本文介绍了一种在囊性纤维化（CF）斑马鱼胚胎中进行Pseudomonas aeruginosa感染及噬菌体治疗应用的实验方案。
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摘要
摘要
由于诊断不确定性及抗菌药物过度处方，抗菌药物耐药性已成为全球范围内严重感染、并发症和死亡的重要原因，对社会和医疗系统造成巨大影响。特别是免疫系统受损或患有囊性纤维化（CF）等基础性慢性疾病的患者，常需频繁接受抗生素治疗以控制感染，从而导致多重耐药菌株的出现与传播。因此，迫切需要开发替代疗法以应对细菌感染。利用噬菌体（细菌的天然天敌）可能是一种可行的解决方案。本研究详述了一种针对囊性纤维化斑马鱼胚胎中铜绿假单胞菌感染的噬菌体疗法应用方案。通过将斑马鱼胚胎感染铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），验证噬菌体疗法对P. aeruginosa感染的有效性，结果显示该疗法可降低CF胚胎的死亡率、减轻细菌负荷并抑制促炎性免疫反应。
引言
噬菌体疗法利用细菌的天然天敌来对抗细菌感染，随着细菌对抗生素的耐药性日益普遍，该疗法正重新受到广泛关注1,2。这种疗法在东欧已应用数十年，可作为囊性纤维化（CF）患者肺部感染治疗中抗生素的辅助手段，也可能为感染了对所有现有抗生素均耐药细菌的患者提供一种潜在的治疗替代方案2,3。抗生素疗法的优势在于噬菌体可在感染部位自我增殖，而抗生素则会被机体代谢并排出体外4,5。事实上，不同实验室分离出的烈性噬菌体混合制剂已在多种动物模型（包括昆虫和哺乳动物）中被证实对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染具有治疗效果6,7,8。在一项随机临床试验中，噬菌体疗法也被证明能够减轻由铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和大肠杆菌（Escherichia coli）引起的烧伤创口的细菌负荷9
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方案
成年斑马鱼（Danio rerio）来自AB品系（欧洲斑马鱼资源中心 EZRC）的斑马鱼，依照国际（欧盟指令 2010/63/EU）和国家指南（意大利法令 4th 2014年3月，第26号）关于用于科学目的动物的保护。鱼类饲养设施采用标准条件，光照周期为14小时光照/10小时黑暗，水温维持在28° C。
1. 溶液和工具的准备
- 配制用于培养斑马鱼胚胎的50倍浓缩储备液和1倍工作浓度的E3胚胎培养基（见表1）。
- 配制色素阻断溶液，用于从受精后24小时（24 hpf）起阻断胚胎色素形成（见表1）。
- 按照表1所述方法配制25倍浓缩储备液和1倍工作浓度的Tricaine麻醉剂溶液。
注意：为避免反复冻融对储备液造成损害，建议将25倍浓度的Tricaine溶液分装为每管2 mL，于-20 °C保存。 - 通过在可微波加热的烧瓶或瓶中将1 g琼脂糖溶解于100 mL蒸馏H2O中，制备胚胎显微注射用凹槽模具。微波加热1–3分钟，直至琼脂糖完全溶解。
- 将斑马鱼显微注射模具（见材料表）倒置于培养皿（90 mm × 15 mm）中，并倾倒液态琼脂糖凝胶覆盖整个表面，形成宽度约为10 mm的....
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结果
此处展示的结果和图示涉及通过注射cftr吗啉代寡核苷酸（morpholinos）生成的囊性纤维化（CF）胚胎，具体方法如前文10及步骤5所述。为验证CF表型，参考了先前描述的内脏器官（如心脏、肝脏和胰腺）位置异常的情况17（图1）。在野生型（WT）胚胎中获得的结果与我们先前发表的研究结果一致19。
在感染PAO1的CF胚胎中，噬菌体治疗降低了细菌负荷。此外，我们通过研磨15个胚胎为一组，在8 hpi时评估细菌负荷：PAO1感染胚胎中平均细菌数量（cfu/胚胎）在给予噬菌体治疗后降至约20%，从而证实噬菌体混合物的存在使感染程度显著减轻（图2）。
在感染GFP+细菌PAO1的CF胚胎中，噬菌体疗法降低了死亡率。
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讨论
在本研究中，我们描述了在斑马鱼胚胎中进行P. aeruginosa（PAO1）感染的实验方案，以及如何应用先前鉴定出的可感染PAO1的噬菌体混合物进行噬菌体治疗以清除感染。近年来，由于多重耐药（MDR）细菌感染的广泛传播对公共卫生构成严重威胁，噬菌体作为抗生素治疗的替代手段日益受到关注。当然，本研究的范围仅限于在动物模型中应用噬菌体治疗，而非人类。然而，我们通过注射靶向cftr基因的吗啉代寡核苷酸构建了囊性纤维化斑马鱼模型，证明了噬菌体治疗在该易感P. aeruginosa感染的病理模型中同样具有疗效。
值得注意的是，我们能够轻松实现噬菌体治疗，因为在之前的研究中，我们已分离并鉴定出多种能够在体外和体内感染P. aeruginosa的噬菌体8。这一步骤对于获得噬菌体的抗菌活性至关重要。分离和鉴定能够感染特定细菌菌株的噬菌体是噬菌体治疗应用中的关键步骤。事实上，为了避免噬菌体对动物或人类宿主产生不良影响，必须使用裂解性噬菌体，而非溶原性噬菌体。更重要的是，必须检测噬.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由意大利囊性纤维化基金会（FFC#22/2017；Associazione “Gli amici della Ritty" Casnigo 和 FFC#23/2019；Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂 | BD | 214010 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | 通用名：三卡因（tricaine） |
| Femtojet 显微操作仪 | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-琼脂糖 | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 甲基蓝 | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| 显微注射针 | Harvard apparatus | ||
| N-苯基硫脲 >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| 寡核苷酸吗啉代 | Gene Tools | 由研究人员设计 | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| 酚红溶液 | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 蛋白酶 K | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| 氯化钠 ACS 级试剂，≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 体视显微镜 | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 胰蛋白胨 | Oxoid | LP0042B | |
| 酵母提取物 | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS 显微注射模具 | Word Precision Instruments |
参考文献
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A.
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