组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为赖氨酸乙酰转移酶）抑制剂（如CBP/p300）是治疗癌症的潜在药物。然而，目前亟需严谨的方法来验证这些抑制剂的有效性。三种体外验证方法包括：使用重组乙酰转移酶进行HAT活性检测、通过免疫印迹法检测细胞培养物中的组蛋白乙酰化水平，以及染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）。
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摘要
摘要
赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可催化组蛋白及其他蛋白质上赖氨酸残基的乙酰化，从而调控染色质动态和基因表达。由于CBP/p300等KATs在多种癌症发生中具有关键作用，目前正被广泛研究作为潜在的治疗靶点。针对KATs组蛋白乙酰转移酶（HAT）功能的新型小分子抑制剂的开发具有挑战性，需要可靠的检测方法来验证潜在抑制剂的特异性和效力。
本文概述了一套包含三种方法的流程，可用于对新型组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HATi）进行严格的体外验证。这些方法包括试管组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性检测、染色质高乙酰化抑制（ChHAI）检测以及染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）检测。在HAT活性检测中，将重组的HAT酶与组蛋白在试管反应体系中共同孵育，使组蛋白尾部特定的赖氨酸残基发生乙酰化修饰。该反应可被HATi所阻断，通过免疫印迹法可检测特定位点组蛋白乙酰化水平的相对变化。在HAT活性检测中鉴定出的抑制剂需进一步在细胞环境中加以验证。
ChHAI 检测利用免疫印迹法筛选新型组蛋白乙酰化转移酶抑制剂（HATi），这些抑制剂可减弱组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）所诱导的强烈组蛋白高乙酰化现象。使用 HDACi 具有帮助作用，因为通过免疫印迹法检测组蛋白乙酰化的基础水平通常较为困难。
HAT 和 ChHAI 检测可测量组蛋白乙酰化的整体变化，但无法提供特定基因组区域乙酰化状态的信息。因此，采用 ChIP-qPCR 来研究 HATi 对基因调控元件处组蛋白乙酰化水平的影响。该方法通过特异性免疫沉淀组蛋白-DNA 复合物，并利用 qPCR 分析纯化的 DNA 实现。这三种检测方法结合使用，可对新型 HATi 的特异性、效力及作用机制进行严谨验证。
引言
赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可催化组蛋白和非组蛋白上赖氨酸残基的乙酰化修饰1,2,3,4。近期研究表明，KATs 及其乙酰转移酶功能可促进实体瘤的生长4,5,6,7,8,9。例如，CREB结合蛋白（CBP）/p300 是两个同源的 KATs，可调控癌症中的多种信号通路2,3。CBP/p300 具有明确的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性，可催化组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化（H3K27ac）2,4,5....
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方案
1. 体外HAT活性检测
- 缓冲液配制
注意：缓冲液配方见表1。- 配制5×检测缓冲液和6×十二烷基硫酸钠（SDS），于-20 °C保存。将SDS分装为1 mL每份。
- 配制10×SDS凝胶电泳缓冲液和10×TBST，室温保存。
- 配制1×转膜缓冲液，于4 °C保存。
警告：请查阅本实验方案中所用所有化学品的安全数据表。SDS、DTT和溴酚蓝具有毒性，不得摄入、吸入，或接触皮肤及眼睛。请参阅安全数据表以了解正确的操作方法。操作危险化学品时请使用化学通风橱。
- HAT反应
注意：阿纳卡酸是一种已知的p300抑制剂3，本实验中用作示例，以展示HAT检测如何鉴定新型p300抑制剂。有关步骤1.2.1的示意图，请参见补充实验方案（示意图1）。- 在0.2 mL PCR管中配制以下酶反应体系：2 μL 5×检测缓冲液、1 μL纯化的p300（0.19 μg/μL）、1 μL阿纳卡酸（HATi）或用1×检测缓冲液稀释的DMSO对照，以及2 μL经高压灭菌的ddH2O。室温预孵育10分钟。然后向反应体系中加入3 μL....
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结果
体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）检测可用于筛选能够抑制p300 HAT活性对组蛋白底物作用的化合物。图1A展示了HAT检测的实验示意图。本实验中使用了一种已知的HAT抑制剂——阿纳卡酸（anacardic acid）3,38，浓度范围为12.5–100 µM。在100 µM浓度下，阿纳卡酸相较于对照组DMSO处理，显著下调了组蛋白H3第9位和第18位赖氨酸（Histone 3, Lysines 9 and 18）的p300催化乙酰化水平（图1B，第5泳道与第1泳道对比）。本实验采用浓度梯度设置，因为较低药物剂量可能对p300 HAT活性抑制作用不明显（图1B，第2–4泳道与第1泳道对比）。第6泳道反应体系中未添加乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），作为p300催化活性以及重组H3.1组蛋白基础乙酰化水平的阴性对照（
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讨论
赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可乙酰化组蛋白尾部和转录因子上的多个赖氨酸残基，从而调控基因转录2,3。过去二十年的研究表明，KATs（如CBP/p300、PCAF和GCN5）可与致癌转录因子相互作用，并在多种实体瘤中促进肿瘤生长4,5,9,15,16,17,18。由于KATs在促进肿瘤生长中的作用日益凸显，它们正被作为癌症治疗中的新型靶点进行研究。在将新型KAT抑制剂（KATi）推进临床应用之前，必须对其效力、选择性和安全性进行仔细而严格的测试。最近的研究证据表明.......
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披露
作者无任何利益冲突或需要披露的事项。
致谢
本研究得到了佛罗里达州卫生部詹姆斯和埃丝特·金生物医学研究计划（6JK03 和 20K07）、班克黑德-科利癌症研究计划（4BF02 和 6BC03）、佛罗里达乳腺癌基金会以及佛罗里达大学健康癌症中心的资助。此外，我们谨向 Zachary Osking 博士和 Andrea Lin 博士致以感谢，感谢他们在论文发表过程中提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | 适用于所有方法 |
| 10 cm 培养皿 | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | 用于 MCF-7 细胞的细胞培养 |
| 10 µl 吸头 | Fisher Scientific | 02-707-454 | 适用于所有方法 |
| 1000 µl 吸头 | Corning | 4846 | 适用于所有方法 |
| 10X 甘氨酸缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| 10X 电泳缓冲液 | 用于方法 1 和 2。配方见表 1。 | ||
| 10X TBST | 用于方法 1 和 2。配方见表 1。 | ||
| 12 孔板 | Corning | 3513 | 用于方法 2 |
| 15 cm 培养皿 | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | 用于方法 3 |
| 15 ml 圆锥形离心管 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | 用于方法 2 和 3 |
| 含 5% 脱脂奶粉和 0.02% 叠氮化钠的 1X TBST | 用于方法 1 和 2。可用于稀释需多次使用的初级抗体，允许初级抗体稀释液短期保存。不可用于稀释二抗。注意：叠氮化钠有毒。 | ||
| 含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST | 用于方法 1 和 2。用于封闭 PVDF 膜及抗体稀释。配方见表 1。 | ||
| 200 µl 吸头 | Corning | 4844 | 适用于所有方法 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | 用于 SDS 样品缓冲液的配制 |
| 4-20% 聚丙烯酰胺凝胶 | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | 用于方法 1 和 2 |
| 5X 检测缓冲液 | 用于方法 1。配方见表 1。 | ||
| 5X 被动裂解缓冲液 | 用于方法 2。配方见表 1。 | ||
| 6X 十二烷基硫酸钠 (SDS) | 用于方法 1 和 2。配方见表 1。 | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 抑制剂，用于方法 2 和 3。以 DMSO 溶解。 |
| 乙酰化-CBP(K1535)/p300(K1499) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4771 | 用于方法 1 |
| 乙酰辅酶 A | Sigma-Aldrich | A2056 | 用于方法 1 |
| 乙酰化组蛋白 H3 (Lys 27) 抗体 (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | 用于免疫印迹和染色质免疫沉淀 (ChIP) 的 H3K27ac 抗体 |
| 乙酰化组蛋白 H3 (Lys18) 抗体 (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | 用于免疫印迹和染色质免疫沉淀 (ChIP) 的 H3K18ac 抗体 |
| α-微管蛋白抗体 | Millipore Sigma | T5168 | 用于方法 2。稀释比例 1:20,000 |
| 阿那卡酸 | Cayman Chemical | 13144 | 用于方法 1 |
| 抗小鼠 IgG HRP 偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | 用于方法 1 和 2。稀释比例 1:10,000 |
| 抗兔 IgG 二抗 | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | 用于方法 1 和 2。稀释比例 1:10,000 至 1:20,000 |
| 放射自显影胶片 | MIDSCI | BX810 | 用于方法 1 和 2 |
| Belly Dancer 旋转平台 | Stovall Life Science Incorporated | 无货号 | 用于方法 1 和 2 |
| 新生牛血清 (BCS) | HyClone | SH30072.03 | 细胞培养基 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | 用于缓冲液配制 |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B0126 | 用于 SDS 样品缓冲液配制 |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | 用于缓冲液配制 |
| 细胞刮刀 | Millipore Sigma | CLS3010 | 用于方法 3 |
| ChIP 稀释缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| ChIP 洗脱缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| MCF-7 细胞完全 DMEM 培养基 | 用于方法 2 和 3。配方见表 1。 | ||
| Covaris 130 µl 微量管 | Covaris | 520045 | 用于方法 3 中与 Covaris S220 配合的超声破碎管 |
| Covaris S220 聚焦式超声破碎仪 | Covaris | S220 | 用于方法 3 的 DNA 超声破碎 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | 用于药物稀释和溶剂对照处理 |
| DL-二硫苏糖醇 (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | 用于 SDS 样品缓冲液配制 |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 细胞培养基 |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | 用于缓冲液配制 |
| 示例转膜槽和转膜装置 | Bio-rad | 1704070 | 用于方法 1 和 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G 染色质免疫沉淀试剂盒 | Millipore Sigma | 17-10086 | 用于方法 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | 用于方法 2 的 HDAC 抑制剂 |
| 甲醛溶液 | Sigma-Aldrich | F8775 | 用于细胞固定 |
| 甘油 | Fisher Scientific | BP229-1 | 用于缓冲液配制 |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G7126 | 用于缓冲液配制 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | 用于缓冲液配制 |
| 高盐洗涤缓冲液 | 用于方法 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | 用于缓冲液配制 |
| Immobilon 化学发光 HRP 底物 | Millipore Sigma | WBKLS0500 | 用于方法 1 和 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 用于缓冲液配制 |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | 用于缓冲液配制 |
| LiCl 洗涤缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| 低盐洗涤缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| 磁力分离器 | Promega | Z5341 | 用于方法 3 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 494437 | 用于缓冲液配制 |
| 小型凝胶电泳槽 | Invitrogen | A25977 | 用于方法 1 和 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | 用于方法 2 的 HDAC 抑制剂。以 DMSO 溶解。 |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | 用于缓冲液配制 |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | 用于方法 1 和 2 的缓冲液配制 |
| 正常兔 IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | 用于方法 3 的对照兔抗体 |
| 细胞核膨胀缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | 用于方法 3 |
| 青霉素/链霉素 100X | Corning | 30-002-CI | 细胞培养基 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Corning | 21-040-CV | 用于方法 2 和 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | 用于缓冲液配制 |
| 脱脂奶粉 | Nestle Carnation | 用于方法 1 和 2 | |
| 用于 Western 印迹转膜的 Power Pac 200 | Bio-rad | 用于方法 1 和 2 | |
| 用于 SDS 凝胶电泳的 Power Pac 3000 | Bio-rad | 用于方法 1 和 2 | |
| 预染蛋白 Marker | Thermo Fisher | 26616 | 用于方法 1 和 2 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | PI8340 | 用于方法 3 |
| 蛋白 A 磁珠 | New England BioLabs | S1425S | 用于方法 3 |
| 蛋白酶 K | New England BioLabs | P8107S | 用于方法 3 |
| PTC-100 可编程热循环仪 | MJ Research Inc. | PTC-100 | 用于方法 1 |
| PVDF 转膜膜 | Millipore Sigma | IEVH00005 | 用于方法 1 和 2 |
| 重组 H3.1 | New England BioLabs | M2503S | 用于方法 1 |
| 重组 p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | 用于方法 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | 用于方法 2 的 HDAC 抑制剂 |
| SDS 裂解缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | 26628-22-8 | 用于方法 1 和 2。注意：叠氮化钠有毒。请参阅 SDS 以获取正确操作方法。 |
| 碳酸氢钠 | Fisher Scientific | S233-500 | 用于缓冲液配制 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | 用于缓冲液配制 |
| 十二烷基硫酸钠 (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | 用于 SDS 样品缓冲液配制 |
| 标准加热块 | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | 用于方法 1 和 2 |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5417R | 适用于所有方法 |
| TE 缓冲液 | 用于方法 3。配方见表 1。 | ||
| 转膜缓冲液 | 用于方法 1 和 2。配方见表 1。 | ||
| 曲古抑菌素 A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | 用于方法 2 的 HDAC 抑制剂 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | 用于缓冲液配制 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 用于缓冲液配制 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | 用于方法 1 和 2 的缓冲液配制 |
| X 光胶片处理器 | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | 用于方法 1 和 2 |
参考文献
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveal....
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