微量和外显子的纸基预集中和分离

Summary

提供是一种制造纸基装置的协议，用于有效丰富和分离微囊和外显体。

Abstract

微囊和外体是小膜囊泡释放到细胞外环境，并在整个身体中循环。由于它们含有各种亲细胞衍生生物分子，如DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质，因此它们的浓缩和分离是它们作为临床应用的潜在生物标志物被开发的关键步骤。然而，传统的分离方法（例如，超离心）对微囊和外显体造成重大损失和损害。这些方法还需要多个重复步骤的超离心，加载和浪费试剂。本文介绍了一种详细的方法，以制造一个折纸为基础的设备（Exo-PAD），旨在有效地丰富和隔离微囊和外体在简单的方式。Exo-PAD 的独特设计由手风琴样多层和收敛样品区组成，与离子浓度极化技术集成，从而使特定层的微囊和外显体具有五倍的富集。此外，通过展开 Exo-PAD，分离出富集的微囊和外显子。

Introduction

微囊和外显体是小膜囊泡，分别测量0.2±1μm和30±200nm。它们被^,几个不同的细胞类型^{,1、2、3、4、53,分分泌入细胞,外环境}。²它们含有DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质子集形式的亲细胞信息，通过各种体液（如血清、血浆、尿液、脑脊液、羊水以及唾液^{,,6、7、8、9）7}在体内^循环。⁶⁸因此，从生物液体中有效分离微囊和外体的技术可以在疾病的诊断、预后和实时监测以及开发新疗法方面提供广泛的机会。

然而，传统的基于超离心的微囊和外体分离方法非常耗时，并导致样品的显著损失和污染。这是因为它涉及几个繁琐的移液和装载步骤和丢弃各种试剂与重复的超离心^{5，6，10，11，12。6,10,11,125}此外，超离心引起的高剪切应力（±100，000 x g）可导致微囊和外显子的物理解损伤，产生不良的回收率（5~23%）6、13、14。^6,13,14因此，必须开发一种高效、不显眼的微囊和外体隔离技术，以减少损伤和损失，从而实现更高的回收率。

一种以折纸为基础的装置（Exo-PAD）被开发用于简单、温和、高效分离微囊和外显体^6。Exo-PAD 的设计是一种多面纸，具有连续连接的样品区域，直径逐渐减小。离子浓度极化（ICP）技术是一种纳米电动力学现象，预浓缩带电生物分子，并融入这一独特的设计。使用 Exo-PAD 可使特定层中的微囊和外体富集五倍，并且只需展开设备即可进行隔离。本文详细介绍了Exo-PAD，从整体器件的制造和操作到分析其使用，以说明该方法并展示具有代表性^{的结果6。}

Protocol

1. 设备制造

1. 使用打印机软件（材料表）定义要在纸张上打印区域。
   注:该设计有12个蜡纹层，其中圆形样品区域的直径逐渐从5毫米缩小到2毫米（图1A）。
2. 使用商业蜡印机（材料表）在纤维素纸（材料表）两侧的指定区域上打印疏水蜡（图1B）。
3. 将蜡印纸在 120 °C 下放入实验室烤箱中 80 度。
   注:此步骤通过实现印刷蜡的热回流，使蜡到达纸张内部。有了此孵育协议，该模式的分辨率为 ±2 mm。因此，注意不要打印小于2毫米的图案，否则图案将被蜡封杀。
4. 用切割机切割蜡印纸，以制造单个设备（图1C）。
5. 滴 5 μL 和 2 μL 的渗透膜（例如，纳菲翁;材料表）分别到最左侧和最右侧图层中的采样区域（图 1D）。
6. 将涂有渗透膜的层在70°C的热板上放置30分钟，以蒸发渗透膜溶剂。
7. 用压敏胶带密封涂层层最外层，面对缓冲液，留下一个小孔。
8. 沿白线来回折叠打印的单个设备（即 Exo-PAD）。
   注:通过折叠设备，所有采样区域都变得收敛连接（图1E）。这种收敛设计在将电压应用于ICP时聚焦电场线，实现微囊和外显体更密集的预集中。

2. 通过离子浓度极化对微囊和外体进行丰富和空间聚焦

1. 通过移液在收敛样品区域中加载 15 μL 的微囊和外显组样品（±3 x 10¹¹颗粒/mL，在 0.1 倍磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 中，用 0.05% Tween 20）在收敛样品区域中，并等待几秒钟，以确保所有样品区域完全湿润（图 1F）。
2. 将两个丙烯酸腔室放在 Exo-PAD 的两端，用小粘结夹牢固地夹紧夹住 Exo-PAD，以防止展开（图 1G）。
3. 用 110 μL 的 0.1x PBS 填充腔室，并插入两个 Ag/AgCl 电极（图 1H）。
4. 使用电流电压源测量系统（材料表）对电极应用 30 V 20分钟。
   注:施加的电压产生ICP现象，因此预集中的微囊和外显子在8层和9层的Exo-PAD。

3. 分离富集的微囊和外体

1. 将折叠的 Exo-PAD 与丙烯酸室分离，并展开设备，将富集的微囊和外显体与其他层分离（图1I）。
2. 冲出第8层和9层的样品区域，其中对微囊和外体进行丰富的分析，用于下游分析（图1J）。

4. 扫描电子显微镜分析

1. 修复富集的微囊和外显体，将冲孔区域浸入 2.5% 的谷胱甘肽中，在 0.1 M 卡沙丁酸钠缓冲液中煮 1 小时，在 0.1 M 卡沙丁酸钠中浸入 1% 的四氧化二氮中 1.
   注意:三氧化硅是剧毒和危险的化学品。因为三氧化硅可以穿透塑料，所以必须储存在玻璃中。任何对三氧化钛的处理都必须在化学烟气罩中，并配有双硝酸盐手套。
2. 用200个证明乙醇（即50%、70%、90%和100%）的提升等级对固定微囊和外体进行脱水每人30分钟。
3. 将样品浸入六甲基二甲苯干燥器中，在干燥器中浸30分钟，对样品进行化学干燥。
   注意:六甲基二甲苯是一种易燃和对水分敏感的化学物质。它必须存放在干燥通风良好的区域，远离点火源。
4. 通过溅射和捕获扫描电子显微镜 （SEM） 图像，用金/铂（±20 nm）将完全干燥的微囊和外显体涂上金/铂（±20 nm）。

5. 纳米粒子跟踪分析

1. 在设备操作 20 分钟后，使用活检冲头，在 6、8 和 10 层中冲出样品区域。
2. 将每个冲孔区域浸入缓冲液中（0.1 倍 PBS，带 0.01% Tween 20）。
3. 漩涡10分钟，在6，000转/分时离心30秒，以重新暂停富集的微囊和外显体。
4. 从溶液中去除冲孔区域，通过纳米粒子跟踪分析 （NTA） 仪器（材料表）测量微囊和外显子的浓度。

Results

必须优化操作时间，以实现富集的微囊和外显体的最大回收率。时间不足不允许足够的微囊和外体迁移，从而减少富集，而过多的时间会恶化空间聚焦，从而分散微囊和外体。因此，通过时间优化步骤，可以确定微囊和外体的最大预集中系数以及微囊和外体最丰富的最终位置。为了找到微量和外显子的最终位置，用显微镜观察了荧光标记微量微量和外显子的延时迁移（图2A），并使用 ImageJ 软件量化了所有样本区域的荧光强度（图2B）。在富集过程（图2A，0分钟）之前，由于纸基的轻微过滤作用，微囊和外体分散在所有样品区域，强度逐渐降低（图2B，0分钟）。经过10分钟的处理（图2A，10分钟），微囊和外体通过电皮迁移，第7层出现即时预集中塞。进一步加工实现了微囊和外显体更大的预集中。当过程时间达到20分钟时，微囊和外体强烈聚焦在8层和9层（...

Discussion

虽然 Exo-PAD 已成功用于显微和外显子的富集和分离，但应仔细考虑几个关键点:1） 设备制备期间的烤箱孵化时间和温度，2） 处理时间，3） 施加不同层数和样品面积直径的电压，以及 4） 适用于临床样品。

协议给出的孵化时间和温度是制造可靠器件的优化条件。由于印刷蜡的回流过多，较长的孵育时间或较高的温度可能会导致收敛设计失真。这将防止聚焦电场线路的形成，从而增加电动力学富集过程中的迁移阻力。

处理时间也是最大浓缩和隔离考虑的一个因素。<20 分钟的处理时间会导致预集中减少，因为没有足够的时间允许微囊和外体迁移。另一方面，20 分钟的处理时间会降低对焦效率，并允许富集的微囊和外显子的分散。根据这项测试，20分钟是实现最大富集和分离微囊和外体的最佳处理时间。

施加的电压是另一个需要考虑的重要因素。在此协议中，考虑到层数和样品面积直径，30 V 用于实现稳定的预集中和隔离。当器件中产生ICP现象时，根据施加的电压可分为三个不同的区域:（1）欧姆，（2）限制，（3）超限区域

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ag/AgCl 电极	A-M Systems， Inc.	531500	0.15 英寸直径
牛血清白蛋白 （BSA），Alexa Fluor 594 偶联物	Thermo Fisher Scientific	A13101	BSA 与 Alexa Fluor 594 偶联物（激发/发射波长：590/617 nm）
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液	Sigma-Aldrich	C3041-50CAP	碳酸盐缓冲液
CorelDraw 软件（Coral Co.，加拿大）	Corel Corporation		用于定义蜡质打印的打印机软件地区
ColorQube 8870	施乐公司		蜡质打印机
色谱纸 1 级	Whatman	3001-861	纤维素纸，尺寸：20 * 20 厘米
荧光标记的外泌体标准品	HansaBioMed Life Sciences， Ltd.	HBM-F-PEP-100	外泌体（激发/发射波长：490/520 nm）
Keithley 2410 电流/电压源计	Keithley Instruments， Inc.		当前–电压源测量系统
Nafion 全氟树脂溶液	Sigma-Aldrich	31175-20-9	选择性膜，在低级脂肪醇和水的混合物中含量为 20 wt.%;含有 34% 的水
NanoSight LM10	NanoSight 技术		纳米颗粒跟踪分析 （NTA） 机
磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）	Thermo Fisher Scientific	10010001