐采用此封片方向10,11。- 采用背面朝上方向时，可见腹神经索从脑叶下方延伸而出（图 1C）。
- 侧面观
注意：侧面封片方向可用于在单一平面上同时观察视叶、髓质或叶状体栓神经元的背腹轴和前后轴分布的半月形结构（图 1G）。- 进行侧面封片时，需将两个脑叶分开，使其侧向平躺，视叶和叶状体栓朝上。
- 使用两对尖头镊子，从腹神经索与脑叶连接处开始将其纵向剪开。注意两个脑叶本身已彼此分离，仅由腹神经索连接。因此，应从脑叶之间的裂口处沿腹神经索向下剪开以完全分离。随后将每个脑叶及其相连的腹神经索翻转至侧面，使外侧面向上。
注意：进行侧面封片时，建议使用细尖钨针辅助调整脑叶位置。为清晰观察封片过程中脑叶的方向及腹神经索走向，可调节显微镜照明。若使用鹅颈 LED 光源，应将光源臂调整至与载玻片表面平行以获得最佳视野。同时可调节光照强度，增强脑结构与背景的对比度，提高封片操作的清晰度。
- 腹面朝上
- 在含脑组织的封片剂两侧各加一滴 PBS。在每滴 PBS 上各放置一片盖玻片，最后在脑组织上方覆盖一片盖玻片。顶部盖玻片的左右边缘应分别搭在两侧的盖玻片上（图 1A）。
注意：在脑组织上方加盖盖玻片前，必须搭建“桥”结构。幼虫脑组织厚度约为 200 µm，为保持组织完整性，需通过搭建桥结构增加盖玻片与载玻片之间的距离。 - 用指甲油密封桥结构边缘，以固定封好的脑组织。
- 使用共聚焦显微镜对脑组织进行成像。
2. 准备成年大脑用于共聚焦成像
- 解剖
注意：成年果蝇脑解剖比幼虫脑解剖更具挑战性，需谨慎操作。强烈建议在此部分实验中至少使用一对超细镊子（Dumont #55）。- 使用针管或果蝇麻醉垫以 CO2 麻醉果蝇，并将其放置于冰上的实验室擦拭纸或纸巾上（以维持麻醉状态）。
- 向玻璃培养皿的三个孔中各加入 400 µL PBS。用一对镊子轻轻夹住一只成年果蝇的翅膀，将其放入培养皿的第一个孔中。
- 用非优势手持镊子将果蝇胸部固定在孔底。用优势手轻轻将头部从身体其余部分拉下。
- 将头部转移至第二个孔中。头部常会漂浮在 PBS 上，难以操作。可用镊子夹住喙部，将其压在孔底固定。
- 用两把镊子剥除两眼之间的头壳区域。由于脑组织紧贴头壳下方，操作时应尽可能轻柔，避免损伤下方组织。逐片剥离头壳，直至脑组织完全暴露。清除附着在脑上的任何附属组织（如视网膜、气管、气囊）。
注意：此前已有文献描述过去除视网膜的方法22,24，但也可将视叶中的小叶（lamina）与其他视叶结构分离。这对于希望研究髓质（medulla）或叶柄复合体（lobula complex）的研究者尤为有用，因为小叶位于表面，在成像时可能遮挡这些其他视叶神经组织的观察。要去除小叶，可用尖头镊子轻轻拉扯小叶与髓质神经组织之间的凹陷处，使小叶逐渐从小叶上剥离。重复此操作直至整个小叶被移除。在此过程中，务必牢固固定脑组织。可用另一把镊子将脑压在培养皿底部，使中央脑的上下部分恰好卡在镊尖之间。牢固夹持中央脑可防止对视叶造成意外损伤。 - 将清理干净的脑组织转移至第三个孔中。重复步骤 2.1.2–2.1.6，直至获得足够数量的脑组织，或解剖时间达到最长 30 分钟为止。
- 吸除第三个孔中的 PBS，加入 500 µL 固定液。确保脑组织在此处及任何洗涤步骤中均不干燥，否则会导致共聚焦图像出现背景荧光。用玻璃盖片覆盖培养皿，室温下固定 20 分钟。
- 固定完成后，用 400 µL PBT 洗涤脑组织 5 次。
注意：本步骤可作为暂停点。脑组织可用玻璃盖片和实验室封口膜覆盖后，在 4 °C 下保存于洗涤液中 2–3 天。对于初次操作该系统的研究人员，可在固定前和固定过程中保留附属组织，以便在单次解剖时间内最大化获取脑样本数量。待组织固定并洗涤后，可在加入一抗溶液前仔细清理脑组织。带有附属组织的成年果蝇脑容易漂浮，因而存在干燥风险。因此，建议在加入固定液时，用镊子小心将所有脑组织聚集于培养皿中央，并在固定后立即进行清理。
- 免疫组织化学
- 按照第 1.2 节中幼虫脑的免疫组织化学方法进行操作。
- 来自 DSHB 的有用一抗包括第 1.2 节幼虫免疫组织化学方案中提到的抗体。完整的抗体列表及相应稀释比例见材料表。
注意：成年果蝇脑在洗涤步骤中需格外小心，因其可能漂浮至洗涤液表面，在移除液体时易附着于孔壁而干燥（这将导致背景荧光）。建议一手持移液器加液或吸液，另一手持镊子保持脑组织浸没于液体中。
- 封片
- 在封片前，用 PBS（而非 PBT）进行最后一次洗涤。PBS 会使脑组织略微变黏，有助于在封片过程中保持所需的方向。
- 吸除最后一次洗涤液，替换为三滴荧光安全封片剂。将一滴封片剂置于载玻片中央。
- 用镊子将脑组织从孔中转移至载玻片上的液滴中。为避免损伤视叶并防止组织干燥，应通过毛细作用小心取出脑组织。缓慢闭合镊尖夹住脑组织，使含有脑组织的小体积液体被吸入镊尖之间。
注意：转移脑组织至载玻片时，切勿闭合镊子，以免损伤脑组织。也可使用 P200 移液器转移脑组织。可剪去吸头末端以扩大开口，并预先用 PBT 冲洗，防止脑组织黏附于吸头内壁。 - 按照以下策略进行脑组织封片（图 2A）。
- 腹面朝上
注意：为观察小叶和髓质神经元，应将脑组织腹面朝上放置（图 2B）。可通过观察中央触角叶的解剖结构和曲率来判断方向。- 用镊子轻轻将脑组织侧放，观察其腹面和背面。可见腹面脑组织曲率明显，触角叶略向外突出。
- 背面朝上
- 将脑组织背面（平坦面）朝上，触角叶朝下放置（图 2C）。
注意：此方向可使叶柄和叶柄板更接近成像平面，适用于希望观察叶柄复合体神经元的研究者。
- 将脑组织背面（平坦面）朝上，触角叶朝下放置（图 2C）。
- 水平视角
注意：为同时观察所有视叶神经组织，可采用水平封片策略（图 2G）。在此方向下，神经元胞体、轴突走向和树突分支可在同一平面上被观察。- 首先将脑组织腹面朝上放置。用钨针轻轻将脑组织向上倾斜 90°，使其背侧着地，触角叶朝外。确认在此方向下脑组织的腹面和背面均可见。
- 腹面朝上
- 不使用盖玻片桥，而用黏土将盖玻片垫高。使用黏土便于成像后重新封片（详见讨论部分）。
- 在盖玻片的每个角上放置一小块黏土。确保每块黏土厚度大致相同，厚度应在 0.5–1 mm 之间。轻轻将盖玻片覆盖在脑组织上，并对四角施加轻微压力。盖玻片应立即吸附液体并形成密封。载玻片现已准备好用于成像。
注意：若需长期保存载玻片，建议用指甲油密封盖玻片，并在 4 °C 避光保存。
- 在盖玻片的每个角上放置一小块黏土。确保每块黏土厚度大致相同，厚度应在 0.5–1 mm 之间。轻轻将盖玻片覆盖在脑组织上，并对四角施加轻微压力。盖玻片应立即吸附液体并形成密封。载玻片现已准备好用于成像。
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结果
按照本方案中所述方向安装的幼虫和成虫视叶的共聚焦图像分别如图1和图2所示。
图1展示了幼虫大脑在前、后和侧面方向定位的示意图及代表性共聚焦切片。在前向安装方向中，外侧增殖中心（OPC）上皮（DE-钙黏蛋白）、髓质神经母细胞（deadpan>βgal）和原足神经元（Dachshund）以环绕大脑的细胞带形式出现在表面（图1B、D）。OPC沿其背腹轴通过转录因子的差异表达实现空间模式化6,11,12。Vsx1标记中央OPC（cOPC），Optix标记主OPC（mOPC），而Rx在后部OPC（pOPC）中表达，后者代表新月形结构的末端<...
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种对幼虫和成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑进行免疫染色并以多种方向封片的方法。尽管此前已有文献报道过对幼虫和成年果蝇大脑进行染色的方法22,23,24,27,28，但针对特定视叶结构最佳观察效果的封片策略却较少受到关注28。预计本文所述方案将有助于研究人员更深入理解封片方向与所观察视叶结构之间的关系。
除了本方案中描述的取向外，还可以通过将视叶与中央脑分离，实现成虫和幼虫视叶观察的其他替代角度。可以使用昆虫剪刀、镊子或钨针将视叶从中央脑分离。在成虫中，当中央脑的曲率阻碍视叶的平整封片，导致成像时角度不均匀时，此方法尤为有用。需要注意的是，孤立的视叶在缺少中央脑...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Claude Desplan与我们分享了Bsh抗体的一份样品。DE-钙黏蛋白、Dachshund、Eyes Absent、Seven-up和Bruchpilot单克隆抗体购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）创建，并由爱荷华大学生物系（美国爱荷华州爱荷华市，邮编52242）负责维护。本研究工作得到了授予T.E.的加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金的资助。U.A.获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金的资助。P.V.获得了安大略省研究生奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% 甲醛 | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488（山羊）二抗 | Invitrogen | A-11055 | 使用稀释比例为 1:500 |
| Alexa Fluor 555（小鼠）二抗 | Invitrogen | A-31570 | 使用稀释比例为 1:500 |
| Alexa Fluor 647（豚鼠）二抗 | Invitrogen | A-21450 | 使用稀释比例为 1:500 |
| Alexa Fluor 647（大鼠）二抗 | Invitrogen | A-21247 | 使用稀释比例为 1:500 |
| 盖玻片 | VWR | 48366-067 | |
| 解剖镊 - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| 解剖镊 - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| 解剖皿 | Corning | 722085 | |
| 干擦纸 | Kimbery Clark | 34155 | |
| 山羊抗-Bgal 一抗 | Biogenesis | 使用稀释比例为 1:1000 | |
| 豚鼠抗-Bsh 一抗 | 由 Claude Desplan 惠赠 | 使用稀释比例为 1:500 | |
| 豚鼠抗-Vsx1 一抗 | Erclik 等，2008 | 使用稀释比例为 1:1000 | |
| 实验室封口膜 | Parafilm | PM-996 | |
| 微量离心管 | Sarstedt | 72.706.600 | |
| 显微镜载玻片 | VWR | CA4823-180 | |
| 小鼠抗-dac 一抗 | 发育研究杂交瘤库（DSHB） | mabdac2-3 | 使用稀释比例为 1:20 |
| 小鼠抗-eya 一抗 | DSHB | eya10H6 | 使用稀释比例为 1:20 |
| 小鼠抗-nc82 一抗 | DSHB | nc82 | 使用稀释比例为 1:50 |
| 小鼠抗-svp 一抗 | DSHB | Seven-up 2D3 | 使用稀释比例为 1:100 |
| 聚合粘土 | 可使用任意类型的粘土 | ||
| 兔抗-GFP 抗体 | Invitrogen | A-11122 | 使用稀释比例为 1:1000 |
| 大鼠抗-DE-Cadherin 一抗 | DSHB | DCAD2 | 使用稀释比例为 1:20 |
| Slowfade 封片剂 | Invitrogen | S36967 | 也可使用 Vectashield 封片剂（货号 H-1000） |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
参考文献
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