应用三维单轴机械刺激生物反应器系统诱导肌腱来源干细胞的肌腱向分化

摘要

三维单轴机械刺激生物反应器系统是肌腱来源干细胞向肌腱特异性分化及新生肌腱形成的理想生物反应器。

摘要

肌腱病是一种常见的慢性肌腱疾病，与骨科区域的炎症和退行性变相关。由于发病率高、自我修复能力有限，且最重要的是目前尚无明确有效的治疗方法，肌腱病仍然对患者的生活质量产生负面影响。肌腱来源的干细胞（TDSCs）作为肌腱细胞的主要前体细胞，在肌腱病的发生发展以及肌腱病后功能与结构的修复过程中均发挥着关键作用。因此，建立一种能够在体外模拟TDSCs向肌腱细胞体内分化过程的方法具有重要意义。本文所述方案介绍了一种基于三维（3D）单轴拉伸系统的方法，用于诱导TDSCs分化为类肌腱组织。本方案共包括七个阶段：小鼠TDSCs的分离、小鼠TDSCs的培养与扩增、诱导成膜培养基的配制、在诱导培养基中培养形成细胞膜、3D肌腱干细胞构建体的制备、单轴拉伸力学刺激复合装置的组装，以及对力学刺激下体外生成的类肌腱组织的评估。通过组织学分析验证了该方法的有效性。整个操作过程耗时不到3周。为促进细胞外基质沉积，诱导培养基中使用了4.4 mg/mL的抗坏血酸。该生物反应器采用配备直线电机的独立腔室，可实现精确的力学加载，且具有便携性和易于调节的优点。本方案中的加载程序为：6%应变、0.25 Hz频率，持续8小时，随后休息16小时，连续进行6天。该方案能够模拟肌腱内细胞的分化过程，有助于研究肌腱病的病理机制。此外，所生成的类肌腱组织有望作为工程化自体移植物，用于促进肌腱损伤后的修复。总之，本方案操作简便、经济、可重复且有效。

引言

肌腱病是常见的运动损伤之一，主要表现为患处疼痛、局部肿胀、肌肉张力下降及功能障碍。肌腱病发病率较高，其中中长跑运动员跟腱病的发生率可达29%；排球运动员髌腱病的发生率高达45%，篮球运动员为32%，田径运动员为23%，手球运动员为15%，足球运动员为13%^1,2,3,4,5。然而，由于肌腱自身修复能力有限，且目前缺乏有效的治疗方法，肌腱病仍对患者的生活质量产生负面影响^6,7。此外，肌腱病的发病机制尚不明确。已有大量关于其发病机制的研究，主要包括"炎症学说"、"退变学说"、"过度使用学说"等⁸。目前，许多研究者认为肌腱病是由于肌腱在承受过度机械负荷后产生微损伤，而机体自我修复失败所导致的^9,10。

肌腱来源干细胞（TDSCs）作为肌腱细胞的主要前体细胞，在肌腱病的发生发展以及肌腱病后功能与结构的修复过程中均发挥着关键作用^11,12,13。已有研究报道，机械应力刺激可引起成骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、间充质干细胞及其他力敏感细胞的增殖与分化^{14,15,16,17,18}。因此，TDSCs 作为一类具有机械敏感性和多向分化潜能的细胞，同样可通过机械负荷刺激诱导其分化^19,20。

然而，不同的力学加载参数（加载强度、加载频率、加载类型和加载周期）可诱导肌腱来源干细胞（TDSCs）分化为不同类型的细胞²¹。因此，一种有效且可靠的力学加载方案对于肌腱生成至关重要。此外，目前已有多种类型的生物反应器作为刺激系统，用于向TDSCs施加力学刺激。每种生物反应器的工作原理各不相同，因此对应于不同生物反应器的力学加载参数也存在差异。因此，亟需建立一种简单、经济且可重复的刺激方案，包括生物反应器的类型、相应的刺激培养基以及力学加载方案。

本文介绍了一种基于三维（3D）单轴拉伸系统的方法，用于刺激肌腱来源干细胞（TDSCs）向类肌腱组织分化。该实验方案包含七个步骤：小鼠TDSCs的分离、小鼠TDSCs的培养与扩增、用于细胞片形成的功能刺激培养基的制备、在刺激培养基中培养形成细胞片、三维肌腱干细胞结构的制备、单轴拉伸力学刺激复合体的组装，以及对体外力学刺激下生成的类肌腱组织的评估。整个过程获得三维细胞结构所需时间少于3周，显著短于某些现有方法^22,23。本方案已被证实可有效诱导TDSCs向肌腱组织分化，且比目前常用的二维（2D）拉伸系统更可靠²¹。其有效性已通过组织学分析得到验证。总之，本实验方案具有操作简便、经济、可重复且有效等优点。

方案

所述方法均经西澳大利亚大学动物伦理委员会批准，并严格遵循其指南和规定执行。

1. 小鼠TDSCs的分离

1. 通过颈椎脱位法处死6-8周龄的C57BL/6小鼠。
2. 取材髌腱²⁴和跟腱²⁵。
3. 用6 mL I型胶原酶（3 mg/mL）消化一只小鼠的全部肌腱，持续3小时。
   注意：由于小鼠肌腱体积较小，应将一只小鼠所获取的全部肌腱用于此步骤。
4. 收集细胞，并在含10%胎牛血清（FBS）和1%链霉素-青霉素混合液的完全最低必需培养基（Alpha-MEM）中培养7天。
5. 通过流式细胞术结合荧光激活细胞分选鉴定肌腱来源干细胞（TDSCs），检测细胞表面标志物表达情况（包括CD44、CD90和Sca-1阳性；CD34和CD45阴性）。
6. 传代并冻存细胞（后续实验使用第4代细胞）。

2. 小鼠TDSCs的培养与扩增

注意：所有步骤均须在无菌生物安全柜中进行。

1. 取复苏后的细胞（小鼠TDSCs，100万个细胞，第4代，37 °C）。
2. 缓慢加入额外的4-5 mL完全最低必需培养基（Alpha-MEM）。
3. 用移液器将混合液转移至15 mL离心管中。
4. 用移液器补加培养基至总体积为8 mL。
   1. 将培养基在37 °C培养箱中预热。
5. 将离心管放入离心机并平衡。
6. 在347 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉淀。
7. 离心后取出，检查管底的细胞沉淀。
8. 弃去冻存液，用1-2 mL完全培养基轻柔重悬细胞（避免产生过多气泡）。
9. 用移液器将重悬的细胞转移至T-75培养瓶中。
10. 用移液器向培养瓶中加入完全Alpha-MEM培养基，使总体积达到10 mL，最终细胞密度为13,000个细胞/cm²。
11. 将培养瓶放入培养箱，在37 °C、5% CO₂条件下进行培养。
12. 每3天更换一次培养基。
13. 换液时在显微镜下观察并监测细胞，直至细胞培养至100%汇合度（约40,000个细胞/cm²）。

3. 细胞片形成用刺激培养基的制备

注意：所有步骤均须在无菌生物安全柜中进行。

1. 将15 mL完全培养基Alpha-MEM加入无菌15 mL离心管中。
2. 在15 mL培养基中加入6 µL抗坏血酸（11 mg/mL），终浓度为4.4 µg/mL。
   注意：在诱导培养基中额外添加25 ng/mL的结缔组织生长因子可加速整个生长与分化过程。
3. 通过轻轻上下颠倒混匀。

4. 在刺激培养基中培养形成细胞片层

注意：所有步骤均须在无菌生物安全柜中进行。

1. 小心弃去常规的完全α-MEM培养基，避免触碰贴壁于培养瓶底部的细胞。
2. 缓慢加入10 mL诱导培养基，避免对已完全融合的细胞造成扰动。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下，用诱导培养基继续培养细胞9天（每3天更换一次培养基），以充分形成细胞片层。
   注意：经抗坏血酸刺激后，从培养瓶底部观察可见细胞外基质变厚并呈现浑浊状，表明细胞片层已充分形成。

5. 三维肌腱干细胞构建物的制备

注意：所有步骤均须在无菌生物安全柜中进行。

1. 从培养箱中取出培养瓶。
2. 完全弃去刺激培养基。
3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻旋转冲洗单层细胞片。
4. 完全弃去 PBS。
5. 使用移液器向培养瓶的一角加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶。
6. 轻敲培养瓶角落，使单层细胞片脱离，直至细胞片边缘脱离瓶底。
7. 立即加入 9 mL 完全 Alpha-MEM 培养基以终止消化作用。
8. 继续轻轻旋转培养瓶，使单层细胞片完全脱落。
9. 将完全脱落的细胞片连同培养基倒入培养皿中。
10. 使用无菌镊子夹住细胞片的一角，顺时针方向旋转 15 次。
11. 夹住细胞片另一端，逆时针方向旋转 10 次，以牢固形成类似肌腱的体外构建物（图 1A）。

6. 在独特设计的生物反应器中组装单轴拉伸力学刺激复合体

注意：所有步骤均须在无菌生物安全柜中进行。

1. 使用连接器将挂钩连接，并调节至两个挂钩之间的所需距离（2 cm）。
2. 将3D TDSCs构建物在组装好的挂钩上轻轻缠绕，每个挂钩缠绕3圈（图1B）。
3. 通过拧紧两端的螺丝，将带有细胞构建物的挂钩固定在生物反应器的腔室上。
   注意：整个腔室（包括螺丝和挂钩）均为无菌（使用前经134 °C高压灭菌1.5小时，并用紫外线（UV）照射24小时）。对于金属腔室支架，使用前需用紫外线照射48小时。
4. 用完全Alpha-MEM培养基充满腔室。
5. 通过电缆将致动器连接到培养腔室。
6. 用无菌剪刀剪断挂钩之间的连接器。
7. 打开电源及相应通道控制器，开始机械刺激。
8. 将腔室盖盖上。
9. 检查指示灯，确保生物反应器能够正常运行。
10. 将生物反应器放入培养箱中，对3D细胞构建物进行6天的机械拉伸刺激（6%拉伸，0.25 Hz，8小时拉伸，随后16小时休息）。

7. 体外类肌腱组织的力学刺激评估

1. 用螺丝刀松开螺丝，并小心取下组件。
2. 将类肌腱组织放入4%多聚甲醛中固定15分钟。
3. 将固定的类肌腱组织放入带有活检泡沫垫的活检盒中。
4. 进行样品脱水处理，最终通过H&E组织学染色进行评估。
5. 重复整个实验流程，并从类肌腱组织中提取RNA，通过定量PCR（qPCR）检测腱系标志物的表达。所选基因的引物列于表1。
   注意：组织学实验流程和qPCR实验流程为标准操作，参照先前的研究²¹。

结果

在机械刺激之前，TDSCs 在完全培养基中培养至100%融合，表现出无序的超微结构形态（图 2A）。经过6天的单轴拉伸机械负荷后，细胞外基质（ECM）和细胞排列均呈现出良好的取向性（图 2B）。机械负荷后，细胞在ECM中分布密集且被充分包埋。细胞形态呈伸长状，相较于未拉伸组更接近正常的肌腱细胞形态（图 2C）。施加负荷的细胞构建物中细胞密度高于未施加负荷的组别。qPCR结果表明，与静态培养处理组相比，本方法提高了成腱标志物Scleraxis、Mohawk、Tenomodulin和COL1A1的表达水平（图 3）。

讨论

肌腱是一种对机械刺激敏感的纤维结缔组织。根据以往研究，过大的机械负荷可导致肌腱干细胞向成骨方向分化，而机械负荷不足则会导致肌腱分化过程中胶原纤维结构紊乱²¹。

普遍认为，理想生物反应器的关键在于能够模拟体内细胞所经历的体外细胞微环境。因此，在体外模拟体内正常的应力环境，是刺激肌腱来源干细胞（TDSCs）向肌腱细胞单向分化的核心。在本实验方案中，TDSC构建物的宽度为2 cm，钩子的移动范围为0.12 cm，即应变为0.12/2 (%)。综上所述，在本方案中，TDSCs在生物反应器中接受了为期6天的机械刺激（6%，0.25 Hz，每次8小时，随后休息16小时）。经评估，本方案所采用的机械加载参数已被证实可诱导TDSCs生成类肌腱组织。需要注意的是，生物反应器的参数应与相应类型的拉伸系统精确匹配。例如，单层细胞拉伸的适宜参数与当前的三维细胞片层拉伸参数不同^26,27。可能的原因在于受力模式的不同

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗坏血酸	Sigma-aldrich	PHR1008-2G
胎牛血清（FBS）	Gibcoä by Life Technologies	1908361
组织处理仪	Leica	TP 1020
最低必需培养基（Alpha-MEM）	Gibcoä by Life Technologies	2003802
小鼠肌腱来源干细胞			从小鼠跟腱中分离，小鼠为6至8周龄的C57BL/6品系。用I型胶原酶（3 mg/ml；MilliporeSigma，Burlington，MA，美国）消化3小时，然后通过70 mm细胞筛网过滤，获得单细胞悬液。
多聚甲醛	Sigma-aldrich	441244
链霉素和青霉素混合液	Gibcoä by Life Technologies	15140122
三维单轴机械刺激生物反应器系统	西澳大利亚大学医学院骨科转化研究中心		可向通讯作者申请获取。或根据我们的设计自行制备* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
胰蛋白酶	Gibcoä by Life Technologies	1858331