一种用于准确测定线粒体毒剂细胞毒性的自动化差异核染色检测法

摘要

本方案描述了一种快速、高通量、可靠、经济且无偏倚的检测方法，可高效测定细胞活力。当细胞线粒体受损而干扰其他检测方法时，该方法尤为适用。该检测利用两种细胞核染料——Hoechst 33342 和碘化丙啶——对细胞进行染色，并通过自动计数实现分析。

摘要

线粒体在肿瘤发生转化中的作用是当前广受关注且活跃研究的课题。随着癌症代谢领域的日益复杂，利用多种可导致线粒体损伤的化合物（即所谓的“线粒体靶向抗癌剂”，mitocans）来靶向线粒体的策略正变得越来越流行。然而，许多现有的细胞毒性检测方法（例如基于四唑盐或刃天青的检测）依赖于线粒体酶的正常功能才能发挥作用。而靶向线粒体的化合物所造成的损伤常常会影响这些检测方法的准确性。本文介绍了一种改进的实验方案，该方案基于两种荧光染料的差异性染色：其中一种可穿透细胞膜（Hoechst 33342），另一种则不能（碘化丙啶，propidium iodide）。通过染色差异可有效区分活细胞与死细胞。该检测方法适用于自动化显微镜成像和图像分析，从而提高通量并减少人为偏差。此外，该方法可在96孔板中以高通量方式运行，因此特别适用于具有一定程度线粒体毒性的药物筛选工作。重要的是，与其它方法相比，Hoechst/PI染色法所得结果在台盼蓝排斥实验结果之间以及生物学重复之间均表现出更高的重复性和一致性。

引言

识别有效癌症治疗方法的第一步是选择一种稳健且无偏倚的细胞毒性检测方法，用于评估治疗效果。对于低通量实验，常用的方法是台盼蓝染料排斥法。该方法的优势在于能够相对无偏倚地定量细胞存活率。台盼蓝可被动扩散进入细胞膜受损的细胞，但无法进入健康细胞，因而被有效阻隔在外¹活细胞数与总细胞数的比值代表细胞存活率，用以反映处理方法的有效性。台盼蓝染色法最主要的缺点是不适用于高通量研究方法。该方法信噪比较低，且长时间染色可能导致活细胞被染色，从而产生假象。因此，台盼蓝排染法通常但并非总是²，只能依赖人工计数。这使其过于缓慢且引入了人为误差 由于研究者的主观判断可能导致较高的偏倚风险（除非采用盲法或独立计数，但这会进一步降低实验室通量）。总体而言，该检测方法的通量不足以满足现代药物发现的需求。

活力检测方法通常具有更高的通量，可使研究人员规避这一限制，但也存在显著的局限性（见 表1）。这些方法通常分为两类。其中一类为基于细胞氧化还原酶功能的比色法检测。无色或非荧光性的底物被转化为显色产物，可通过分光光度计进行定量。经典示例包括四唑盐类（MTT、WST-1、XTT等）和刃天青。该类别还包括利用荧光素检测ATP水平的发光法检测。此类检测方法的根本局限在于其测量的是细胞代谢活性，而非严格意义上的细胞活力。per se。在不利条件下，细胞....

方案

1. 细胞毒性实验：准备

1. 将目标化合物在适当的培养基（无血清或含1%、2.5%或5% FBS的RPMI-1640）中配制成所需浓度的溶液。
   1. 若需测定单一化合物的细胞毒性（例如确定有效剂量），应将化合物配制成最终浓度的2倍。
   2. 若需测定化合物组合的细胞毒性，应将化合物配制成最终浓度的4倍。
   3. 通过将相同体积的溶剂与相应培养基混合，制备仅含溶剂的对照组。例如，若待测化合物分别溶解于DMSO和甲醇中，则需分别为每种溶剂制备仅含该溶剂的对照组。
2. 将细胞从培养皿或培养瓶中收集至15 mL圆锥形离心管中。
3. 取10 µL细胞悬液转移至微量离心管中，加入10 µL 0.4%台盼蓝染液。使用血细胞计数板对每种来源的细胞分别计数活细胞与死细胞数量。
4. 在200 g 条件下离心5分钟使细胞沉淀，随后吸除或倾倒上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于适合检测的培养基（无血清或含1%、2.5%、5% FBS的RPMI-1640）中，调整细胞密度至3×10⁵ 个细胞/mL。
   注1：细胞密度为3×10⁵ 个细胞/mL时，可实现每孔15,000个细胞的接种密度。接种密度是一个重要参数，理想情况下应在实验前预先确定。确定接种密度时应考虑以下因素：1）细胞大小——通常较大的细胞以较低密度接种；2）处理时间——处理时间较....

结果

上述方案使用OCI-AML2细胞建立，该细胞系被作为急性髓系白血病的代表性细胞系。急性髓系白血病（AML）的特征是骨髓中未分化且无功能的造血细胞异常增殖²⁶。尽管近年来AML的靶向治疗取得了一定进展，但其标准治疗方案数十年来基本未变，主要包括诱导治疗（通常为3天的蒽环类药物，如柔红霉素、伊达比星或蒽醌类药物米托蒽醌，联合7天的阿糖胞苷）和巩固治疗（通常为多轮阿糖胞苷治疗后接恢复期）³⁶。

按照图1A中所述方案，将OCI-AML2细胞接种于96孔板中，并用线粒体解偶联剂羰基氰化物m-氯苯腙（CCCP）或糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）在一系列浓度下进行处理。细胞在无血清RPMI-1640培养基中于37 °C处理24小时，随后通过台盼蓝（TB）排斥法或四种细胞活力检测方法之一（Hoechst/PI核染色区分法、LDH释放实验、MTT法或alamarBlue法）评估细胞活力。Hoechst/PI染色细胞的.......

讨论

尽管Hoechst/PI细胞毒性检测方案较为稳健且所需操作时间相对较短，但实验中有若干细节对于确保结果的准确性至关重要。首先，必须确保DMSO的浓度保持在0.5%（v/v）以下。普遍认为，即使低浓度的DMSO暴露也可能显著改变细胞形态和贴壁状态，并明显延缓细胞周期进程^39,40。

其次，处理后应尽快进行染色。由于该步骤中没有洗涤过程，化合物会残留在孔板中，并可能持续对细胞造成损伤。与先前的方案³⁵相比，细胞仅染色15分钟，这限制了活细胞被碘化丙啶意外染色的可能性。因此，如果处理的孔板超过两块，我们建议错开处理和染色时间。这样可以在不同孔板之间留出成像时间，提高实验的可重复性。

第三，合适的染料浓度取决于细胞类型。应通过实验确定碘化丙啶的最佳浓度，起始时使用未经处理的细胞，并以台盼蓝染色作为正交对照。

最后，可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-脱氧-D-葡萄糖/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-溴丙酮酸	Alfa Aesar	1113-59-3
96孔板	Greiner Bio-One	655090	黑色或透明平底96孔板
Alamar blue HS细胞活力检测试剂（100 mL）	Thermo Fisher	A50101
Countess II全自动细胞计数仪	Thermo Fisher
Cytation 5细胞成像多功能微孔板检测仪	BioTek
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249	20 mM溶液；终浓度1:1,000
HyClone胎牛血清	GE Healthcare	#25-514
m-氯苯腙/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS片剂	Thermo Fisher	BP2944100	1片 + 200 mL无菌水 = 1× PBS溶液
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100×）	Gibco	10378016
Pierce LDH检测试剂盒	Thermo Fisher	50-103-5952
碘化丙啶	Thermo Fisher	50-596-072	干粉；储存液1 mg/mL（溶于PBS）；终浓度5 µg/mL（白血病细胞），1 µg/mL（正常外周血单个核细胞）
鱼藤酮	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640培养基 含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养	Sigma Aldrich	R8758-500ML
噻唑蓝四氮唑溴盐	ACROS Organics	AC158990010
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
细胞系
K562	ATCC	CCL-243	慢性髓系白血病细胞系
MOLM-13	ATCC		急性髓系白血病细胞系
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	急性淋巴细胞白血病细胞系
OCI-AML2	ATCC		急性髓系白血病细胞系