本文介绍了一种用于高效富集和分离微囊泡及外泌体的纸质器件的制备方案。
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本文内容
摘要
摘要
微囊泡和外泌体是释放到细胞外环境并在体内循环的小型膜性囊泡。由于它们含有多种来源于亲代细胞的生物分子，如DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质，因此对微囊泡和外泌体进行富集和分离是将其作为潜在生物标志物用于临床应用的关键步骤。然而，传统的分离方法（例如超速离心法）会导致微囊泡和外泌体的大量损失和结构损伤，且需要多次重复进行超速离心、加样以及试剂消耗等步骤 。本文介绍了一种基于折纸原理的装置（Exo-PAD）的详细制备方法，该装置旨在以简便的方式高效富集和分离微囊泡与外泌体。Exo-PAD具有类似手风琴的多层折叠结构，并设有样品汇聚区域，结合离子浓度极化技术，可在特定层上实现微囊泡和外泌体五倍的富集效果。此外，只需将Exo-PAD展开即可完成富集后微囊泡和外泌体的分离。
引言
微囊泡和外泌体是两种小的膜性囊泡，其大小分别为0.2−1 μm和30−200 nm。多种不同类型的细胞均可将其分泌到细胞外环境中1,2,3,4,5。它们以DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质等成分的形式携带来源细胞的信息，并通过血清、血浆、尿液、脑脊液、羊水和唾液等多种体液在体内循环6,7,8,9。因此，从生物体液中高效分离微囊泡和外泌体的技术，为疾病的诊断、预后评估和实时监测，以及新型治疗药物的开发提供了广泛的应用前景。
然而，基于超速离心的传统微囊泡和外泌体分离方法极为耗时，且会导致样品显著损失和污染。这是因为该方法涉及多个繁琐的移液和上样步骤，并需要在多次超速离心过程中弃去各种试剂5,6,10,11,12。此外，超速离心（约100,000 × g）产生的高剪切应力可能导致微囊泡和外泌体发生物理性裂解，回收率较低（5−23%）6,13,14。因此，必须开发一种高效、低损伤的微囊泡和外泌体分离技术，以减少损伤和损失，从而实现更高的回收率。
开发了一种基于折纸的装置（Exo-PAD），用于更简便、更温和且高效地分离微囊泡和外泌体6。Exo-PAD 的设计为多层折叠纸结构，具有依次连接的样品区域，其直径逐渐减小。该装置结合了离子浓度极化（ICP）技术，这是一种纳米电动力学现象，可实现带电生物分子的预富集。使用 Exo-PAD 可在特定层中使微囊泡和外泌体富集五倍，并通过简单展开装置即可实现分离。本文详细描述了 Exo-PAD，从整体装置的制备与操作到应用分析，以阐述该方法并展示代表性结果6。
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方案
1. 器件制备
- 使用打印机软件定义在纸张上的打印区域（材料表）。
注意：该设计包含12个蜡图案层，其中圆形样品区域的直径从5 mm逐渐缩小至2 mm（图1A）。 - 使用商用蜡打印机（材料表）在纤维素纸（材料表）的两面指定区域打印疏水性蜡（图1B）。
- 将打印好蜡的纸置于实验室烘箱中，在120 °C下加热80 s。
注意：此步骤通过实现打印蜡的热回流，使蜡渗透到纸张内部。采用此孵育方案时，图案分辨率为约2 mm。因此，请注意不要打印小于2 mm的图案，否则图案将被蜡堵塞。 - 使用裁切刀将打印好蜡的纸裁剪成单个装置（图1C）。
- 分别在最左侧和最右侧层的样品区域滴加5 μL和2 μL的选择性渗透膜溶液（例如Nafion；材料表）（图1D）。
- 将涂覆有选择性渗透膜的各层置于70 °C的加热板上30分钟，以蒸发选择性渗透膜的溶剂。
- 用压敏胶带密封涂覆层朝向缓冲溶液的最外表面，仅留一个小孔。
- 沿白色线条反复折叠打印的单个装置（即Exo-PAD）。
注意：通过折叠装置，所有样品区域将被汇聚连接（图1E）。这种汇聚式设计在施加电压进行ICP时可集中电场线，从而实现对微囊泡和外泌体更高效的富集。
2. 通过离子浓度极化实现微囊泡和外泌体的富集与空间聚焦
- 用移液器将15 μL微囊泡和外泌体样品（约3 x 1011 粒子/mL，溶于含0.05% Tween 20的0.1x磷酸盐缓冲液[PBS]中）加入汇聚式样品区，静置数秒以确保所有样品区域完全润湿（图1F）。
- 在Exo-PAD两端各放置一个丙烯酸腔室，并用小型文件夹夹紧Exo-PAD，防止其展开（图1G）。
- 向腔室内加入110 μL的0.1x PBS，并插入两个Ag/AgCl电极（图1H）。
- 使用电流-电压源测量系统（材料表）对电极施加30 V电压，持续20分钟。
注意：所施加的电压会引发ICP现象，从而将微囊泡和外泌体在Exo-PAD的第8和第9层上进行预浓缩。
3. 富集微囊泡和外泌体的分离
- 将折叠的 Exo-PAD 从亚克力腔室中分离，并展开装置，以从其他层中分离富集的微囊泡和外泌体（图 1I）。
- 打孔取下第 8 层和第 9 层中富集微囊泡和外泌体的样品区域，用于后续分析（图 1J）。
4. 扫描电子显微镜分析
- 通过将打孔区域浸入含有2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中固定1小时，再浸入含有1%四氧化锇的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中固定1小时，以固定富集的微囊泡和外泌体。
注意：四氧化锇为剧毒且危险的化学品。由于四氧化锇可穿透塑料材料，必须储存在玻璃容器中。任何操作四氧化锇的步骤均须在化学通风橱内进行，并佩戴双层腈手套。 - 使用逐步递增浓度的无水乙醇（即50%、70%、90%和100%）对固定的微囊泡和外泌体进行脱水处理，每次30分钟。
- 将样品置于干燥器中，浸入六甲基二硅氮烷中化学干燥30分钟。
注意：六甲基二硅氮烷为易燃且对湿气敏感的化学品，必须储存在干燥、通风良好并远离火源的区域。 - 通过溅射法在完全干燥的微囊泡和外泌体表面镀金/钯（约20 nm），并采集扫描电子显微镜（SEM）图像。
5. 纳米颗粒示踪分析
- 设备运行20分钟后，使用皮肤活检打孔器从第6、8、10层中打孔取出样本区域。
- 将每个打下的样本区域浸入缓冲液（0.1× PBS含0.01% Tween 20）中。
- 涡旋振荡10分钟，并在6,000 rpm下离心30秒，以重悬富集的微囊泡和外泌体。
- 从溶液中取出打下的样本区域，并使用纳米颗粒追踪分析仪（NTA）测定微囊泡和外泌体的浓度（材料表）。
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结果
必须优化操作时间，以实现富集微囊泡和外泌体的最大回收率。时间不足会导致微囊泡和外泌体迁移不充分，从而降低富集效果；而时间过长则会破坏空间聚焦，导致微囊泡和外泌体分散。因此，通过时间优化步骤，可确定微囊泡和外泌体的最大预浓缩倍数及其最终富集位置。为确定微囊泡和外泌体的最终位置，使用显微镜观察荧光标记的微囊泡和外泌体的时间序列迁移过程（图2A），并利用ImageJ软件对所有样品区域的荧光强度进行定量分析（图2B）。在富集过程开始前（图2A，0分钟），微囊泡和外泌体分散于所有样品区域，由于纸质基质的轻微过滤作用，荧光强度呈逐渐降低趋势（图2B，0分钟）。处理10分钟后（图2A，10分钟），微囊泡和外泌体发生电动力迁移，在第7层出现瞬时的预浓缩区带。进一步处理可使微囊泡和外泌体的预浓缩程度进一步提高。当处理时间达到20分钟时，微囊泡和外泌体在第8层和...
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讨论
尽管Exo-PAD已成功用于微囊泡和外泌体的富集与分离，但仍需仔细考虑以下几个关键点：1）设备制备过程中烘箱孵育的时间和温度，2）处理时间，3）不同层数和样品区域直径条件下电压的应用，以及4）在临床样本中的适用性。
方案中提供的孵育时间和温度是制备可靠器件的优化条件。孵育时间过长或温度过高可能导致蜡打印材料过度重熔，从而引起会聚结构变形。这将阻碍聚焦电场线的形成，进而在电动力富集过程中增加迁移阻力。
处理时间也是影响微囊泡和外泌体最大富集与分离效果的重要因素。处理时间<20 分钟时，由于不足以让微囊泡和外泌体充分迁移，导致预富集效果较差；而处理时间>20 分钟则会降低聚焦效率，造成已富集的微囊泡和外泌体发生扩散。根据本实验结果，20 分钟是实现微囊泡和外泌体最大富集与分离的最佳处理时间。
施加的电压是另一个需要考虑的重要因素。在本实验方案中，考虑到层数和样品区域的直径，采用 30 V 电压以实现稳定的预富集和分离。当器件中产生 ICP 现象时，根据所施加的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会资助，项目编号为 NRF-2018R1D1A1A09084044。J. H. Lee 在 2019 年获得了光云大学研究基金的资助。金惠林（Hyerin Kim）获得了韩国产业通商资源部（MOTIE）主导的“产业专门人才能力开发项目”的支持，该项目由韩国技术革新振兴院（KIAT）负责实施（项目编号：P0002397，可穿戴智能设备产业融合人力资源开发项目）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ag/AgCl 电极 | A-M Systems, Inc. | 531500 | 直径 0.15" |
| 牛血清白蛋白（BSA）Alexa Fluor 594 标记物 | Thermo Fisher Scientific | A13101 | 与 Alexa Fluor 594 偶联的 BSA（激发/发射波长：590/617 nm） |
| 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | 碳酸盐缓冲液 |
| CorelDraw 软件（Coral Co., Canada） | Corel Corporation | 用于定义蜡印区域的打印软件 | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | 蜡打印机 | |
| 色谱纸，1 号 | Whatman | 3001-861 | 纤维素纸，尺寸：20 * 20 cm |
| 荧光标记外泌体标准品 | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | 用 FITC 标记的外泌体（激发/发射波长：490/520 nm） |
| Keithley 2410 电流/电压源表 | Keithley Instruments, Inc. | 电流–电压源测量系统 | |
| 全氟磺酸树脂溶液（Nafion） | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | 选择性渗透膜，20 wt.% 溶于低级脂肪醇和水的混合物中；含 34% 水 |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | 纳米颗粒追踪分析（NTA）仪器 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4） | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
参考文献
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