应用三维单轴机械刺激生物反应器系统诱导肌腱来源干细胞的肌腱向分化

摘要

三维单轴机械刺激生物反应器系统是肌腱来源干细胞向肌腱特异性分化及新生肌腱形成的理想生物反应器。

摘要

肌腱病是一种常见的慢性肌腱疾病，与骨科区域的炎症和退行性变相关。由于发病率高、自我修复能力有限，且最重要的是目前尚无明确有效的治疗方法，肌腱病仍然对患者的生活质量产生负面影响。肌腱来源的干细胞（TDSCs）作为肌腱细胞的主要前体细胞，在肌腱病的发生发展以及肌腱病后功能与结构的修复过程中均发挥着关键作用。因此，建立一种能够在体外模拟TDSCs向肌腱细胞体内分化过程的方法具有重要意义。本文所述方案介绍了一种基于三维（3D）单轴拉伸系统的方法，用于诱导TDSCs分化为类肌腱组织。本方案共包括七个阶段：小鼠TDSCs的分离、小鼠TDSCs的培养与扩增、诱导成膜培养基的配制、在诱导培养基中培养形成细胞膜、3D肌腱干细胞构建体的制备、单轴拉伸力学刺激复合装置的组装，以及对力学刺激下体外生成的类肌腱组织的评估。通过组织学分析验证了该方法的有效性。整个操作过程耗时不到3周。为促进细胞外基质沉积，诱导培养基中使用了4.4 mg/mL的抗坏血酸。该生物反应器采用配备直线电机的独立腔室，可实现精确的力学加载，且具有便携性和易于调节的优点。本方案中的加载程序为：6%应变、0.25 Hz频率，持续8小时，随后休息16小时，连续进行6天。该方案能够模拟肌腱内细胞的分化过程，有助于研究肌腱病的病理机制。此外，所生成的类肌腱组织有望作为工程化自体移植物，用于促进肌腱损伤后的修复。总之，本方案操作简便、经济、可重复且有效。

引言

肌腱病是常见的运动损伤之一，主要表现为患处疼痛、局部肿胀、肌肉张力下降及功能障碍。肌腱病发病率较高，其中中长跑运动员跟腱病的发生率可达29%；排球运动员髌腱病的发生率高达45%，篮球运动员为32%，田径运动员为23%，手球运动员为15%，足球运动员为13%^1,2,3,4,5。然而，由于肌腱自身修复能力有限，且目前缺乏有效的治疗方法，肌腱病仍对患者的生活质量产生负面影响^6,7。此外，肌腱病的发病机制尚不明确。已有大量关于其发病机制的研究，主要包括"炎症学说"、"退变学说"、"过度使用学说"等⁸。目前，许多研究者认为肌腱病是由于肌腱在承受过度机械负荷后产生微损伤，而机体自我修复失败所导致的^9,10。

肌腱来源干细胞（TDSCs）作为....

方案

所述方法均经西澳大利亚大学动物伦理委员会批准，并严格遵循其指南和规定执行。

1. 小鼠TDSCs的分离

1. 通过颈椎脱位法处死6-8周龄的C57BL/6小鼠。
2. 取材髌腱²⁴和跟腱²⁵。
3. 用6 mL I型胶原酶（3 mg/mL）消化一只小鼠的全部肌腱，持续3小时。
   注意：由于小鼠肌腱体积较小，应将一只小鼠所获取的全部肌腱用于此步骤。
4. 收集细胞，并在含10%胎牛血清（FBS）和1%链霉素-青霉素混合液的完全最低必需培养基（Alpha-MEM）中培养7天。
5. 通过流式细胞术结合荧光激活细胞分选鉴定肌腱来源干细胞（TDSCs），检测细胞表面标志物表达情况（包括CD44、CD90和Sca-1阳性；CD34和CD45阴性）。
6. 传代并冻存细胞（后续实验使用第4代细胞）。

2. 小鼠TDSCs的培养与扩增

注意：所有步骤均须在无菌生物安全柜中进行。

1. 取复苏后的细胞（小鼠TDSCs，100万个细胞，第4代，37 °C）。
2. 缓慢加入额外的4-5 mL完全最低必需培养基（Alpha-MEM）。
....

结果

在机械刺激之前，TDSCs 在完全培养基中培养至100%融合，表现出无序的超微结构形态（图 2A）。经过6天的单轴拉伸力学加载后，细胞外基质（ECM）和细胞排列均呈现良好的取向性（图 2B）。力学加载后，细胞在细胞外基质中分布密集且包裹良好。细胞形态呈伸长状，相较于未施加拉伸的细胞，更接近正常的肌腱细胞形态（图 2C）。施加力学加载的细胞构建物中细胞密度高于未加载组。qPCR 结果显示，与静态培养处理组相比，本方法提高了成腱相关标志物的表达水平，包括 Scleraxis、Mohawk、Tenomodulin 和 COL1A1（图 3）。

讨论

肌腱是一种对机械刺激敏感的纤维结缔组织。根据以往研究，过大的机械负荷可导致肌腱干细胞向成骨方向分化，而机械负荷不足则会导致肌腱分化过程中胶原纤维结构紊乱²¹。

普遍认为，理想生物反应器的关键在于能够模拟体内细胞所经历的体外细胞微环境。因此，在体外模拟体内正常的应力环境，是刺激肌腱来源干细胞（TDSCs）向肌腱细胞单向分化的核心。在本实验方案中，TDSC构建物的宽度为2 cm，钩子的移动范围为0.12 cm，即应变为0.12/2 (%)。综上所述，在本方案中，TDSCs在生物反应器中接受了为期6天的机械刺激（6%，0.25 Hz，每次8小时，随后休息16小时）。经评估，本方案所采用的机械加载参数已被证实可诱导TDSCs生成类肌腱组织。需要注意的是，生物反应器的参数应与相应类型的拉伸系统精确匹配。例如，单层细胞拉伸的适宜参数与当前的三维细胞片层拉伸参数不同^26,27。可能的原因在于受力模式的不同

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗坏血酸	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
胎牛血清（FBS）	Gibcoä by Life Technologies	1908361
组织处理仪	Leica	TP 1020
最低必需培养基（Alpha-MEM）	Gibcoä by Life Technologies	2003802
小鼠肌腱来源干细胞			从小鼠跟腱中分离，小鼠为6至8周龄的C57BL/6品系。用I型胶原酶（3 mg/ml；MilliporeSigma，Burlington，MA，美国）消化3小时，然后通过70 mm细胞筛网过滤，获得单细胞悬液。
多聚甲醛	Sigma-aldrich	441244
链霉素和青霉素混合液	Gibcoä by Life Technologies	15140122
三维单轴机械刺激生物反应器系统	西澳大利亚大学医学院骨科转化研究中心		可向通讯作者申请获取。或根据我们的设计自行制备* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
胰蛋白酶	Gibcoä by Life Technologies	1858331