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方法文章

验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的实验方法

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DOI：

10.3791/61289

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2020年8月6日

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

本文内容

摘要

组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为赖氨酸乙酰转移酶）抑制剂（如CBP/p300）是治疗癌症的潜在药物。然而，目前亟需严谨的方法来验证这些抑制剂的有效性。三种体外验证方法包括：使用重组乙酰转移酶进行HAT活性检测、通过免疫印迹法检测细胞培养物中的组蛋白乙酰化水平，以及染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）。

摘要

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可催化组蛋白及其他蛋白质上赖氨酸残基的乙酰化，从而调控染色质动态和基因表达。由于CBP/p300等KATs在多种癌症发生中具有关键作用，目前正被广泛研究作为潜在的治疗靶点。针对KATs组蛋白乙酰转移酶（HAT）功能的新型小分子抑制剂的开发具有挑战性，需要可靠的检测方法来验证潜在抑制剂的特异性和效力。

本文概述了一套包含三种方法的流程，可用于对新型组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HATi）进行严格的体外验证。这些方法包括试管组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性检测、染色质高乙酰化抑制（ChHAI）检测以及染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）检测。在HAT活性检测中，将重组的HAT酶与组蛋白在试管反应体系中共同孵育，使组蛋白尾部特定的赖氨酸残基发生乙酰化修饰。该反应可被HATi所阻断，通过免疫印迹法可检测特定位点组蛋白乙酰化水平的相对变化。在HAT活性检测中鉴定出的抑制剂需进一步在细胞环境中加以验证。

ChHAI 检测利用免疫印迹法筛选新型组蛋白乙酰化转移酶抑制剂（HATi），这些抑制剂可减弱组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）所诱导的强烈组蛋白高乙酰化现象。使用 HDACi 具有帮助作用，因为通过免疫印迹法检测组蛋白乙酰化的基础水平通常较为困难。

HAT 和 ChHAI 检测可测量组蛋白乙酰化的整体变化，但无法提供特定基因组区域乙酰化状态的信息。因此，采用 ChIP-qPCR 来研究 HATi 对基因调控元件处组蛋白乙酰化水平的影响。该方法通过特异性免疫沉淀组蛋白-DNA 复合物，并利用 qPCR 分析纯化的 DNA 实现。这三种检测方法结合使用，可对新型 HATi 的特异性、效力及作用机制进行严谨验证。

引言

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可催化组蛋白和非组蛋白上赖氨酸残基的乙酰化修饰1,2,3,4。近期研究表明，KATs 及其乙酰转移酶功能可促进实体瘤的生长4,5,6,7,8,9。例如，CREB结合蛋白（CBP）/p300 是两个同源的 KATs，可调控癌症中的多种信号通路2,3。CBP/p300 具有明确的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性，可催化组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化（H3K27ac）2,4,5,10,11，该修饰是活性增强子、启动子区域以及活跃基因转录的重要标志12,13,14。CBP/p300 通过乙酰化组蛋白及其他转录因子，激活癌基因的转录，从而作为实体瘤中促生长信号通路的关键共激活因子4,9,15,16,17,18。由于其在肿瘤进展中的作用，CBP/p300 及其他 KATs 正被研究用于开发可阻断其致癌功能的新型抑制剂4,5,6,7,8,9,18,19,20。A-485 和 GNE-049 是成功开发高效且特异性靶向 CBP/p300 抑制剂的两个范例4,9。目前，针对 CBP/p300 及其他 KATs 的更多抑制剂正处于研究阶段。

先前所描述的KAT抑制剂（KATi）的质量正受到质疑，许多抑制剂表现出脱靶效应且表征不充分21。因此，对新型药物候选分子进行严格表征和验证，对于开发高质量的化学探针至关重要。本文概述了三项构成筛选与严格验证新型KATi效力及特异性的流程方案，重点在于抑制KAT的组蛋白乙酰转移酶功能（HATi）。以CBP/p300及其抑制剂为例进行说明，但这些方案可适用于其他具有HAT功能的KAT7。

第一种方案是一种体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性检测方法，该方法在受控的试管反应中使用纯化的重组p300蛋白和组蛋白。该检测操作简便、成本低廉，可用于低通量条件下的化合物筛选，且无需使用放射性材料。在此方案中，重组p300在短暂孵育期间催化组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化，随后通过标准的免疫印迹技术检测组蛋白乙酰化水平。该酶促反应可在存在或不存在CBP/p300抑制剂的条件下进行，以筛选能够降低组蛋白乙酰化的化合物。此外，可通过检测待测化合物对其他纯化的赖氨酸乙酰转移酶（如PCAF）的活性影响，利用HAT检测验证新化合物是否对CBP/p300具有选择性。由于该方法操作简单、成本低，并可评估抑制剂的效价和选择性，因此是研究新型抑制剂的理想起点。事实上，该方案在文献中常被用作体外筛选手段5,10。然而，在HAT检测中鉴定出的抑制剂并不总是在细胞培养体系中有效，因为试管反应系统远比活细胞体系简单。因此，有必要在细胞培养实验中进一步表征这些抑制剂的生物学活性22,23。

流程中的第二个方案是染色质高乙酰化抑制（Chromatin Hyperacetylation Inhibition, ChHAI）检测。该基于细胞的检测利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）作为工具，在与HATi共孵育之前诱导染色质中组蛋白的高乙酰化24。在细胞培养中，基础组蛋白乙酰化水平可能较低，若不添加HDACi以提高乙酰化水平，则难以通过免疫印迹进行检测。ChHAI检测的目的是鉴定能够减弱由HDAC抑制所引起的组蛋白乙酰化增加的新型HATi。该检测的优点包括成本低、操作相对简便，以及使用培养细胞，相比试管中的HAT检测具有更高的生理相关性。与HAT检测类似，本方案也采用标准的免疫印迹法进行数据采集。

HAT 和 ChHAI 检测可提供有关新型化合物抑制整体组蛋白乙酰化的效力数据，但无法揭示这些化合物对特定基因组区域修饰的影响方式。因此，最后一个实验方案——染色质免疫沉淀-定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）是一种细胞培养实验，用于研究基因组特定区域的 DNA-蛋白质相互作用。在 ChIP 实验中，首先对染色质进行交联以保留 DNA-蛋白质相互作用。随后从细胞中提取染色质，对 DNA-蛋白质复合物进行针对目标蛋白的选择性免疫沉淀（例如，使用特异性识别 H3K27ac 的抗体）。然后纯化 DNA，并通过 qPCR 进行分析。例如，ChIP-qPCR 可用于确定一种新型 HAT 抑制剂是否下调特定癌基因（如 Cyclin D125）位点的组蛋白乙酰化水平。尽管 ChIP-qPCR 是该领域常用的实验技术，但其优化过程可能较为困难4,10,26。本实验方案提供了在执行 ChIP-qPCR 过程中避免潜在问题的建议，并包含了应对数据进行的质量控制检查。

当联合使用时，这三种实验方案可对新型组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HATi）进行严格的表征与验证。此外，这些方法具有多种优势，因其操作简便、成本相对较低，并可提供有关全基因组及区域特异性组蛋白乙酰化的数据。

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方案

1. 体外HAT活性检测

  1. 缓冲液配制
    注意：缓冲液配方见表1。
    1. 配制5×检测缓冲液和6×十二烷基硫酸钠（SDS），于-20 °C保存。将SDS分装为1 mL每份。
    2. 配制10×SDS凝胶电泳缓冲液和10×TBST，室温保存。
    3. 配制1×转膜缓冲液，于4 °C保存。
      警告：请查阅本实验方案中所用所有化学品的安全数据表。SDS、DTT和溴酚蓝具有毒性，不得摄入、吸入，或接触皮肤及眼睛。请参阅安全数据表以了解正确的操作方法。操作危险化学品时请使用化学通风橱。
  2. HAT反应
    注意：阿纳卡酸是一种已知的p300抑制剂3，本实验中用作示例，以展示HAT检测如何鉴定新型p300抑制剂。有关步骤1.2.1的示意图，请参见补充实验方案（示意图1）。
    1. 在0.2 mL PCR管中配制以下酶反应体系：2 μL 5×检测缓冲液、1 μL纯化的p300（0.19 μg/μL）、1 μL阿纳卡酸（HATi）或用1×检测缓冲液稀释的DMSO对照，以及2 μL经高压灭菌的ddH2O。室温预孵育10分钟。然后向反应体系中加入3 μL 100 μM乙酰辅酶A和1 μL纯化的H3.1（0.2 μg/μL）。
    2. 将完整反应混合物置于PCR仪中，30 °C孵育1小时。
    3. 按1:10比例向6×SDS上样缓冲液中加入2-巯基乙醇。
    4. 从PCR仪中取出样品，向反应混合物中加入2 µL含2-巯基乙醇的6×SDS缓冲液。
      警告：2-巯基乙醇有毒，应在化学通风橱内操作。请参阅安全数据表以了解正确的操作方法。
    5. 将样品在95 °C金属浴中加热5分钟，随后置于冰上冷却。样品可于-20 °C或-80 °C保存，或按以下说明进行凝胶电泳和免疫印迹分析。
  3. 凝胶电泳与免疫印迹
    注意：若不熟悉凝胶电泳和免疫印迹操作，可参考此标准实验流程27，以获取步骤1.3.1–1.3.17的更多细节。其他相关信息可参见此处28,29,30,31,32,33。
    1. 将10 μL样品（来自步骤1.2.5）加入4–20%梯度聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中。在其中一个加样孔中加入5 μL蛋白分子量标记物作为参照。使用电泳槽在120 V电压下电泳90分钟。
    2. 使用转膜装置，在100 V电压下将凝胶中的蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续70分钟。
    3. 从转膜装置中取出膜，放入塑料容器中。加入含5%脱脂奶粉的1×TBST封闭液，室温下轻轻摇动封闭1小时。
    4. 弃去步骤1.3.3中的1×TBST。加入特异性乙酰化抗体（例如H3K18ac或H3K27ac一抗，用含5%脱脂奶粉的1×TBST按1:5,000稀释），4 °C轻轻摇动孵育过夜。
    5. 弃去一抗溶液。用不含脱脂奶粉的1×TBST在室温下轻轻摇动洗涤2次，每次15分钟。
    6. 将二抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST按1:20,000稀释，室温轻轻摇动孵育1小时。
    7. 弃去二抗溶液。用不含脱脂奶粉的1×TBST在室温下轻轻摇动洗涤2次，每次15分钟。
    8. 沥干膜上的1×TBST。按1:1比例混合HRP底物过氧化物溶液与HRP底物鲁米诺溶液（各1 mL），取2 mL混合液滴加至膜表面。
    9. 室温孵育5分钟。
    10. 将膜上多余的化学发光底物液体沥至纸巾上，将膜包裹于保鲜膜中，放入X光片暗盒内。
    11. 转移至专用于X光片处理的暗室。将X光片覆盖于膜上，关闭暗盒，曝光30秒。
      注意：X光片与膜的接触时间需根据实验确定。强信号需短时间曝光（数秒），弱信号可能需要更长时间曝光。
    12. 从暗盒中取出X光片，使用X光片处理器进行显影。具体操作步骤请参阅制造商说明书。
    13. 从保鲜膜中取出膜，用ddH2O在室温下轻轻摇动洗涤5分钟。
    14. 用0.2 M NaOH在室温下轻轻摇动孵育5分钟。
    15. 用ddH2O在室温下轻轻摇动洗涤5分钟。
    16. 加入含5%脱脂奶粉的1×TBST封闭液，室温轻轻摇动封闭1小时。
    17. 加入下一抗体稀释液（例如，若首次使用H3K18ac抗体，则此次检测H3K27ac），4 °C轻轻摇动孵育过夜。重复步骤1.3.4–1.3.17，直至完成所有抗体检测。

2. ChHAI 检测

  1. 体外药物处理及乙酰化组蛋白分析
    注：A-485 是一种高效且特征明确的 p300 组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HATi）2,4。由于其在细胞培养中的高效性和特异性，该抑制剂将在后续实验中使用。MS-275（Entinostat）24 是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi），可显著提高组蛋白乙酰化水平，有助于通过标准免疫印迹法更易检测乙酰化探针。有关步骤 2.1 中所用药物稀释方案的示意图，请参见补充方案（示意图 2）。
    1. 在 12 孔板中接种 100,000 个 MCF-7 细胞，并在 1 mL 细胞培养基中培养至 80–90% 汇合度。按以下实验设计标记各孔：第 1 孔：DMSO 对照（参考点）；第 2 孔：A-485（3 μM）；第 3 孔：A-485（10 μM）；第 4 孔：MS-275（3 μM）；第 5 孔：MS-275（3 μM）+ A-485（3 μM）；第 6 孔：MS-275（3 μM）+ A-485（10 μM）。
      注：培养 MCF-7 细胞时，使用完全 DMEM 培养基，并将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。完全 DMEM 配方见表 1。
    2. 接种后 24 小时，用移液器将 4 mL 完全 DMEM 培养基转移至无菌 15 mL 锥形管中。向 4 mL 培养基中加入 2 μL MS-275（6 mM 溶于 DMSO），终浓度为 3 μM MS-275。
    3. 另取一个无菌 15 mL 锥形管，向 4 mL 培养基中加入 2 μL DMSO。
      注意：请查阅安全数据表以正确操作 DMSO。某些类型的手套不适合处理 DMSO。
    4. 吸除第 4–6 孔中的细胞培养基，向每孔加入 1 mL 含 3 μM MS-275 的培养基（步骤 2.1.2 配制），未使用的稀释 MS-275 应弃去。
    5. 吸除第 1–3 孔中的细胞培养基，向每孔加入 1 mL 稀释的 DMSO（步骤 2.1.3 配制），未使用的稀释 DMSO 应弃去。
    6. 将细胞放回培养箱，孵育 4 小时，使暴露于 MS-275 的细胞（第 4–6 孔）中乙酰化组蛋白得以积累。
      注：MS-275 是一种 HDACi，可导致组蛋白超乙酰化24。此 4 小时预孵育步骤是必要的，以确保在加入可降低组蛋白乙酰化水平的 A-485 之前，MS-275 已诱导出超乙酰化状态2,4。
    7. 与 MS-275 孵育 4 小时后，在不同的无菌 1.5 mL 离心管中分别配制以下稀释液：向 1 mL DMEM 培养基中加入 1.0 μL DMSO；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL DMSO 和 0.5 μL A-485（6 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL DMSO 和 0.5 μL A-485（20 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL DMSO 和 0.5 μL MS-275（6 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL A-485（6 mM）和 0.5 μL MS-275（6 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL A-485（20 mM）和 0.5 μL MS-275（6 mM）。
    8. 吸除第 1–6 孔中的细胞培养基，向第 1 孔加入 1 mL 稀释液 1，第 2 孔加入 1 mL 稀释液 2，第 3 孔加入 1 mL 稀释液 3，第 4 孔加入 1 mL 稀释液 4，第 5 孔加入 1 mL 稀释液 5，第 6 孔加入 1 mL 稀释液 6。
      注：一般原则是平衡各实验组之间的 DMSO（溶剂）含量，并确保细胞培养基中 DMSO 含量不超过 0.1%，以避免细胞毒性及增殖变化。
    9. 将细胞放回培养箱，继续培养 20 小时。
    10. 20 小时后，吸除第 1–6 孔中的细胞培养基。
    11. 向第 1–6 孔中各加入 1 mL PBS 洗涤细胞，随后吸除 PBS。
    12. 向第 1–6 孔中各加入 100 μL 1× 被动裂解缓冲液（见表 1）。将细胞培养板（含被动裂解缓冲液中的样品）于 −80 °C 保存过夜，以实现冻融及细胞裂解。
      注意：配制缓冲液前，请查阅所有化学品的安全数据表。CDTA 可引起严重的眼部损伤和刺激。
    13. 在室温下轻轻振荡 10 分钟以解冻样品，将样品转移至不同的 1.5 mL 离心管中，并立即置于冰上。
    14. 测定各样品的蛋白浓度。蛋白浓度可通过多种成熟的方法测定34。
    15. 根据需要，使用 1× 被动裂解缓冲液调整样品 1–6 的蛋白浓度，使其在相同体积下蛋白浓度一致。
    16. 按 1:10 比例向 6× SDS 上样缓冲液中加入 2-巯基乙醇。
    17. 向样品 1–6 中加入含 2-巯基乙醇的 6× SDS 上样缓冲液，使终浓度为 1× SDS 上样缓冲液。
    18. 将样品在 95 °C 金属浴中加热 5 分钟，随后置于冰上冷却。样品可保存于 -20 °C 或 -80 °C，直至进行步骤 2.1.19。
    19. 向 4–20% 梯度聚丙烯酰胺凝胶的各孔中加入含 30 μg 蛋白的样品体积。按照方案 1 中描述的程序进行免疫印迹分析。

3. 染色质免疫共沉淀定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）

注意：以下方案以 p300 抑制剂为例进行说明。

  1. 缓冲液制备
    注意：缓冲液配方见表1。以下ChIP实验流程的通用步骤（如缓冲液配方、洗涤时间及离心时间）已根据市售试剂盒的生产商推荐（参见材料表）以及文献35,36进行了修改和优化。
    1. 配制ChIP稀释缓冲液、细胞核膨胀缓冲液、低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和TE缓冲液。4 °C保存。
    2. 配制SDS裂解缓冲液、10x甘氨酸缓冲液和ChIP洗脱缓冲液。室温保存。
      注意：配制缓冲液前，请查阅所有化学品的安全数据表，确保正确操作。
  2. 药物处理
    注意：步骤3.2中所用药物稀释方案的示意图见补充实验方案（示意图3）。
    1. 将MCF-7细胞接种于两个15 cm培养皿中，使用12 mL完全DMEM培养基培养至90%融合度。标记培养皿以对应以下实验设计：培养皿1：DMSO对照组（参考点）；培养皿2：A-485（3 μM）。
      注意：培养MCF-7细胞时，使用完全DMEM培养基，并在37 °C、5% CO2条件下培养。完全DMEM配方见表1。
    2. 在无菌的15 mL锥形管中，加入12 mL DMEM培养基，再加入6 μL DMSO。充分混匀。
    3. 在另一无菌的15 mL锥形管中，加入12 mL DMEM培养基，再加入6 μL A-485（DMSO中6 mM），终浓度为3 µM A-485。充分混匀。
    4. 吸除培养皿1和2中的培养基。
    5. 将12 mL稀释后的DMSO DMEM溶液（步骤3.2.2）加入培养皿1。
    6. 将12 mL含3 µM A-485的DMEM溶液（步骤3.2.3）加入培养皿2。
    7. 将细胞培养皿放回培养箱，孵育24小时。
  3. 细胞固定
    1. 向完全培养基中加入330 μL（每毫升培养基27.5 µL）37%甲醛，轻轻摇动培养板以混匀。
      注意：甲醛具有毒性，请查阅安全数据表以了解正确的操作程序。
    2. 室温孵育10分钟。
    3. 向培养板中加入2 mL 10x甘氨酸，轻轻摇动以混匀。
    4. 室温孵育5分钟。
    5. 孵育结束后，将培养皿置于冰上，并解冻一份蛋白酶抑制剂混合物。
    6. 使用步骤3.1中配制的缓冲液，为DMSO和A-485样品分别配制以下溶液：
      1. 含1:1,000稀释蛋白酶抑制剂混合物的PBS溶液2 mL
      2. 含1:1,000稀释蛋白酶抑制剂混合物的细胞核膨胀缓冲液1 mL
      3. 含1:1,000稀释蛋白酶抑制剂混合物的SDS裂解缓冲液0.5 mL
    7. 吸除细胞培养皿中的培养基，用15 mL冷PBS洗涤细胞两次。
    8. 向细胞培养皿中加入2 mL含蛋白酶抑制剂混合物的PBS溶液（步骤3.3.6.1），用细胞刮刀将细胞刮下并悬浮于溶液中。
    9. 将细胞悬液转移至微量离心管中。如有必要，用额外PBS收集残留细胞。
    10. 在4 °C下以800 x g离心5分钟，沉淀细胞。
    11. 吸除上清液，向沉淀中加入1 mL含蛋白酶抑制剂混合物的细胞核膨胀缓冲液（步骤3.3.6.2），重悬沉淀并在冰上孵育10分钟。
    12. 在4 °C下以2,700 x g离心5分钟，沉淀细胞核。
    13. 吸除上清液，向沉淀中加入0.5 mL含蛋白酶抑制剂混合物的SDS裂解缓冲液（步骤3.3.6.3），重悬沉淀并在冰上孵育10分钟。
    14. 将染色质样品保存在-80 °C，直至进行步骤3.4.1，或立即进入步骤3.4。
  4. DNA超声破碎
    1. 使用移液器将DMSO样品的染色质（步骤3.3.14）130 µL分别转移至两个DNA超声破碎管中（每管130 µL）。
    2. 使用移液器将A-485样品的染色质（步骤3.3.14）130 µL分别转移至两个DNA超声破碎管中（每管130 µL）。
    3. 使用以下超声参数将DNA破碎为约150–200 bp的片段：峰值入射功率（W）175，占空比10%，每脉冲200个循环，处理时间430秒。
      注意：不同型号的超声仪参数可能不同，需根据具体仪器调整参数，以获得适用于不同细胞系的合适片段大小。
    4. 超声处理后将样品置于冰上。
    5. 使用移液器将超声处理后的染色质转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以10,000 x g离心10分钟，沉淀碎片。
    6. 将上清液（含超声破碎后的染色质）转移至新管中，弃去沉淀物。超声破碎后的染色质可保存于-80 °C。
  5. 染色质免疫沉淀（ChIP）
    注意：步骤3.5中免疫沉淀组的示意图见补充实验方案（示意图3）。
    1. 测定步骤3.4.6中DMSO和A-485样品超声破碎后染色质的蛋白含量。可使用成熟的实验方法进行测定34。
      注意：为简化操作，本实验方案假设蛋白含量相等，每份样品使用100 µL超声破碎染色质。否则，需在相同体积下平衡各样品的蛋白含量。
    2. 将DMSO样品的超声破碎染色质100 µL分别加入两个1.5 mL离心管中（每管100 µL）。每管加入400 µL ChIP稀释缓冲液（含1:1,000稀释的蛋白酶抑制剂混合物），使总体积达到500 µL。从其中一管中取出5 µL溶液，于-20 °C保存，作为DMSO输入样品（Input）。
    3. 将A-485样品的超声破碎染色质100 µL分别加入两个1.5 mL离心管中（每管100 µL）。每管加入400 µL ChIP稀释缓冲液（含1:1,000稀释的蛋白酶抑制剂混合物），使总体积达到500 µL。从其中一管中取出5 µL溶液，于-20 °C保存，作为A-485输入样品（Input）。
    4. 使用移液器向DMSO和A-485样品对应的离心管中加入免疫沉淀（IP）抗体（如非特异性IgG对照抗体或H3K27ac特异性抗体）：IP #1 DMSO染色质加IgG抗体（5–10 µg）；IP #2 DMSO染色质加H3K27ac抗体（5–10 µg）；IP #3 A-485染色质加IgG抗体（5–10 µg）；IP #4 A-485染色质加H3K27ac抗体（5–10 µg）。
    5. 向每管中加入20 µL蛋白A磁珠，确保磁珠充分重悬。
    6. 在4 °C下旋转孵育过夜。
    7. 使用磁力架沉淀蛋白A磁珠，吸除上清液。注意不要扰动磁珠。
    8. 用500 µL至1 mL低盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，使用磁力架沉淀磁珠，吸除上清液。
    9. 用500 µL至1 mL高盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，使用磁力架沉淀磁珠，吸除上清液。
    10. 用500 µL至1 mL LiCl洗涤缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，使用磁力架沉淀磁珠，吸除上清液。
    11. 用500 µL至1 mL TE缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，将磁珠保留在TE缓冲液中，直至进行步骤3.5.14。
    12. 从冰箱中取出输入样品（步骤3.5.2和3.5.3），置于冰上。
    13. 解冻一份蛋白酶K。
    14. 使用磁力架沉淀磁珠，吸除磁珠中的TE缓冲液（来自步骤3.5.11）。
    15. 向每个样品（包括输入样品）中加入100 µL ChIP洗脱缓冲液和1 µL蛋白酶K。使用PCR仪在62 °C下振荡孵育2小时。
    16. 2小时后，使用PCR仪将样品加热至95 °C，持续10分钟。
    17. 将样品冷却至室温。
    18. 使用磁力架沉淀磁珠，将上清液（含目标DNA）转移至新的1.5 mL离心管中。
    19. 使用标准PCR纯化试剂盒纯化DNA。
    20. 纯化后的DNA可保存于-20 °C，并作为模板用于标准qPCR实验。请遵循试剂盒说明书进行qPCR操作。
  6. ChIP-qPCR数据分析
    注意：分析ChIP-qPCR结果的两种常用方法为相对于IgG抗体的富集倍数法和1%输入法。某商业来源提供了一个优秀的分析模板，可用于快速计算每种IP抗体/目标的富集倍数37。
    1. 为计算富集倍数和%输入值，将qPCR实验获得的各抗体（非特异性IgG、IP H3K27ac抗体和1%输入）的ΔCt值复制并粘贴至分析模板的相应区域，富集倍数和%输入值将自动计算生成。

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结果

体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）检测可用于筛选能够抑制p300 HAT活性对组蛋白底物作用的化合物。图1A展示了HAT检测的实验示意图。本实验中使用了一种已知的HAT抑制剂——阿纳卡酸（anacardic acid）3,38，浓度范围为12.5–100 µM。在100 µM浓度下，阿纳卡酸相较于对照组DMSO处理，显著下调了组蛋白H3第9位和第18位赖氨酸（Histone 3, Lysines 9 and 18）的p300催化乙酰化水平（图1B，第5泳道与第1泳道对比）。本实验采用浓度梯度设置，因为较低药物剂量可能对p300 HAT活性抑制作用不明显（图1B，第2–4泳道与第1泳道对比）。第6泳道反应体系中未添加乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），作为p300催化活性以及重组H3.1组蛋白基础乙酰化水平的阴性对照（

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讨论

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可乙酰化组蛋白尾部和转录因子上的多个赖氨酸残基，从而调控基因转录2,3。过去二十年的研究表明，KATs（如CBP/p300、PCAF和GCN5）可与致癌转录因子相互作用，并在多种实体瘤中促进肿瘤生长4,5,9,15,16,17,18。由于KATs在促进肿瘤生长中的作用日益凸显，它们正被作为癌症治疗中的新型靶点进行研究。在将新型KAT抑制剂（KATi）推进临床应用之前，必须对其效力、选择性和安全性进行仔细而严格的测试。最近的研究证据表明...

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披露

作者无任何利益冲突或需要披露的事项。

致谢

本研究得到了佛罗里达州卫生部詹姆斯和埃丝特·金生物医学研究计划（6JK03 和 20K07）、班克黑德-科利癌症研究计划（4BF02 和 6BC03）、佛罗里达乳腺癌基金会以及佛罗里达大学健康癌症中心的资助。此外，我们谨向 Zachary Osking 博士和 Andrea Lin 博士致以感谢，感谢他们在论文发表过程中提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 离心管Fisher Scientific05-408-129适用于所有方法
10 cm 培养皿Sarstedt AG & Co.83.3902用于 MCF-7 细胞的细胞培养
10 µl 吸头Fisher Scientific02-707-454适用于所有方法
1000 µl 吸头Corning4846适用于所有方法
10X 甘氨酸缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
10X 电泳缓冲液用于方法 1 和 2。配方见表 1。
10X TBST用于方法 1 和 2。配方见表 1。
12 孔板Corning3513用于方法 2
15 cm 培养皿Sarstedt AG & Co.83.3903用于方法 3
15 ml 圆锥形离心管Santa Cruz Biotechnologysc-200249用于方法 2 和 3
含 5% 脱脂奶粉和 0.02% 叠氮化钠的 1X TBST用于方法 1 和 2。可用于稀释需多次使用的初级抗体，允许初级抗体稀释液短期保存。不可用于稀释二抗。注意：叠氮化钠有毒。
含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST用于方法 1 和 2。用于封闭 PVDF 膜及抗体稀释。配方见表 1。
200 µl 吸头Corning4844适用于所有方法
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148用于 SDS 样品缓冲液的配制
4-20% 聚丙烯酰胺凝胶Thermo Fisher: InvitrogenXP04205BOX用于方法 1 和 2
5X 检测缓冲液用于方法 1。配方见表 1。
5X 被动裂解缓冲液用于方法 2。配方见表 1。
6X 十二烷基硫酸钠 (SDS)用于方法 1 和 2。配方见表 1。
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 抑制剂，用于方法 2 和 3。以 DMSO 溶解。
乙酰化-CBP(K1535)/p300(K1499) 抗体Cell Signaling Technology4771用于方法 1
乙酰辅酶 ASigma-AldrichA2056用于方法 1
乙酰化组蛋白 H3 (Lys 27) 抗体 (H3K27ac)Cell Signaling TechnologyCST 8173用于免疫印迹和染色质免疫沉淀 (ChIP) 的 H3K27ac 抗体
乙酰化组蛋白 H3 (Lys18) 抗体 (H3K18ac)Cell Signaling TechnologyCST 9675用于免疫印迹和染色质免疫沉淀 (ChIP) 的 H3K18ac 抗体
α-微管蛋白抗体Millipore SigmaT5168用于方法 2。稀释比例 1:20,000
阿那卡酸Cayman Chemical13144用于方法 1
抗小鼠 IgG HRP 偶联二抗Cell Signaling Technology7076用于方法 1 和 2。稀释比例 1:10,000
抗兔 IgG 二抗Jackson ImmunoResearch711-035-152用于方法 1 和 2。稀释比例 1:10,000 至 1:20,000
放射自显影胶片MIDSCIBX810用于方法 1 和 2
Belly Dancer 旋转平台Stovall Life Science Incorporated无货号用于方法 1 和 2
新生牛血清 (BCS)HyCloneSH30072.03细胞培养基
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma-AldrichA2153用于缓冲液配制
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126用于 SDS 样品缓冲液配制
CDTASpectrum Chemical125572-95-4用于缓冲液配制
细胞刮刀Millipore SigmaCLS3010用于方法 3
ChIP 稀释缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
ChIP 洗脱缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
MCF-7 细胞完全 DMEM 培养基用于方法 2 和 3。配方见表 1。
Covaris 130 µl 微量管Covaris520045用于方法 3 中与 Covaris S220 配合的超声破碎管
Covaris S220 聚焦式超声破碎仪CovarisS220用于方法 3 的 DNA 超声破碎
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma-Aldrich41639用于药物稀释和溶剂对照处理
DL-二硫苏糖醇 (DTT)Sigma-Aldrich43815用于 SDS 样品缓冲液配制
DMEMCorning10-013-CV细胞培养基
EDTAFisher ScientificBP120-1用于缓冲液配制
示例转膜槽和转膜装置Bio-rad1704070用于方法 1 和 2
EZ-Magna ChIP A/G 染色质免疫沉淀试剂盒Millipore Sigma17-10086用于方法 3
FK228 (Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7用于方法 2 的 HDAC 抑制剂
甲醛溶液Sigma-AldrichF8775用于细胞固定
甘油Fisher ScientificBP229-1用于缓冲液配制
甘氨酸Sigma-AldrichG7126用于缓冲液配制
HEPESSigma-Aldrich54457用于缓冲液配制
高盐洗涤缓冲液用于方法 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021用于缓冲液配制
Immobilon 化学发光 HRP 底物Millipore SigmaWBKLS0500用于方法 1 和 2
KClFisher ScientificBP366-500用于缓冲液配制
LiClSigma-AldrichL9650用于缓冲液配制
LiCl 洗涤缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
低盐洗涤缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
磁力分离器PromegaZ5341用于方法 3
甲醇Sigma-Aldrich494437用于缓冲液配制
小型凝胶电泳槽InvitrogenA25977用于方法 1 和 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2用于方法 2 的 HDAC 抑制剂。以 DMSO 溶解。
NaClFisher Scientific7647-14-5用于缓冲液配制
NaOHFisher ScientificS318-100用于方法 1 和 2 的缓冲液配制
正常兔 IgGBethyl LaboratoriesP120-101用于方法 3 的对照兔抗体
细胞核膨胀缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
PCR 纯化试剂盒Qiagen28104用于方法 3
青霉素/链霉素 100XCorning30-002-CI细胞培养基
磷酸盐缓冲液 (PBS)Corning21-040-CV用于方法 2 和 3
PIPESSigma-Aldrich80635用于缓冲液配制
脱脂奶粉Nestle Carnation用于方法 1 和 2
用于 Western 印迹转膜的 Power Pac 200Bio-rad用于方法 1 和 2
用于 SDS 凝胶电泳的 Power Pac 3000Bio-rad用于方法 1 和 2
预染蛋白 MarkerThermo Fisher26616用于方法 1 和 2
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichPI8340用于方法 3
蛋白 A 磁珠New England BioLabsS1425S用于方法 3
蛋白酶 KNew England BioLabsP8107S用于方法 3
PTC-100 可编程热循环仪MJ Research Inc.PTC-100用于方法 1
PVDF 转膜膜Millipore SigmaIEVH00005用于方法 1 和 2
重组 H3.1New England BioLabsM2503S用于方法 1
重组 p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100用于方法 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9用于方法 2 的 HDAC 抑制剂
SDS 裂解缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
叠氮化钠Fisher Scientific26628-22-8用于方法 1 和 2。注意：叠氮化钠有毒。请参阅 SDS 以获取正确操作方法。
碳酸氢钠Fisher ScientificS233-500用于缓冲液配制
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750用于缓冲液配制
十二烷基硫酸钠 (SDS)Sigma-Aldrich71725用于 SDS 样品缓冲液配制
标准加热块VWR Scientific ProductsMPN: 949030用于方法 1 和 2
台式离心机Eppendorf5417R适用于所有方法
TE 缓冲液用于方法 3。配方见表 1。
转膜缓冲液用于方法 1 和 2。配方见表 1。
曲古抑菌素 ACayman Chemical58880-19-6用于方法 2 的 HDAC 抑制剂
TrisFisher ScientificBP152-5用于缓冲液配制
Triton X-100Sigma-AldrichT8787用于缓冲液配制
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5用于方法 1 和 2 的缓冲液配制
X 光胶片处理器Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.SRX-101A用于方法 1 和 2

参考文献

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