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方法文章

一种用于准确测定线粒体毒剂细胞毒性的自动化差异核染色检测法

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⸱

DOI：

10.3791/61295

⸱

2020年5月12日

 ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种快速、高通量、可靠、经济且无偏倚的检测方法，可高效测定细胞活力。当细胞线粒体受损而干扰其他检测方法时，该方法尤为适用。该检测利用两种细胞核染料——Hoechst 33342 和碘化丙啶——对细胞进行染色，并通过自动计数实现分析。

摘要

线粒体在肿瘤发生转化中的作用是当前广受关注且活跃研究的课题。随着癌症代谢领域的日益复杂，利用多种可导致线粒体损伤的化合物（即所谓的“线粒体靶向抗癌剂”，mitocans）来靶向线粒体的策略正变得越来越流行。然而，许多现有的细胞毒性检测方法（例如基于四唑盐或刃天青的检测）依赖于线粒体酶的正常功能才能发挥作用。而靶向线粒体的化合物所造成的损伤常常会影响这些检测方法的准确性。本文介绍了一种改进的实验方案，该方案基于两种荧光染料的差异性染色：其中一种可穿透细胞膜（Hoechst 33342），另一种则不能（碘化丙啶，propidium iodide）。通过染色差异可有效区分活细胞与死细胞。该检测方法适用于自动化显微镜成像和图像分析，从而提高通量并减少人为偏差。此外，该方法可在96孔板中以高通量方式运行，因此特别适用于具有一定程度线粒体毒性的药物筛选工作。重要的是，与其它方法相比，Hoechst/PI染色法所得结果在台盼蓝排斥实验结果之间以及生物学重复之间均表现出更高的重复性和一致性。

引言

识别有效癌症治疗方法的第一步是选择一种稳健且无偏倚的细胞毒性检测方法，用于评估治疗效果。对于低通量实验，常用的方法是台盼蓝染料排斥法。该方法的优势在于能够相对无偏倚地定量细胞存活率。台盼蓝可被动扩散进入细胞膜受损的细胞，但无法进入健康细胞，因而被有效阻隔在外1活细胞数与总细胞数的比值代表细胞存活率，用以反映处理方法的有效性。台盼蓝染色法最主要的缺点是不适用于高通量研究方法。该方法信噪比较低，且长时间染色可能导致活细胞被染色，从而产生假象。因此，台盼蓝排染法通常但并非总是2，只能依赖人工计数。这使其过于缓慢且引入了人为误差 由于研究者的主观判断可能导致较高的偏倚风险（除非采用盲法或独立计数，但这会进一步降低实验室通量）。总体而言，该检测方法的通量不足以满足现代药物发现的需求。

活力检测方法通常具有更高的通量，可使研究人员规避这一限制，但也存在显著的局限性（见 表1）。这些方法通常分为两类。其中一类为基于细胞氧化还原酶功能的比色法检测。无色或非荧光性的底物被转化为显色产物，可通过分光光度计进行定量。经典示例包括四唑盐类（MTT、WST-1、XTT等）和刃天青。该类别还包括利用荧光素检测ATP水平的发光法检测。此类检测方法的根本局限在于其测量的是细胞代谢活性，而非严格意义上的细胞活力。per se。在不利条件下，细胞常进入静息状态，但仍保留分裂能力，这种情况十分常见3,4,5。例如，肿瘤干细胞通常代谢活性相对较低6,7,8,9，因此使用这些技术检测时可能难以准确评估。此外，对于损伤线粒体功能的治疗手段（如大多数线粒体靶向抗癌剂），其疗效也极有可能被显著高估。

另一种方法利用了不同物质的化学特性，这些特性决定了它们能否穿过生物膜。一个例子是 核染料，如SYTOX或碘化丙啶（PI）。该类别还包括在概念上相似但功能不同的检测方法，例如乳酸脱氢酶（LDH）检测，该方法通过测量LDH释放到细胞外环境中的量来评估细胞坏死情况（图1，表1）。这类检测方法能够更有效地区分代谢失活细胞与死亡细胞。

检测方法/染料可检测的细胞死亡类型所需设备主要特点
MTT、CKK-8、Alamar Blue（刃天青）凋亡/坏死分光光度计成本低、速度快；为终点检测法；依赖酶活性（MTT仅依赖线粒体酶活性），无法区分细胞死亡方式1,10
LDH释放坏死分光光度计快速，不依赖线粒体酶活性；高通量检测成本较高；可检测细胞膜受损的坏死细胞11,12
台盼蓝（TB）凋亡/坏死显微镜细胞膜不渗透性染料；无法区分细胞死亡方式；操作繁琐，不适合高通量筛选；对贴壁细胞使用较困难；结果易受操作者主观判断影响，但被公认为细胞活力检测的标准方法13
吖啶橙（AO）凋亡/坏死/荧光显微镜一种具有独特光谱特性的核酸染料，可区分凋亡与坏死/坏死性凋亡14
坏死性凋亡
Hoecsht 33342、DAPI凋亡荧光显微镜或流式细胞仪可穿透细胞膜；单独使用不适合监测细胞死亡；适用于共染色；可用于评估早期凋亡中的染色质浓缩和核碎裂；可与碘化丙啶联合使用以区分凋亡与坏死15,16
碘化丙啶（PI）晚期凋亡/坏死荧光显微镜或流式细胞仪细胞膜不渗透性嵌入染料；可检测晚期凋亡和坏死两种细胞死亡方式17。具有毒性，长时间孵育后可能穿透细胞膜18

表1. 细胞毒性检测方法列表。 列出了部分在本研究中使用的细胞毒性检测方法及其关键特征的简要描述。

近期研究表明，某些癌症中的线粒体代谢发生了改变19,20,21,22,23,24,25。例如，急性髓系白血病（AML） 已被证实会增加其线粒体数量、线粒体DNA含量以及线粒体呼吸作用，以满足其能量需求19,26,27。另一方面，一些实体瘤的特征是线粒体功能障碍，或称为“代谢重编程”，例如参与氧化磷酸化（OXPHOS）的线粒体蛋白表达下调或线粒体DNA含量减少，这些变化与肿瘤侵袭性、转移潜能以及对诱导凋亡药物的耐药性相关28,29。此外，近年来人们越来越关注使用作用机制多样的、影响线粒体功能的化合物（通常称为mitocans30）作为特定癌症的潜在治疗手段。这类药物靶向ATP合成、线粒体DNA、氧化磷酸化（OXPHOS）和活性氧（ROS）的产生，同时也作用于与线粒体相关的促凋亡和抗凋亡蛋白30,31。多项研究已表明，该策略具有显著的应用前景19,32,33,34。然而，这些癌症细胞生物学中的代谢异常或靶向线粒体的治疗手段可能会显著影响基于线粒体功能的传统细胞活力检测方法。

本文介绍了一种优化的差异性核染色检测方案。该方案可快速、准确地测定线粒体靶向抗癌化合物（mitocans）或其与其他化合物联用时的细胞毒性。Hoechst 33342 是一种可穿透细胞膜的核染料，能够自由穿过细胞膜对 DNA 进行染色，从而获得总细胞数。通过与仅能进入死细胞核的 PI 共同染色，可准确测定活细胞（仅 Hoechst 染色）与死细胞（两种染料均染色）的比例。本方案在已发表的检测方法35基础上进行了改进，增加了染料浓度优化步骤（通过与台盼蓝染色法的结果进行交叉验证）以及成像前对培养板进行离心处理。由于许多细胞系为半贴壁或悬浮生长状态，离心可增加被成像的细胞比例，显著提高检测准确性。该检测具有多项优势，包括染色过程无需更换培养基或洗涤步骤。染料混合物成本低廉、配制简便，并且适用于多通道/自动化移液系统。

细胞染色后，使用自动显微镜进行成像。这种方法的额外优势在于能够生成图像的永久记录，便于后续重新分析，并可通过直接观察所采集的图像重新评估特定化合物的作用效果。获得图像后，可通过手动方式或多种软件工具（包括免费软件如 ImageJ、CellProfiler 等，以及商业软件如 Metamorph、Gen5 等）对细胞进行计数。通常更推荐使用自动细胞计数方法，因为设计合理的自动化计数流程比人工计数更准确且偏差更小，同时也能更有效地排除细胞碎片或不溶性复合物的干扰。这些分析流程的建立通常较为直接，且所用染料的高效性进一步简化了开发过程。该方法的输出结果为定量数据，死细胞的实际数量会相对于总细胞数自动计算得出，并可根据需要设定不同阈值以提高或降低检测的严格性35。为方便起见，文中提供了使用 Gen5 v. 3.00 软件在 Cytation 5 细胞成像多模式读板仪上进行细胞计数的优化参数 。

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方案

1. 细胞毒性实验：准备

  1. 将目标化合物在适当的培养基（无血清或含1%、2.5%或5% FBS的RPMI-1640）中配制成所需浓度的溶液。
    1. 若需测定单一化合物的细胞毒性（例如确定有效剂量），应将化合物配制成最终浓度的2倍。
    2. 若需测定化合物组合的细胞毒性，应将化合物配制成最终浓度的4倍。
    3. 通过将相同体积的溶剂与相应培养基混合，制备仅含溶剂的对照组。例如，若待测化合物分别溶解于DMSO和甲醇中，则需分别为每种溶剂制备仅含该溶剂的对照组。
  2. 将细胞从培养皿或培养瓶中收集至15 mL圆锥形离心管中。
  3. 取10 µL细胞悬液转移至微量离心管中，加入10 µL 0.4%台盼蓝染液。使用血细胞计数板对每种来源的细胞分别计数活细胞与死细胞数量。
  4. 在200 g 条件下离心5分钟使细胞沉淀，随后吸除或倾倒上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于适合检测的培养基（无血清或含1%、2.5%、5% FBS的RPMI-1640）中，调整细胞密度至3×105 个细胞/mL。
    注1：细胞密度为3×105 个细胞/mL时，可实现每孔15,000个细胞的接种密度。接种密度是一个重要参数，理想情况下应在实验前预先确定。确定接种密度时应考虑以下因素：1）细胞大小——通常较大的细胞以较低密度接种；2）处理时间——处理时间较长的实验通常采用较低的接种密度；3）细胞分裂速率——分裂速率较高的细胞应以较低密度接种。优化接种密度的具体示例包括：K562细胞（较大，处理24小时）——每孔10,000个细胞；MOLM-13细胞（中等大小，处理24小时）——每孔15,000个细胞；MOLM-13细胞（处理48小时）——每孔8,000个细胞；较小的健康外周血单个核细胞（PBMCs，处理24小时）——每孔50,000个细胞；原代急性髓系白血病（AML）细胞（处理24小时）——每孔15,000–20,000个细胞。
    注2：培养基中FBS的存在可能影响化合物的活性。降低FBS浓度可能使检测结果更易于解释，但也会降低生理相关性。
  6. 使用多通道移液器将步骤1.5中的细胞悬液各50 µL接种至96孔板的每个孔中。
  7. 按以下方式加入化合物：
    1. 对于单一化合物检测，向每孔加入50 µL 2倍浓度的化合物溶液；对于溶剂对照孔，加入含2倍浓度溶剂的测试培养基50 µL。
    2. 对于联合用药检测，向每孔加入各25 µL的4倍浓度化合物溶液（即两种4倍浓度化合物各加25 µL）；对于单药对照孔，加入25 µL 4倍浓度的化合物溶液和25 µL测试培养基；对于溶剂对照孔，加入50 µL测试培养基或含溶剂的测试培养基。
      注1：DMSO的最终浓度不应超过0.5%。
      注2：由于加入体积较小，建议将含化合物的培养基用移液器沿每孔孔壁缓慢加入，以确保准确加样。
  8. 轻轻敲击培养板，使各孔内液体充分混匀。
  9. 将培养板置于37 °C、含5% CO2 的湿润培养箱中孵育适当时间，例如24小时。

2. 细胞毒性检测：Hoechst 33342 与碘化丙啶染色

  1. 配制10倍染色液。该溶液需在每次实验前新鲜配制，不能保存。实验前应确定染料的终浓度。
    1. 对于白血病细胞系和原代白血病细胞，1 mL 的 10 倍染色缓冲液包含 10 µL 20 mM Hoechst 33342 溶液 50 µL 1 mg/mL 碘化丙啶的无菌 PBS 溶液（终浓度：Hoechst 33342） 20 µM，PI 5 µg/mL).
    2. 对于健康的PBMC，1 mL 10倍染色缓冲液包含 10 µL 20 mM Hoechst 33342 溶液 10 µL 1 mg/mL 碘化丙啶的无菌 PBS 溶液（终浓度：Hoechst 33342） 20 µM，PI 1 µg/mL).
      注意：碘化丙啶的最终浓度需在实验前确定。应使用一系列 PI 浓度（1、2.5、 5 µg/mL），然后应将Hoechst/PI计算的存活率与台盼蓝测定的存活率进行比较。上述所列PI浓度是根据培养基对照孔中目标细胞的存活率选定的（白血病细胞系高于约90%，健康PBMCs高于约70%）。
      警告：Hoechst 33342 和碘化丙啶具有潜在致癌性。操作时应穿戴适当的个人防护装备。
  2. 孵育后，使用多通道移液器加入 10 µL 每孔加入10倍浓度的染色缓冲液。
    注意：为防止交叉污染，请确保移液器吸头不接触培养基。
  3. 轻轻敲击板子以混匀并去除气泡。染色于 37 °C 15分钟。
  4. 将培养板在200 × g条件下离心 g 4 分钟，使所有细胞沉降至孔板底部。用湿润的无尘纸小心擦拭孔板底部，去除会干扰成像的纤维和/或碎屑。
    注意1：离心处理可最大程度确保所有细胞被捕获在图像中。通常情况下，死亡细胞会脱落并漂浮，导致细胞毒性结果出现误导性偏差。离心可减轻这一影响。
    注意2：离心后应尽快对培养板进行成像，最好在15分钟内完成。离心可能降低碘化丙啶（PI）染色的选择性，导致细胞缓慢积累碘化丙啶。尽管PI染色略有增加，但通过观察死细胞所获得的准确性提升更为重要。建议在离心后1小时内完成成像。

3. 细胞毒性检测：数据采集

  1. 将自动显微镜/多孔板成像仪的软件设置为同时检测Hoechst 33342（激发波长最大值350 nm，发射波长最大值461 nm）和PI（激发波长最大值493 nm，发射波长最大值636 nm）的荧光信号。对每个孔的两个通道分别采集图像。
  2. 使用软件（如基于MatLab的免费图像分析平台CellProfiler，http://cellprofiler.org/；ImageJ；或Gen5等商业软件）在每个通道中对每孔的细胞进行计数。
    注意：由于每个细胞都应被Hoechst 33342染色，而死细胞应被PI染色，因此死细胞数与总细胞数的比值代表死细胞所占的比例。例如，在未处理样本中，自动计数结果显示有467个细胞被PI染色（死细胞），2335个细胞被Hoechst 33342染色（总细胞），则死细胞比例为0.2或20%。该数值随后与经过相同处理但使用了干预措施的样本进行比较。
  3. 使用 Cytation5 细胞成像多模式读板机和 Gen5 v. 3.00 软件进行 Hoechst/PI 数据采集的详细说明：
    1. 将Cytation5多功能酶标仪/成像仪设置为对平底、96孔通用黑色塑料板中的细胞进行成像。
    2. 设置成像方案，使用标准的 DAPI 和 Texas Red 滤光片组。采用 4 倍物镜在孔板中心位置采集图像。不使用偏移（X/Y 或 Z 方向）。成像参数如下：DAPI — LED 强度设为 10，积分时间设为 99，增益设为 0；Texas Red — LED 强度设为 8，积分时间设为 950，增益设为 18。使用 DAPI 信号进行自动对焦；各通道间应无对焦偏移。
    3. 使用 Gen5 软件 v 3.00 进行图像分析。在软件设置中，将细胞定义为面积介于 5 和 25 µm 在大小上进行筛选。通过启用“分离接触物体”的特殊选项，排除主要的边缘物体并分离接触的物体。接下来，处理图像以去除背景（暗背景减除），并应用细胞核掩膜（DAPI 阈值） >= 6000 AU），并计数对象。根据PI染色进行亚群分析（阈值为Texas Red） >= 5000 AU），并计数物体。细胞活力百分比定义为 (1 - 显微分析中信号定量的荧光比值计算公式，Texas Red/DAPI。.

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结果

上述方案使用OCI-AML2细胞建立，该细胞系被作为急性髓系白血病的代表性细胞系。急性髓系白血病（AML）的特征是骨髓中未分化且无功能的造血细胞异常增殖26。尽管近年来AML的靶向治疗取得了一定进展，但其标准治疗方案数十年来基本未变，主要包括诱导治疗（通常为3天的蒽环类药物，如柔红霉素、伊达比星或蒽醌类药物米托蒽醌，联合7天的阿糖胞苷）和巩固治疗（通常为多轮阿糖胞苷治疗后接恢复期）36。

按照图1A中所述方案，将OCI-AML2细胞接种于96孔板中，并用线粒体解偶联剂羰基氰化物m-氯苯腙（CCCP）或糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）在一系列浓度下进行处理。细胞在无血清RPMI-1640培养基中于37 °C处理24小时，随后通过台盼蓝（TB）排斥法或四种细胞活力检测方法之一（Hoechst/PI核染色区分法、LDH释放实验、MTT法或alamarBlue法）评估细胞活力。Hoechst/PI染色细胞的...

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讨论

尽管Hoechst/PI细胞毒性检测方案较为稳健且所需操作时间相对较短，但实验中有若干细节对于确保结果的准确性至关重要。首先，必须确保DMSO的浓度保持在0.5%（v/v）以下。普遍认为，即使低浓度的DMSO暴露也可能显著改变细胞形态和贴壁状态，并明显延缓细胞周期进程39,40。

其次，处理后应尽快进行染色。由于该步骤中没有洗涤过程，化合物会残留在孔板中，并可能持续对细胞造成损伤。与先前的方案35相比，细胞仅染色15分钟，这限制了活细胞被碘化丙啶意外染色的可能性。因此，如果处理的孔板超过两块，我们建议错开处理和染色时间。这样可以在不同孔板之间留出成像时间，提高实验的可重复性。

第三，合适的染料浓度取决于细胞类型。应通过实验确定碘化丙啶的最佳浓度，起始时使用未经处理的细胞，并以台盼蓝染色作为正交对照。

最后，可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

NVK 是癌症研究领域的 CPRIT 学者，感谢德克萨斯州癌症预防与研究所（CPRIT）的大力支持，资助编号为 RR150044。本工作还得到了威尔奇基金会研究资助 C-1930 以及美国国立卫生研究院授予 NVK 的 R35 GM129294 项目的资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-脱氧-D-葡萄糖/2-DGChem-Impex50-519-067
3-溴丙酮酸Alfa Aesar1113-59-3
96孔板Greiner Bio-One655090黑色或透明平底96孔板
Alamar blue HS细胞活力检测试剂（100 mL） Thermo FisherA50101
Countess II全自动细胞计数仪Thermo Fisher
Cytation 5细胞成像多功能微孔板检测仪BioTek
Hoechst 33342Thermo Fisher6224920 mM溶液；终浓度1:1,000
HyClone胎牛血清GE Healthcare#25-514
m-氯苯腙/CCCPSigma AldrichC2759
PBS片剂Thermo FisherBP29441001片 + 200 mL无菌水 = 1× PBS溶液
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100×）Gibco10378016
Pierce LDH检测试剂盒Thermo Fisher50-103-5952
碘化丙啶Thermo Fisher50-596-072干粉；储存液1 mg/mL（溶于PBS）；终浓度5 µg/mL（白血病细胞），1 µg/mL（正常外周血单个核细胞）
鱼藤酮Ark PharmAK115691
RPMI-1640培养基
含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养		Sigma AldrichR8758-500ML
噻唑蓝四氮唑溴盐ACROS OrganicsAC158990010
台盼蓝染液（0.4%）Gibco15250-061
细胞系
K562ATCCCCL-243慢性髓系白血病细胞系
MOLM-13ATCC急性髓系白血病细胞系
MOLT-4ATCCCRL-1582急性淋巴细胞白血病细胞系
OCI-AML2ATCC急性髓系白血病细胞系

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