活细胞热应激下核内肌动蛋白杆状结构的成像 果蝇 胚胎

摘要

本实验方案的目的是将罗丹明标记的球状肌动蛋白注射到Drosophila胚胎中，并在热应激后观察细胞核内肌动蛋白棒状结构的组装过程。

摘要

本实验方案的目的是观察活细胞内形成的核内肌动蛋白束 黑腹果蝇 热激后的胚胎。肌动蛋白棒状结构是保守的、可诱导的肌动蛋白应激反应（Actin Stress Response, ASR）的标志性特征，该反应与包括神经退行性疾病在内的多种人类病理状态相关。此前，我们已证明ASR会导致发育中胚胎的形态发生失败和存活率降低。本实验方案使得在一种非常适合成像、遗传学和生物化学研究的模式系统中，持续深入研究肌动蛋白棒状结构组装及ASR的潜在机制成为可能。胚胎被收集后固定在盖玻片上，以准备显微注射。使用罗丹明标记的球状肌动蛋白（G-actin）^红色) 被稀释后加载至微针中，对每个胚胎的中心进行单次注射。注射后，将胚胎在较高温度下孵育，随后通过共聚焦显微镜观察细胞核内的肌动蛋白束。可对肌动蛋白束进行光漂白后荧光恢复（FRAP）实验；细胞质中其他富含肌动蛋白的结构也可被成像。我们发现，G-肌动蛋白^红色 像内源性G-actin一样发生聚合，且本身不会干扰正常胚胎发育。该方案的一个局限性在于注射过程中需格外小心，以避免对胚胎造成严重损伤。然而，经过练习后，注射G-actin^红色 进入 黑腹果蝇 胚胎是可视化肌动蛋白杆状结构的一种快速可靠的方法，可轻松用于任何基因型的果蝇，也可结合缺氧和氧化应激等其他细胞应激条件使用。

引言

本方案描述了如何注射G-actin^Red以可视化热应激胚胎中核内肌动蛋白棒状结构的组装过程，这些胚胎正处于可诱导的肌动蛋白应激反应（ASR）¹。我们开发该方案旨在促进对ASR的研究，因为在胚胎中，ASR会导致形态发生紊乱和存活率降低；而在成人的人类细胞类型中，ASR则与多种病理状态相关，包括肾功能衰竭²、肌肉肌病³以及阿尔茨海默病和亨廷顿病^4,5,6,7,8。ASR可由多种细胞应激诱导，包括热休克^9,10,11、氧化应激^4,6、ATP合成减少¹²以及异常亨廷顿蛋白或β-淀粉样蛋白寡聚化

方案

1. 准备胚胎收集杯和苹果汁琼脂平板

1. 在注射实验前五天，构建²⁸或准备至少两个小型 胚胎收集杯。制备新鲜的60 mm苹果汁琼脂平板，用于与小型收集杯配合使用²⁸。将平板置于塑料盒中，并用湿润的纸巾覆盖，于4 °C保存。
   注意：使用如步骤1.3所述数量的果蝇填充的小型胚胎收集杯，可为每次实验提供足够的胚胎数量，同时确保胚胎处理和注射能在足够短的时间内完成，以便对早期发育阶段进行成像。
2. 将苹果汁平板预热至18 °C，并在平板中央添加少量酵母糊。酵母糊由活性酵母与蒸馏水简单混合而成。
3. 为促进最大程度的产卵，应在实验前两天设置装有果蝇的收集杯。每个收集杯中加入至少100只雌蝇和50只雄蝇，并加盖一个预先准备好的苹果汁平板（图1，步骤1）。在注射实验前的每一天，至少更换两次苹果汁平板，分别在早晨和傍晚各一次。
   注意：当胚胎收集杯在18 °C环境下保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件时，可获得最佳的注射和成像效果。

2. 为显微注射制备G-actin^Red 的工作液

注意：此步骤仅制备 2 μL 浓度为 5 m....

结果

胚胎操作的示意图见图1，典型实验的时间安排见表1。对良好实验结果的预估是：每注射10个胚胎，至少有一半被观察的胚胎处于正确的发育阶段、无损伤，并在32 °C热应激条件下表现出强烈的ASR反应。这种ASR反应的特征是细胞核内肌动蛋白棒状结构的形成，如图2A（右图）中胚胎代表性表面图像所示。肌动蛋白棒可在细胞核内以多种方向（平行或垂直于成像平面）存在，并可通过多个焦平面进行成像。相比之下，在18 °C孵育的对照组胚胎则不会出现肌动蛋白棒（Figure 2A，左图）。含有棒状结构的细胞核百分比可进行量化分析，如图2B所示。此外，还可对肌动蛋白棒进行FRAP实验（图2C）。关于FRAP数据的一种推荐量化方法参见文献¹，图2D

讨论

该方法的意义在于，它利用了在果蝇（Drosophila）胚胎中已建立完善的显微注射技术^{21,22,23,24,25,26,27}，从而推动关于ASR及其伴随的肌动蛋白杆状结构组装的新研究。将G-actin^Red注射入活体胚胎的主要优势在于，可以在多种不同条件下研究ASR。在后续研究中，这些条件可包括向其他基因型的胚胎注射以进行突变体筛选，或将已注射的胚胎暴露于不同的应激环境（如氧化应激）^4,32。尽管此处未详细描述，该注射技.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三磷酸腺苷（ATP）	Millipore-Sigma	A23835G	G缓冲液组分
苹果汁，Mott's，64液盎司	Mott's	014800000344	苹果汁培养基板组分
Bacto琼脂	BD	214010	苹果汁培养基板组分
漂白剂，PureBright杀菌型，6.0%次氯酸钠	KIK International	059647210020	用于胚胎去壳
氯化钙	Millipore-Sigma	C1016500G	G缓冲液组分
细胞筛网，70 μm	Falcon	352350	用于收集去壳胚胎
共聚焦显微镜，LSM 880 34通道带Airyscan	Zeiss	0000001994956	用于成像核内肌动蛋白棒状结构
干燥剂	Drierite	24001	用于胚胎干燥处理
解剖显微镜，Stemi 508体视显微镜，8:1变焦	Zeiss	4350649000000	用于在琼脂楔上排列胚胎
解剖针，5英寸	Fisher Scientific	08965A	用于在琼脂楔上排列胚胎
二硫苏糖醇（DTT）	Fisher Scientific	BP1725	G缓冲液组分
双面胶带，Scotch永久型，0.5英寸×250英寸	3M	021200010323	用于制备胚胎胶
胚胎收集笼	Genessee Scientific	59100	用于饲养成虫果蝇并收集胚胎
精细镊子，Dumont镊子，5号型号	Electron Microscopy Sciences	72701D	用于在琼脂楔上排列胚胎
玻璃毛细管，硼硅酸盐玻璃，细型1 mm × 0.75 mm	World Precision Instruments, Inc.	TW1004	用于制作显微注射针
卤代烃油27	Millipore-Sigma	H8773100ML	用于胚胎保湿
加热载物台培养箱	Zeiss	4118579020000, 4118609020000, 4118609010000	用于共聚焦成像
实验室擦拭纸，KimWipes	Kimberly-Clark	34155	实验室擦拭纸
倒置显微镜，Invertoskop 40C倒置相差显微镜，翻新	Zeiss	已停产	注射用显微镜
对羟基苯甲酸甲酯	Millipore-Sigma	H36471KG	苹果汁培养基板组分
显微注射仪，FemtoJet4x	Eppendorf	5253000025	显微注射仪
微量加样枪头，epT.I.P.S. 20 μL	Eppendorf	5242956003	用于向显微注射针中加样
显微操作仪及带x、y、z调节旋钮的注射载物台	Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)	定制	用于进行显微注射
微电极拉制仪，P-97型，Flaming/Brown	Sutter Instruments	P97	用于拉制毛细管以制作显微注射针
显微镜盖玻片 24×50-1.5	Fisher Scientific	12544E	用于固定胚胎
显微镜载玻片，Lilac Colorfrost，预清洁，25 × 75 × 1 mm	Fisher Scientific	22037081	用于注射前固定胚胎
正庚烷（n-Heptane）	Fisher Scientific	H3601	胚胎胶组分
物镜，10倍	Zeiss	已停产	注射显微镜用10倍物镜
物镜，C-Apochromat 40x/1.2 W Korr. FCS	Zeiss	4217679971711	共聚焦用40倍水镜
物镜，LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27，适用于油、水、硅油或甘油浸没（D=0-0.17mm）（WD=0.57mm，当D=0.17mm时）	Zeiss	4208529871000	共聚焦用25倍混合浸没物镜
物镜，Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA	Zeiss	4207829900799	共聚焦用63倍油镜
画笔，Robert Simmons Expression E85尖头圆头2号	Daler-Rowney	038372016954	用于转移胚胎
纸巾，Kleenex C型折叠纸巾，白色	Kimberly-Clark	884266344845	用于吸干细胞筛网
巴斯德吸管，5又3/4英寸	Fisher Scientific	1367820A	用于覆盖胚胎的油层
培养皿，玻璃，100 × 20 mm	Corning	3160102	用作保湿培养室
培养皿，塑料，60 × 15 mm	VWR	25384092	用于苹果汁培养基板
移液器，Eppendorf Reference 0.5–10 μL	Eppendorf	2231000604	用于向显微注射针中加样
移液枪头，xTIP4 250 μL	Biotix	63300006	用于向盖玻片添加胚胎胶
剃须刀片	VWR	55411050	用于切割琼脂楔、胶带和移液枪头
罗丹明标记的球状肌动蛋白，人血小板来源（非肌肉型；4×10 μg）	Cytoskeleton, Inc.	APHR-A	G-actin^Red
闪烁瓶，20 mL 硼硅酸盐玻璃瓶，带聚乙烯衬垫和脲盖	Fisher Scientific	033377	用于制备胚胎胶
螺口瓶，16盎司	Nalgene	000194414195	用于胚胎干燥处理
载物台测微尺	Electron Microscopy Sciences	602104PG	用于校准G-肌动蛋白注射体积
蔗糖	Millipore-Sigma	840971KG	苹果汁培养基板组分
Trizma碱	Millipore-Sigma	T15031KG	G缓冲液组分
酵母，Lesaffre酵母公司，Red Star活性干酵母，32盎司	Lesaffre Yeast Corporation	117929157002	酵母糊组分