从胚胎颈上神经节培养大鼠交感神经元用于形态学与蛋白质组学分析

摘要

本文描述了从大鼠颈上神经节中分离和培养胚胎期交感神经元的方法。同时提供了用于免疫细胞化学染色以及制备神经元提取物以进行质谱分析的详细实验方案。

摘要

已采用大鼠胚胎颈上神经节（SCG）的交感神经元作为体外模型系统，用于研究外周神经元的轴突生长、轴突运输、突触形成、树突生长、树突可塑性以及在共培养系统中神经元与靶组织的相互作用。本方案描述了从E21大鼠胚胎颈上神经节中分离并解离神经元的操作步骤，继而进行无血清培养基中纯神经元培养物的制备与维持。由于神经元无法黏附于未包被的塑料表面，因此需将神经元培养于经多聚-D-赖氨酸包被的12 mm玻璃盖玻片或6孔板中。在使用抗有丝分裂试剂（Ara-C，胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷）处理后，本方案可获得健康神经元培养物，其中非神经元细胞比例低于5%，且可在体外维持超过一个月。尽管在体内大鼠胚胎SCG神经元呈多极形态，具有5–8个树突；但在无血清培养条件下，这些神经元在体外仅延伸出单根轴突，并在整个培养期间保持单极形态。然而，在存在基底膜提取物、骨形态发生蛋白（BMPs）或10%胎牛血清的情况下，这些神经元可被诱导出树突。此类均一的神经元培养物可用于免疫细胞化学染色及生物化学研究。本文还介绍了针对这些神经元中微管相关蛋白-2（MAP-2）的免疫细胞化学染色优化方案，以及用于质谱分析的神经元提取物制备方法。

引言

源自胚胎颈上神经节（SCG）的交感神经元已被广泛用作一种原代神经元培养系统，用于研究神经元发育的多个方面，包括神经营养因子依赖性、神经元-靶细胞相互作用、神经递质信号传导、轴突生长、树突发育与可塑性、突触形成以及介导神经-靶细胞/神经元-胶质细胞相互作用的信号机制^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。尽管其体积较小（每个神经节约含10000个神经元），但该培养系统得以建立并被广泛使用主要有三个原因：i）作为交感链中第一个神经节，其体积相对较大，因而比其他交感神经节更容易分离¹⁰；ii）与中枢神经元不同，SCG神经元具有较高的同质性，所有神经元均起源于神经嵴，具有相似的细胞大小、对神经生长因子的依赖性，并属于去甲肾上腺素能神经元，这使其成为形态学和基因组学研究的宝贵模型

方案

所有涉及动物的研究操作均经加州圣玛丽学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。圣玛丽学院的动物照护与使用指南基于美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室提供的指导文件制定（https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf 和 https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf）。

1. 培养基（也称为对照培养基）的制备

1. 按以下顺序将下列成分加入一个无菌的 500 mL 锥形瓶中：190 mL 1x 低糖 DMEM，10 mL 含 FAF-BSA（无脂肪酸牛血清白蛋白，20 mg/mL）的 DMEM，2.8 mL 200 mM L-谷氨酰胺，4 mL 100x 胰岛素-硒-转铁蛋白混合液，0.4 mL 含神经生长因子（125 µg/mL，溶于含 0.2% 惰性蛋白稳定剂的 DMEM 中），以及 200 mL Ham’s F-12 培养基。
2. 在添加含蛋白质的溶液（如胰岛素-硒-转铁蛋白混合液和 NGF）之前，务必先用含有 FAF-BSA 的培养基润洗移液管，以防止蛋白质粘附在移液管壁上。
3. 每次加入成分后轻轻摇动锥形瓶以混匀；在加入 F-12 培养基后，使用 25 mL 移液管充分吹打混匀。
....

结果

分离和培养胚胎 SCG 神经元的神经元细胞
将大鼠胚胎 SCG 的离体细胞接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养皿或盖玻片上，并在含有 β-神经生长因子的无血清培养基中进行培养。接种后，含有神经元和胶质细胞混合物的离体细胞呈圆形（图 1A）。接种后 24 小时内，神经元开始延伸出细小的轴突，胶质细胞则变扁平，在相差显微镜下呈现相位较暗的形态（图 1B）。经阿糖胞苷（Ara-C）处理后，99% 的胶质细胞被清除，培养物中主要为神经元细胞，其具有椭圆形的胞体、广泛的轴突生长，且无树突结构（图 1C）。

培养的大鼠胚胎颈上神经节神经元的免疫细胞化学染色
既往研究表明，体外培养的交感神经元在无血清培养基中仅能延伸轴突，只有在基底膜提取物、10% 血清或 50 ng/mL 骨形态发生蛋白-7（BMP-7）存在时，才会形成复杂的树突分支结构.......

讨论

本文描述了从胚胎大鼠颈上神经节分离培养交感神经元的实验方案。采用该模型系统的优势在于可以获得一群同质的神经元，其对生长因子的反应具有一致性；并且由于这些神经元对生长因子的需求已被充分表征，因此可以在体外无血清的确定性培养基中培养这些神经元¹⁰。尽管本方案描述的是从E21大鼠胚胎中分离SCG的过程，但该方案同样适用于E17至E21阶段大鼠胚胎以及胚胎期小鼠SCG的解剖分离^10,22,23。该解剖方案经过对初始步骤的微小修改后，也可用于出生后大鼠SCG的分离。这些修改包括无需剖宫产操作、使用二氧化碳对出生后动物实施安乐死，以及在转移至解剖培养基前，将安乐死后的大鼠幼崽浸入70%酒精中进行表面消毒¹⁰。该神经元培养方案还可结合Campenot培养室或微流控培养室，用于研究轴突导向、轴突运输及突触形成过程^24.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2D nanoACQUITY	Waters Corporation
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	9830
BMP-7	R&D Systems	354-BP
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	5470
细胞刮刀	Corning	CLS-3010
胶原酶	Worthington Biochemical	4176
Corning Costar 或 Nunc 平底细胞培养板	Fisher Scientific	07-2200, 140675, 142475
胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷	Sigma-Aldrich	C1768
D-磷酸盐缓冲液（无钙、无镁）	ATCC	30-2200
Dispase II	Roche	4942078001
蒸馏水	Thermo Fisher Scientific	15230
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D0632
DMEM - 低糖 + 谷氨酰胺 + 丙酮酸钠	Thermo Fisher Scientific	11885
脂肪酸游离型 BSA	Calbiochem	126609	以低糖 DMEM 配制 20 mg/mL 储存液
精细镊子 Dumont no.4 和 no.5	Ted Pella Inc	5621, 5622
解剖用镊子和剪刀	Ted Pella Inc	1328, 1329, 5002
玻璃盖玻片 - 12 mm	Neuvitro Corporation	GG-12
山羊抗小鼠 IgG Alexa 488 标记抗体	Thermo Fisher Scientific	A32723
Ham's F-12 营养混合物	Thermo Fisher Scientific	11765
Hank's 平衡盐溶液（无钙、无镁）	Thermo Fisher Scientific	14185
胰岛素-硒-转铁蛋白（100X）	Thermo Fisher Scientific	41400-045
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	A3221
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030
Leibovitz L-15 培养基	Thermo Fisher Scientific	11415064
用于玻璃盖玻片的封片介质	Thermo Fisher Scientific	P36931, P36934
小鼠抗 MAP2 抗体（SMI-52）	BioLegend	SMI 52
神经生长因子	Envigo Bioproducts（原 Harlan Bioproducts）	BT5017	以含 0.2% Prionex 的 DMEM 配制 125 μg/mL 储存液
多聚甲醛	Spectrum Chemicals	P1010
青霉素-链霉素（100X）	Thermo Fisher Scientific	15140
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P0899
Prionex	Millipore	529600	10% 溶液，100 mL
RapiGest SF	Waters Corporation	186001861	5 × 1 mg
Synapt G2 高分辨质谱仪	Waters Corporation
三氟乙酸 - 测序级	Thermo Fisher Scientific	28904	10 × 1 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
胰蛋白酶	Promega 或 NEB	V511A, P8101S	100 μg 或 5 × 20 mg
Waters 全回收小瓶	Waters Corporation	186000385c