利用益生菌无细胞上清液在结直肠癌细胞三维球体培养中评估细胞死亡

摘要

本文介绍了研究抗癌作用的方法 Lactobacillus 无细胞上清液（LCFS）。在三维培养条件下，结直肠癌细胞系经LCFS处理后出现细胞死亡。类球体的生成过程可根据支架材料进行优化，所采用的分析方法有助于评估相关信号通路的激活情况。

摘要

本论文描述了一种利用多细胞类型癌细胞的三维（3D）球状体及其上清液评估癌细胞死亡的实验方案 Lactobacillus fermentum 细胞培养, 被视为益生菌培养物。使用三维培养来测试 乳酸杆菌 无细胞上清液（LCFS）是比二维单层培养检测更优的选择，尤其是当 L. fermentum 可在肠道内产生抗癌作用。 L. fermentum 上清液被证实对多种结直肠癌（CRC）细胞在三维培养条件下具有增强的抗增殖作用。有趣的是，这些效应与培养模型密切相关，显示出该模型显著的能力 L. fermentum 诱导癌细胞死亡。采用下述方案，从多种结直肠癌细胞（CRCs）成功生成了稳定的球状体。该三维球状体构建方案具有节省时间与成本的优势。本系统旨在便于研究LCFS对多种类型CRC球状体的抗肿瘤作用。正如预期，经LCFS处理的CRC球状体在实验过程中显著诱导了细胞死亡，并通过qRT-PCR、蛋白质印迹（western blotting）和FACS分析检测到特定的凋亡分子标志物表达。因此，该方法在探索细胞活力及评估抗癌药物疗效方面具有重要价值。

引言

益生菌是肠道中有益的微生物，可改善免疫稳态和宿主能量代谢¹。其中，来源于乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的益生菌是肠道中最常见且研究最深入的种类^2,3。先前的研究表明，乳杆菌属（Lactobacillus）对多种癌症（包括结直肠癌）具有抑制和抗增殖作用⁴。此外，益生菌还能预防炎症性肠病、克罗恩病以及溃疡性结肠炎^5,6。然而，大多数益生菌相关研究是在固体表面培养的二维（2D）单层细胞模型中进行的。

人工培养系统缺乏癌症细胞所处的自然环境特征。为克服这一局限，已开发出三维（3D）培养系统^7,8。在三维培养中，癌细胞在多种基本生物学机制方面表现出改善，例如细胞活力、增殖能力、形态学特征、细胞间通讯、药物敏感性以及与体内环境的相关性^9,10。此外，结直肠癌的多细胞类型可形成类球体结构，其形成依赖于细胞间的相互作用以及细胞外基质（ECM）¹¹。我们先前的研究报道，利用Lactobacillus fermentum产生的益生菌无细胞上清液（CFS）对结直肠癌（CRC）细胞的三维培养模型具有抗肿瘤作用¹²。我们提出，CFS是一种适用于在三维类球体模型中检测益生菌效应的替代策略¹²。

本文介绍了一种可容纳多种细胞类型的三维结直肠癌模型的方法，用于分析益生菌无细胞上清液（CFS）对多种三维结直肠癌模拟系统治疗效果的影响。该方法为体外研究相关益生菌及其抗肿瘤效应提供了可行手段。

方案

1. 细菌培养及Lactobacillus 无细胞上清液（LCFS）的制备

注意：步骤 1.2 – 1.9 需在厌氧环境中进行。

1. 制备含 L-半胱氨酸的 MRS 琼脂平板和肉汤，并通过高压灭菌器灭菌。
2. 将MRS琼脂平板预孵育于H₂ 37 ˚C、20 ppm 氧气条件下维持的厌氧培养箱
3. 解冻 Lactobacillus 细菌菌种并用细菌培养物接种琼脂平板（图1A (i)).
4. 在 H 中将细菌孵育 2 - 3 天₂ 在37 ˚C、20 ppm氧气的厌氧培养箱中培养，直至获得单菌落。
5. 清洗并干燥 Hungate 型厌氧培养管。将培养管在 121 ˚C 下高压灭菌 15 分钟。
6. 然后将试管置于 H₂ 在37 ˚C、20 ppm氧气的厌氧培养箱中去除氧气。
7. 将2 - 3 mL MRS肉汤加入试管中。用丁基橡胶塞密封试管，并拧紧盖子。
8. 用接种环挑取单个菌落，放入含有500 µL 1x PBS的1.5 mL离心管中。图1A (ii)).
9. 使用1 mL注射器悬浮菌落（图1A (iii)）。操作方法为：将1 mL注射器的针头插入试管盖中心，吸取悬浮菌落，然后将其重新悬浮于MRS肉汤培养基中。图1A （iv）).
10. 在摇床培养箱中孵育MRS肉汤培养基2天（37 °C，5% CO₂）₂，200 转/分钟）。
11. 使用分光光度计测量光密度（OD）以监测细菌生长曲线，直至 OD 处的吸光度达到目标值₆₂₀ 达到 2.0。
12. 通过在 1,000 x g 条件下离心，分离细菌沉淀和条件培养基。 g 孵育15分钟。用1×PBS洗涤收集的细菌沉淀，并重悬于4 mL添加了10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。培养基中不要加入任何抗生素。
13. 将细菌沉淀物维持在RPMI中，并在37 °C、5% CO₂条件下于摇床培养箱中孵育4小时₂ 以100 rpm的速度。
14. 用于制备益生菌上清液时，以1000 × g离心去除细菌沉淀 x g，4 °C 下孵育 15 分钟。使用 0.22 μm 滤器对收集的上清液进行无菌过滤，保存于 −80 °C，直至使用。

2. 类球体的生成

1. 准备结直肠癌细胞系
   1. 将 DLD-1、HT-29 和 WiDr 细胞系以单层培养至 70–80% 汇合度，并在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育（培养基：含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI 培养基）。
   2. 对于在 100 mm 培养皿中培养的细胞，用 4 mL 1× PBS 洗涤两次。加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 2 分钟，以解离细胞。
   3. 孵育后，在显微镜下观察细胞解离情况，并加入 5 mL 培养基中和胰蛋白酶-EDTA。
   4. 将解离后的细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中，以 300 x g 离心 3 分钟。
   5. 弃去上清液，用 3 mL 培养基轻柔重悬细胞。
   6. 使用台盼蓝染色并通过血细胞计数板计数细胞，以确定活细胞数量。（图 1B (i)）
2. 类球体形成
   1. 在 15 mL 圆锥形离心管中，将步骤 2.1.5 中的细胞稀释至 1–2 × 10⁵ 个细胞/mL（图 1B (ii)）
   2. 向细胞悬液中加入终浓度为 0.6% 的甲基纤维素，并将稀释后的细胞转移至无菌储液槽中。
      注意：每种细胞系所需的甲基纤维素用量应通过滴定确定。
   3. 使用多通道移液器将 200 µL 细胞悬液加入超低吸附 96 孔圆底微孔板的每个孔中。（图 1B (iii)）
   4. 将微孔板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 24–36 小时。
   5. 孵育 24–36 小时后，在光学显微镜下观察微孔板，确认类球体的形成。

3. 使用 LCFS 处理三维结直肠癌细胞

1. 按照步骤 2 和 3 所述方法生成球状体。
2. 在进行 LCFS 处理前，将冷冻的 LCFS 在室温（RT）下解冻 10 - 20 分钟。
3. 将 LCFS 储备液接种至生长培养基中，并在生长培养基中连续稀释至 25%、12.5% 和 6%（例如，25% LCFS = 150 µL 生长培养基 + 50 µL LCFS）。
4. 从培养箱中取出含有球状体的细胞培养板，使用 200 μL 移液器尽可能吸除每个孔中的生长培养基。
5. 向细胞中加入含 LCFS 的生长培养基，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 24 - 48 小时。
   注意：所用体积取决于培养板规格，具体如下：6 孔板每孔 2 mL；96 孔板每孔 200 μL。

4. 类球体的细胞活力

1. 在不透光多孔板中准备8至10个经LCFS处理的结直肠癌类球体（细胞活力检测在LCFS处理后48小时进行）。
2. 将细胞活力检测试剂（见材料表）在4 °C条件下过夜解冻。
3. 使用前将细胞活力检测试剂平衡至室温。
4. 进行检测前，移除类球体中50%的培养基。
5. 向每孔加入100 µL细胞活力检测试剂。
   注意：试剂使用体积取决于板的规格，96孔细胞培养板每孔加100 μL。
6. 剧烈震荡混合5分钟，以促进细胞裂解。
7. 在37 °C下孵育30分钟至2小时。
8. 记录发光信号。

5. 类球体的定量实时聚合酶链式反应分析

1. 每种条件下，在2 mL离心管中准备10 - 15个类球体，并在400 × g 条件下离心3分钟。
2. 弃去上清液，并用1 mL预冷的1× PBS将类球体洗涤两次。
   注意：避免离心，让类球体自然沉降。
3. 尽可能吸除1× PBS，并使用市售试剂盒提取RNA。
4. 根据制造商说明书，使用市售试剂盒从1 μg RNA中合成cDNA。
5. 配制主混合液，以便对所有样本进行三复孔检测（见表1和表2）。
6. 将20 µL模板主混合液加入每个qPCR板孔中进行扩增反应。
7. 充分混匀反应体系，必要时进行短暂离心。
8. 按照仪器制造商的建议运行样本（表3）。

6. 从球状体进行蛋白质印迹分析

注意：收集球状体时，使用 200 μL 移液器，并剪去吸头末端，以避免破坏其结构。

1. 每种条件下，在 2 mL 离心管中准备 30 - 40 个球状体。
2. 将离心管置于冰上，让球状体沉降至 2 mL 离心管底部。
3. 弃去上清液，并用 1 mL 冰冷的 1× PBS 洗涤球状体两次。
   注意：避免离心，让球状体自然沉降。
4. 尽可能吸除 1× PBS，加入含有蛋白酶抑制剂混合物的 RIPA 裂解缓冲液（10 个球状体 = 30 µL RIPA 缓冲液）。
5. 通过移液吹打使细胞裂解，并进行超声处理，每次超声 30 秒，冰上静置 30 秒，共重复 10 个循环。
6. 在 4 °C 条件下，以 15000 x g 离心 15 分钟，收集蛋白裂解液。
7. 测定每种细胞裂解液的蛋白浓度。
8. 上样前，将每种细胞裂解液在样品缓冲液中于 100 °C 煮沸 10 分钟。
9. 将等量蛋白上样至 SDS-PAGE 凝胶的加样孔中，在 100 V 条件下电泳 1 - 2 小时。
10. 将凝胶中的蛋白转移至 PVDF 膜上。
11. 转膜后，使用封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉 + 含 0.05% Tween-20 的 TBS）在室温下封闭膜 1 小时。
12. 将膜在含 5% BSA 的 1× TBST 缓冲液中，于 4 °C 过夜孵育一抗（稀释比例为 1:1,000）（见表 4）。
13. 用 TBST 洗涤膜三次，每次 15 分钟。
14. 将膜在封闭缓冲液中，室温孵育二抗（稀释比例为 1:2,500）2 小时（参见材料表）。
15. 用 TBST 洗涤膜三次，每次 15 分钟。
16. 使用化学发光底物对膜进行 HRP 检测前处理。
17. 采集化学发光图像。

7. 类球体的碘化丙啶（PI）染色

1. 按照步骤4.1所述制备5-10个球状体，并将球状体置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。
2. 用1×PBS将1 mg/mL的PI储备液稀释1:100。
3. 从96孔板的每孔中移除50%的培养基。
4. 向每孔中加入100 µL PI溶液，并将孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育10–15分钟。
5. 用1×PBS洗去PI溶液。
6. 每孔加入200 µL生长培养基，使用荧光显微镜拍摄图像。使用Image J分析荧光强度，以获得球状体的存活率计数。

8. 类球体的流式细胞术分析

1. 按照先前所述方法生成球状体。
2. 针对每种条件，在 FACS 管中准备 30 - 40 个球状体，并在室温下以 400 × g 离心 3 分钟。
3. 吸除上清液，用 3 mL 的 1× PBS 清洗球状体，然后在 4 °C 下以 400 x g 离心 3 分钟。
4. 吸除上清液，加入 200 µL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，室温孵育 2 - 3 分钟。
   注意：孵育时间取决于球状体大小和细胞类型。
5. 加入 1 mL FACS 缓冲液，使用 200 μL 移液器轻轻吹打使球状体解离。
6. 将解离后的细胞在 4 °C 下以 400 x g 离心 3 分钟。
   注意：FACS 缓冲液 = 1× PBS + 2.5% FBS，使用 0.22 µm 滤器过滤。
7. 弃去上清液，加入 7-AAD/Annexin V 试剂（每样本加入 7AAD (5 µL) 和 Annexin V (5 µL)）。
8. 轻轻涡旋混匀细胞，并在室温避光条件下孵育 13 - 30 分钟。
9. 向每管中加入 500 µL FACS 缓冲液，并使用锥形聚苯乙烯试管过滤细胞，以去除细胞聚集体。
10. 在 4 °C 下以 400 x g 离心 3 分钟。
11. 向每管中加入 500 µL Annexin V 结合缓冲液并重悬细胞。
12. 使用流式细胞仪进行分析。

结果

我们描述了从多种结直肠癌细胞系获得球状体的实验方案。生成球状体需要添加甲基纤维素。我们还介绍了一种LCFS的制备方法，并提出了一种用于研究益生菌与结直肠癌之间相关性的模型。球状体形成和LCFS制备的方案在图1A、B中以示意图形式展示。如图2A所示，0.6%的甲基纤维素浓度可使癌细胞转变为致密的球状体。该结果表明，利用我们的甲基纤维素方案，可以从多种类型的结直肠癌细胞中生成球状体。接下来，将球状体用25% LCFS处理，并在48小时后通过光学显微镜观察其形态。如图3A所示，经LCFS处理组的球状体表面出现破坏。为了在合适浓度下研究LCFS的抗肿瘤作用，将球状体分别用不同剂量的LCFS处理48小时：0（对照）、6%、12.5%和25%。在用25% LCFS处理的球状体中观察到形态结构的破坏，如图3B所示。此外，球状体分别用25% LCFS处理24小时和48小时，结果显示在...

讨论

组织微环境，包括邻近细胞和细胞外基质（ECM），对组织生成至关重要，并在调控细胞生长和组织发育中起关键作用¹³。然而，二维培养存在多种缺点，例如细胞间相互作用的破坏，以及细胞形态、细胞外环境和分裂方式的改变¹⁴。三维细胞培养系统已被广泛研究，以更真实地模拟体内效应，并已被证实是体外肿瘤药物测试中更为精确的系统^15,16。目前亟需建立能够更准确预测个体对化疗药物反应的模型系统¹⁷。

为组织工程开发了三维支架，其可作为细胞外基质（ECM）缺失的替代物，代表肿瘤细胞可用的空间。此外，该支架为细胞黏附和增殖提供物理相互作用，并促使细胞形成适当的空间分布以及细胞-ECM或细胞-细胞间的相互作用¹⁸。甲基纤维素（MC）聚合物已被持续研究，以评估其在构建适用于三维细胞培养工程的MC基水凝胶系...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶（10%，15 孔，15 µl）	Biorad	4561036	每包 10 块
Applied Biosystems MicroAmp 光学粘性密封膜	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 片盖膜
10x 转膜缓冲液	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-甘氨酸（含 SDS）	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear 扣盖微量离心管，聚丙烯材质，透明，非无菌，每包 500 支，每箱 10 包	Corning	SCT-200-C	每包 500 支，每箱 10 包
BD Difco Bacto 琼脂	BD	214010	500 g
BD Difco 乳酸杆菌 MRS 肉汤	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒	Promega	G9681	96 孔板中每检测使用 100μl
完全蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001	每瓶 20 片
Corning 磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁，pH 7.4 ± 0.1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF 转印膜	fisher Scientific	IPVH00010	26.5 cm × 3.75 m 卷装；孔径：0.45 µm
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛网扣盖	Corning	352235	每包 25 支，每箱 500 支
胎牛血清，经认证，美国来源	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
iScript cDNA 合成试剂盒，25 × 20 µl 反应 #1708890	Biorad	1708890	25 × 20 µL 反应
iTaq 通用 SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 × 1 mL
Lactobacillus fermentum	Korean Collection for Type Cultures	KCTC 3112
盐酸半胱氨酸一水合物	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
甲基纤维素（3500–5600 mPa·s，2% 水溶液，20°C）	TCI	M0185	500 g
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码，0.1 mL）	Applied Biosystems	4346906	20 块
Millex-GS 注射器滤器，0.22 µm，混合纤维素酯，33 mm，环氧乙烷灭菌	Millipore	SLGS033SB	250 个
PE Annexin V 凋亡检测试剂盒（含 7-AAD）	Biolegend	640934	100 次检测
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
碘化丙啶	Introgen	P1304MP	100 mg
RIPA 裂解与提取缓冲液	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini 试剂盒（250）	Qiagen	74106	250 次
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
材料/设备/软件名称	公司	目录编号	备注/说明
抗 - p-IκBα (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 µg/mL
抗-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µg/mL
抗-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µl 腹水
抗-β-肌动蛋白 (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µg/mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		美国加利福尼亚州圣地亚哥
Synergy HTX 多功能微孔板读板仪	BioT	S1LFA
CO2 培养箱	Thermo fisher	HERAcell 150i
15 ml 锥形离心管	SPL	50015
50 ml 锥形离心管	SPL	50050
Corning Costar 超低吸附多孔板	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar 超低吸附多孔板	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL 试剂储液槽，每袋 5 个，无菌	Costar	4870
Countess 细胞计数专用载玻片	Thermofisher	C10228
Countess II FL 全自动细胞计数仪	invitrogen	AMQAF1000
EnSpire 多功能读板仪	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus 多通道移液器，8 通道	Eppendorf	3122000051
FlowJo 软件	TreeStar		美国俄勒冈州阿什兰
山羊抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1.5 mL
山羊抗兔 IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		美国加利福尼亚州圣地亚哥
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		日本东京
恒温摇床	Lab companion	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0	Fujifilm		日本东京
光密度（OD）LAMBDA 紫外/可见光分光光度计	Perkin Elmer		美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
相差显微镜	Olympus		日本东京
SPL 微量离心管 1.5 mL	SPL	60015
SPL 多通道储液槽，12 通道，聚苯乙烯，无菌	SPL	21012
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统	Thermo Fisher Scientific		美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
Vibra-Cell 超声波液体处理器	SONICS-vibra cell	VC 505	500 瓦超声处理器
乙烯基厌氧培养箱	COY LAB PRODUCTS