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方法文章

噬菌体疗法应用于囊性纤维化斑马鱼胚胎中以对抗Pseudomonas aeruginosa感染

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DOI：

10.3791/61275

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2020年5月12日

 ,  ,  ,  , 
1Dipartimento di Scienze Cliniche e Comunità, Università degli Studi di Milano, 2Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Milano, LITA, 3Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Milano

本文内容

摘要

本文介绍了一种在囊性纤维化（CF）斑马鱼胚胎中进行Pseudomonas aeruginosa感染及噬菌体治疗应用的实验方案。

摘要

由于诊断不确定性及抗菌药物过度处方，抗菌药物耐药性已成为全球范围内严重感染、并发症和死亡的重要原因，对社会和医疗系统造成巨大影响。特别是免疫系统受损或患有囊性纤维化（CF）等基础性慢性疾病的患者，常需频繁接受抗生素治疗以控制感染，从而导致多重耐药菌株的出现与传播。因此，迫切需要开发替代疗法以应对细菌感染。利用噬菌体（细菌的天然天敌）可能是一种可行的解决方案。本研究详述了一种针对囊性纤维化斑马鱼胚胎中铜绿假单胞菌感染的噬菌体疗法应用方案。通过将斑马鱼胚胎感染铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），验证噬菌体疗法对P. aeruginosa感染的有效性，结果显示该疗法可降低CF胚胎的死亡率、减轻细菌负荷并抑制促炎性免疫反应。

引言

噬菌体疗法利用细菌的天然天敌来对抗细菌感染，随着细菌对抗生素的耐药性日益普遍，该疗法正重新受到广泛关注1,2。这种疗法在东欧已应用数十年，可作为囊性纤维化（CF）患者肺部感染治疗中抗生素的辅助手段，也可能为感染了对所有现有抗生素均耐药细菌的患者提供一种潜在的治疗替代方案2,3。抗生素疗法的优势在于噬菌体可在感染部位自我增殖，而抗生素则会被机体代谢并排出体外4,5。事实上，不同实验室分离出的烈性噬菌体混合制剂已在多种动物模型（包括昆虫和哺乳动物）中被证实对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染具有治疗效果6,7,8。在一项随机临床试验中，噬菌体疗法也被证明能够减轻由铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和大肠杆菌（Escherichia coli）引起的烧伤创口的细菌负荷9。

斑马鱼（Danio rerio）近年来已成为研究多种病原体感染的有价值模型，包括P. aeruginosa10,11、Mycobacterium abscessus和Burkholderia cepacia12,13。通过将细菌直接显微注射到胚胎血液循环中14，可轻松建立全身性感染，该感染会受到斑马鱼先天免疫系统的抵抗，其进化上保守的中性粒细胞和巨噬细胞生成过程与人类相似。此外，在出生后的第一个月内，斑马鱼胚胎缺乏适应性免疫反应，使其成为研究先天免疫的理想模型，而先天免疫是人类肺部感染中的关键防御机制15。斑马鱼最近也作为一种强大的遗传模型系统，被用于深入理解囊性纤维化（CF）的发病机制并开发新的药理治疗方法10,16,17。通过向斑马鱼注射吗啉代寡核苷酸构建的cftr基因敲低CF斑马鱼模型表现出呼吸爆发反应减弱以及中性粒细胞迁移减少10，而cftr基因敲除则导致内脏器官位置异常和外分泌胰腺破坏，这一表型与人类疾病表现相似16,17。最引人关注的是研究发现，在感染后8小时（hpi），cftr功能缺失突变胚胎中的P. aeruginosa细菌负荷量显著高于对照组，这一结果与小鼠和人类支气管上皮细胞的研究结果一致2,18。

在本研究中，我们证明了噬菌体疗法对斑马鱼胚胎中的P. aeruginosa感染具有疗效。

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方案

成年斑马鱼（Danio rerio）来自AB品系（欧洲斑马鱼资源中心 EZRC）的斑马鱼，依照国际（欧盟指令 2010/63/EU）和国家指南（意大利法令 4th 2014年3月，第26号）关于用于科学目的动物的保护。鱼类饲养设施采用标准条件，光照周期为14小时光照/10小时黑暗，水温维持在28° C。

1. 溶液和工具的准备

  1. 配制用于培养斑马鱼胚胎的50倍浓缩储备液和1倍工作浓度的E3胚胎培养基（见表1）。
  2. 配制色素阻断溶液，用于从受精后24小时（24 hpf）起阻断胚胎色素形成（见表1）。
  3. 按照表1所述方法配制25倍浓缩储备液和1倍工作浓度的Tricaine麻醉剂溶液。
    注意：为避免反复冻融对储备液造成损害，建议将25倍浓度的Tricaine溶液分装为每管2 mL，于-20 °C保存。
  4. 通过在可微波加热的烧瓶或瓶中将1 g琼脂糖溶解于100 mL蒸馏H2O中，制备胚胎显微注射用凹槽模具。微波加热1–3分钟，直至琼脂糖完全溶解。
  5. 将斑马鱼显微注射模具（见材料表）倒置于培养皿（90 mm × 15 mm）中，并倾倒液态琼脂糖凝胶覆盖整个表面，形成宽度约为10 mm的凹槽结构。
  6. 待琼脂糖凝固后移除模具。向培养皿中加入1倍E3胚胎培养基。该模具可在4 °C保存约一周。使用前需更换为含Tricaine的新鲜E3培养基。
    注意：陈旧的模具可能滋生真菌或细菌污染。
  7. 使用火焰抛光的10 cm硼硅酸盐毛细管制备显微注射针头，并通过拧紧手柄将其固定在微电极拉制仪上。设置拉制仪参数如下：加热值500，速度100，时间150，拉力150。

2. P. aeruginosa（PAO1）接种物制备

  1. 挑取1个GFP+ P. aeruginosa 菌株PAO119的单菌落，接种于5 mL LB液体培养基中（见表1），在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
  2. 将上述过夜培养物按OD600 = 0.1的比例接种至10 mL LB液体培养基中，在37 °C、200 rpm振荡条件下培养至OD600 = 0.5。
  3. 取2 mL培养物，在4 °C、16,100 x g条件下离心2分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于1 mL生理溶液中，调节OD600至1（相当于约1 × 109 cfu/mL）（见表1）。
  4. 用生理溶液将菌悬液稀释至约5 × 107 cfu/mL，置于4 °C保存。

3. 噬菌体储备液的制备

  1. 挑取1个铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）PAO1菌株的单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37 °C振荡培养过夜。将过夜培养物按OD600 = 0.01的比例稀释至500 mL LB液体培养基中，37 °C振荡培养至OD600 = 0.05，相当于约2.5 × 107 cfu/mL。
  2. 向稀释后的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）培养物中加入约1.25 × 107个噬菌体，使感染复数（M.O.I.）为10-3。37 °C振荡培养，直至OD600下降至约0.1–0.3（约需3至5小时，具体时间取决于所用噬菌体）。
    注意：本实验选用四种可感染PAO1菌株的噬菌体：两种属于短尾噬菌体科（Podoviridae），GenBank登录号分别为vB_PaeP_PYO2（MF490236）和vB_PaeP_DEV（MF490238）；两种属于肌尾噬菌体科（Myoviridae），分别为vB_PaeM_E215（MF490241）和vB_PaeM_E217（MF490240）。以下步骤需对每种噬菌体 分别进行。
  3. 将裂解液与1 mg/mL的DNase和RNase在37 °C孵育30分钟。在4 °C下以5,000 x g离心30分钟，小心收集上清液（SN）。使用孔径为0.8 μm的滤器过滤上清液。
  4. 向上清液中加入58 g/L NaCl和105 g/L PEG6000，室温下搅拌20分钟使其溶解，然后在4 °C静置过夜。在4 °C下以20,000 x g离心30分钟以沉淀噬菌体。弃去上清液，小心地将噬菌体沉淀溶解于15 mL TN缓冲液中（见表1）。
  5. 采用CsCl密度梯度法纯化噬菌体，具体步骤如下：
    1. 在适用于SW41转子的聚丙烯离心管中，通过分层加入表1中所述的四种CsCl溶液，制备CsCl阶梯密度梯度。 在每根离心管中加入3.5 mL噬菌体悬液。
      注意：CsCl具有毒性，操作和废弃时应采取适当的安全防护措施。
    2. 将离心管放入转子中，并确保管子配平（相对位置的两管重量差不得超过0.01 g）。
    3. 在4 °C、100,000 x g（SW41转子25,000 rpm）条件下离心2小时。离心结束后，缓慢取出离心管并小心固定于支架上。使用带有19 G针头的注射器吸取通常位于密度d=1.5与d=1.4区域之间的白色或乳白色条带。
    4. 将注射器中的悬液转移至适用于SW60转子的新聚丙烯离心管中，并使用d=1.4的溶液精确配平离心管。
    5. 在4 °C、150,000 x g（SW60转子38,000 rpm）条件下离心至少16小时。
    6. 如上所述收集可见条带（参见步骤3.3.3），将其转移至截留分子量为6,000 Da的透析袋中。先用500 mL去离子水透析2次，每次20分钟，再在500 mL TN缓冲液中透析过夜。使用0.22 µm孔径滤器过滤后，于4 °C保存。

4. 噬菌体混合物的制备

  1. 制备四种感染PAO1菌株的噬菌体混合物，这些噬菌体此前已被分离并表征8。混合前，通过噬菌斑测定法估算每种噬菌体储备液的滴度20。
  2. 在每次实验前，将四种噬菌体制剂按相同的pfu/mL浓度等量混合，配制总滴度为5 × 108 pfu/mL的噬菌体鸡尾酒溶液，以确保噬菌体滴度准确。 

5. 斑马鱼胚胎的收集与制备，用于cftr吗啉代寡核苷酸的显微注射

注意：从野生型斑马鱼中收集1-2细胞期胚胎，用于cftr吗啉代寡核苷酸（cftr-MOs）的显微注射。

  1. 在细菌显微注射实验前两天，按先前所述方法设置交配对并收集胚胎21。实验所用成年斑马鱼（Danio rerio）AB品系购自欧洲斑马鱼资源中心（EZRC）。
  2. 次日，在受精后立即使用塑料移液管或细网筛收集胚胎。将收集的胚胎置于含有E3胚胎培养基的培养皿中，并用塑料移液管小心去除碎片，以避免可能损害胚胎发育的污染。
  3. 通过将两种吗啉代寡核苷酸储备液（1 mM）稀释于无菌水中，配制5 µL的吗啉代注射溶液，最终浓度为每胚胎0.25 pmol ATG-MO + 每胚胎0.25 pmol splice-MO。为追踪胚胎注射过程，向吗啉代注射混合液中加入0.5 µL酚红。
  4. 使用带有细长加样尖端的20 μL微量移液器，吸取约5 μL吗啉代混合溶液并装入显微注射针中。将注射针固定在连接支架的显微操作器上，并置于体视显微镜下定位。
    注：溶液无需到达针尖，因显微注射仪的泵压会将其推出。
  5. 用无菌精细镊子剪断注射针尖端。通过显微镜目镜中的标尺测量液滴直径。或者，可在千分尺载玻片上滴加一滴矿物油，通过将溶液注入油滴中以评估液滴大小，从而设定显微注射体积。使用直径为156 μm的液滴对应2 nL的注射体积。
  6. 调节显微注射仪，设定补偿压力为15 hPa，注射时间为0.5 s，注射压力在300至600 hPa之间，根据所用注射针调整以获得准确的注射体积。
  7. 用塑料移液管将步骤5.2中准备的胚胎排列在直径为96 mm培养皿内的玻璃片上。
    注：E3培养基过多会阻碍显微注射针顺利穿透胚胎的绒毛膜。
  8. 用注射针穿透胚胎的绒毛膜，继而刺入卵黄，向每个胚胎注射2 nL溶液，操作方法如先前所述22。
  9. 将注射后的胚胎转移至含有E3培养基的培养皿中，放入28 °C培养箱中继续培养至次日。

6. 斑马鱼胚胎的细菌与噬菌体混合物显微注射

注意：进行全身感染实验时，胚胎必须具备血液循环，血液循环通常在受精后26小时开始。

  1. 在受精后26小时（关于斑马鱼发育阶段参见Kimmel21），使用蛋白酶溶液去除胚胎的卵膜，该溶液通过将蛋白酶粉末溶于E3培养基中配制而成，浓度为2 mg/mL。轻轻吹打胚胎以破坏卵膜。弃去含蛋白酶的E3培养基，并用新鲜E3培养基多次冲洗培养皿，彻底去除残留蛋白酶。
  2. 在注射前约5分钟，将斑马鱼胚胎置于含有Tricaine的E3培养基中进行麻醉。
  3. 用移液器将麻醉后的胚胎转移至步骤1中制备好的凹槽中。使用细小的凝胶上样枪头将胚胎排列成侧卧位置。
  4. 用约5 μL的P. aeruginosa菌液（如第5部分所述制备）装填显微注射针。
  5. 从胚胎背部插入注射针，针尖位于Cuvier管起始处，即开始扩散覆盖卵黄囊的位置。注射1–3 nL体积，确保液体直接在Cuvier管内扩散并进入循环系统。
  6. 大约每注射50个胚胎后，向含有100 μL无菌PBS的1.5 mL离心管中滴加一滴细菌悬液，以检测注射体积是否保持恒定。将接种物涂布于LB琼脂平板（见Table 1），在37 °C过夜培养，以测定菌落形成单位（CFU）。
  7. 将完成显微注射的胚胎转移至两个洁净的培养皿中，加入新鲜E3培养基和PTU，并在28 °C条件下孵育。 
  8. 在两个选定的时间点（细菌注射后30分钟或3小时），从孵箱中取出一个含有细菌注射胚胎的培养皿，按照步骤6.3 所述方法将胚胎排列于凹槽中，用于噬菌体混合物的注射。
  9. 使用细小的凝胶上样枪头吸取约5 μL噬菌体混合物（步骤4中制备），装入显微注射针中，并将其固定至显微注射仪（见步骤5）。
  10. 向先前已注射细菌的胚胎的Cuvier管内注射噬菌体混合物。
  11. 将完成噬菌体注射的胚胎转移至两个洁净的培养皿中，加入新鲜E3培养基和PTU，并在28 °C条件下孵育。

7. 注射了PAO1和噬菌体的胚胎中细菌负荷的评估

  1. 在感染后8小时，用移液器将培养皿中的15个麻醉胚胎转移至1.5 mL离心管中。
  2. 用300 μL含1% Triton X-100的PBS（PBSTritonX）替换麻醉溶液，并通过至少15次将胚胎经由带有无菌27-G针头的胰岛素注射器反复抽打，以实现胚胎的匀浆化。
  3. 在无菌PBS中制备匀浆液的系列稀释液：将100 μL稀释后的匀浆液转移至900 μL无菌PBS中。
  4. 为筛选天然氨苄青霉素抗性的PAO1菌株，取100 μL稀释液接种于添加氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
  5. 次日，计数菌落数量，乘以稀释倍数以确定总CFU数，再除以匀浆的胚胎数量，得到每个感染胚胎的平均CFU数。

8. 注射PAO1和噬菌体后胚胎致死率的评估

  1. 为评估 PAO1 感染的致死性，在 20 hpi 时于体视显微镜下对注射后的胚胎进行评分，并计数死亡胚胎（白色/不透明）。
  2. 计算 PAO1 的半数致死浓度（LD50），即在 20 hpf 时导致 50% 注射胚胎死亡的剂量。

9. 用于GFP+ PAO1感染的体视显微镜延时成像的胚胎制备

  1. 通过将1.5%低熔点琼脂糖溶解于100 mL E3溶液中，制备用于活体胚胎成像的模具。
  2. 加入1%三卡因（见表1）以麻醉胚胎。
  3. 在感染后4小时（4 hpi），用塑料移液管将一个胚胎转移至玻璃底培养皿中，并加入温热的低熔点琼脂糖溶液。
  4. 将玻璃底培养皿置于体视显微镜下，用移液枪头调整胚胎至所需方向。使用塑料移液管小心地在胚胎上滴加一滴琼脂糖溶液。
  5. 让琼脂糖冷却5–10分钟，然后轻轻向玻璃底培养皿中加入含有麻醉剂的E3溶液，以保持胚胎湿润。
  6. 将含有胚胎的玻璃底培养皿置于配备荧光滤光片（488 nm通道）的荧光体视显微镜下，用于检测GFP+细菌。在9、14和18 hpi进行相同参数的后续成像前，不要移除培养皿。

10. 促炎性细胞因子的表达分析

  1. 在20 hpi时，用1×三卡因溶液麻醉胚胎，并将胚胎从培养皿转移至1.5 mL离心管中。
  2. 在通风橱内移除麻醉溶液，加入200 μL盐酸胍试剂。
  3. 先用200 μL移液枪反复吹打胚胎进行匀浆，随后使用带有无菌27 G针头的胰岛素注射器至少吹打15次。
  4. 使用市售的盐酸胍试剂，按照制造商说明书从匀浆后的斑马鱼胚胎中提取总RNA。
  5. 按照制造商说明书，用2 μL浓度为1 U/μL的DNase I  （无RNase）处理每份RNA样品1 μg。
  6. 取1 μg经DNase I处理的RNA，使用市售试剂盒（见材料表）进行逆转录反应（RT），总体积为20 μL，操作按制造商说明书进行。
  7. 进行RT-qPCR反应，总体积为10 μL，包含1× SYBR Green预混液，并使用1.5 μL经1:6稀释的RT反应产物。为标准化目的，使用看家基因rpl8的引物；对于促炎性细胞因子，使用TNF-α 和IL-1β 的引物（见表2）。qPCR程序如下：循环1步骤1：95 °C，2分钟，重复1次；循环2：步骤1 95 °C，10秒，步骤2 55 °C，30秒，重复40次；循环3：步骤1 72 °C，15分钟。

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结果

此处展示的结果和图示涉及通过注射cftr吗啉代寡核苷酸（morpholinos）生成的囊性纤维化（CF）胚胎，具体方法如前文10及步骤5所述。为验证CF表型，参考了先前描述的内脏器官（如心脏、肝脏和胰腺）位置异常的情况17（图1）。在野生型（WT）胚胎中获得的结果与我们先前发表的研究结果一致19。

在感染PAO1的CF胚胎中，噬菌体治疗降低了细菌负荷。此外，我们通过研磨15个胚胎为一组，在8 hpi时评估细菌负荷：PAO1感染胚胎中平均细菌数量（cfu/胚胎）在给予噬菌体治疗后降至约20%，从而证实噬菌体混合物的存在使感染程度显著减轻（图2）。

在感染GFP+细菌PAO1的CF胚胎中，噬菌体疗法降低了死亡率。

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讨论

在本研究中，我们描述了在斑马鱼胚胎中进行P. aeruginosa（PAO1）感染的实验方案，以及如何应用先前鉴定出的可感染PAO1的噬菌体混合物进行噬菌体治疗以清除感染。近年来，由于多重耐药（MDR）细菌感染的广泛传播对公共卫生构成严重威胁，噬菌体作为抗生素治疗的替代手段日益受到关注。当然，本研究的范围仅限于在动物模型中应用噬菌体治疗，而非人类。然而，我们通过注射靶向cftr基因的吗啉代寡核苷酸构建了囊性纤维化斑马鱼模型，证明了噬菌体治疗在该易感P. aeruginosa感染的病理模型中同样具有疗效。

值得注意的是，我们能够轻松实现噬菌体治疗，因为在之前的研究中，我们已分离并鉴定出多种能够在体外和体内感染P. aeruginosa的噬菌体8。这一步骤对于获得噬菌体的抗菌活性至关重要。分离和鉴定能够感染特定细菌菌株的噬菌体是噬菌体治疗应用中的关键步骤。事实上，为了避免噬菌体对动物或人类宿主产生不良影响，必须使用裂解性噬菌体，而非溶原性噬菌体。更重要的是，必须检测噬...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由意大利囊性纤维化基金会（FFC#22/2017；Associazione “Gli amici della Ritty" Casnigo 和 FFC#23/2019；Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细菌琼脂BD214010
氯化钙Sigma-Aldrich10043-52-4
CsClSigma-Aldrich289329
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 PBSSigma-AldrichD8537
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐Sigma-Aldrich886-86-2通用名：三卡因（tricaine）
Femtojet 显微操作仪Eppendorf5247
Fleming/brown P-97Sutter Instrument CompanyP-97
LE-琼脂糖Sigma-Aldrich11685660001
低熔点琼脂糖Sigma-AldrichCAS 9012-36-6
硫酸镁Sigma-Aldrich7487-88-9
甲基蓝Sigma-Aldrich28983-56-4
显微注射针Harvard apparatus
N-苯基硫脲 >=98%Aldrich-P7629103-85-5
寡核苷酸吗啉代Gene Tools由研究人员设计
PEG6000Calbiochem528877
酚红溶液Sigma-AldrichCAS 143-74-B
氯化钾Sigma-Aldrich7447-40-7
蛋白酶 KSigma-Aldrich9036-06-0
氯化钠 ACS 级试剂，≥99.0%Sigma-AldrichS9888
体视显微镜LeicaS9I
Tris HClSigma-AldrichT5941
吐温 X-100Sigma-AldrichT9284
胰蛋白胨OxoidLP0042B
酵母提取物OxoidLP0021B
Z-MOLDS 显微注射模具Word Precision Instruments

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