本文介绍了一种化学成分明确的人肾足细胞高效（>90%）分化方案，该方案由诱导性多能干细胞衍生而来，无需基因操作或亚群筛选。本方案可在26天内获得目标细胞类型，适用于肾毒性检测和疾病模型研究。
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摘要
摘要
肾脏疾病影响着全球超过10%的人口，并造成数十亿美元的联邦支出。最严重的肾脏疾病形式以及最终的终末期肾功能衰竭，通常是由肾小球足细胞损伤引起的。足细胞是一类高度特化的上皮细胞，与内皮细胞和肾小球基底膜共同作用，形成肾脏的滤过屏障。由于原代组织来源有限，以及缺乏高效生成功能性人类肾细胞（如足细胞）的可靠方法，肾脏医学的发展受到严重阻碍。若能从可再生来源（如干细胞）获得足细胞，将有助于深入理解人类肾脏发育和疾病的机制，并为新疗法的发现提供重要工具。本实验方案的目标是建立一种高效、特异且在化学成分明确条件下，从人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）分化出成熟、终末分化（非增殖性）足细胞的方法。该方法所获得的hiPS细胞来源足细胞表达谱系特异性标志物（包括nephrin、podocin和Wilm’s Tumor 1），并呈现出成熟功能性足细胞所特有的形态学特征（如初级和次级足突结构）。值得注意的是，目前研究领域广泛使用的永生化足细胞系中明显缺乏这些特化结构，这表明本方案所生成的人类肾足细胞在发育成熟度上显著高于现有常用的足细胞系，更接近体内成熟表型。
引言
人类多能干细胞培养技术的进步有望彻底改变再生医学、疾病建模和药物筛选领域，因为它为研究人员提供了一种可再生且可扩展的生物材料来源，可通过工程化手段获得人体内几乎所有类型的细胞1。该策略在获取原本难以获得的特化且具有功能的细胞类型方面尤为有用。由于人类诱导性多能干细胞（hiPS细胞）2,3,4,5来源于体细胞，并在个体化医学方面具有巨大潜力，因而备受关注。然而，开发从hiPS细胞分化获得其他细胞谱系的方法仍面临挑战，主要原因在于常使用定义不明确的培养条件，导致效率低下并产生非特异性的异质细胞群体6,7。
本文介绍一种在化学成分明确的条件下，高效且特异性地从人诱导多能干细胞（hiPS细胞）分化获得成熟肾小球足细胞的方法。通过综合考虑细胞微环境中多种因素的作用，本研究建立了一种干细胞分化策略，该策略优化了细胞培养基中添加的可溶性因子以及诸如细胞外基质成分或黏附基质等不可溶性因子。鉴于整合素信号通路在足细胞发育与功能中的重要作用，首先检测了细胞表面整合素受体的表达情况。结果表明，β1整合素不仅在hiPS细胞中高表达，在其衍生的中胚层及中间中胚层细胞中亦呈高表达8,9,10。后续实验进一步证实，当与下文所述的可溶性诱导培养基联合使用时，能够与β1整合素结合的配体（包括层粘连蛋白511或层粘连蛋白511-E8片段）可有效支持hiPS细胞向足细胞的黏附与分化。
通过在含有Activin A、CHIR99021和Y27632 ROCK抑制剂的培养基中，将hiPS细胞在层粘连蛋白包被的表面培养两天，首先确认其可分化为表达早期中胚层标志物HAND1、goosecoid和brachyury8,11的细胞，从而启动细胞谱系定向分化。将上述中胚层细胞在添加骨形态发生蛋白7（BMP-7）和CHIR99021的培养基中继续培养14天，可获得表达肾单位前体细胞标志物Wilms肿瘤1（WT1）、odd-skipped相关蛋白1（OSR1）8,11和配对盒基因2蛋白（PAX2）12的中间中胚层细胞。为获得成熟的肾脏肾小球足细胞，将中间中胚层细胞在一种新型培养基中处理4–5天，该培养基包含BMP-7、Activin A、血管内皮生长因子（VEGF）、全-trans维甲酸以及CHIR99021。通过流式细胞术和免疫染色证实，>90%的所得细胞表现出成熟肾脏足细胞的分子、形态和功能特征8,11,13。这些特征包括初级和次级足突结构的形成；足细胞谱系特异性基因的表达，如SYNPO、PODXL、MAF、EFNB28，以及足蛋白（podocin）、nephrin和WT1等蛋白的表达14,15,16。此外，研究发现，利用市售培养基可在体外将hiPS细胞来源的足细胞维持培养长达四周8,11，从而为后续实验的时间安排提供了额外的灵活性。有关用于评估hiPS来源足细胞纯度的流式细胞术检测面板的更多信息，请参阅我们此前发表的文献11。
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方案
1. 试剂的准备
- 将解冻的5倍浓度hiPS细胞培养基（CCM）添加剂与hiPS细胞培养基础培养基混合，稀释成1倍浓度的hiPS CCM溶液。
注意：冷冻的5倍浓度hiPS CCM添加剂需缓慢解冻，建议在4 ˚C下过夜解冻。1倍浓度hiPS CCM可分装后于-20 ˚C保存，最长可达6个月。 - 制备包被基底膜（BM）基质1的培养板用于hiPS细胞培养：将BM基质1在4 ˚C冰上过夜解冻。解冻后，根据生产商建议的稀释比例进行分装。
注意：通常将分装物进一步稀释于25 mL冷的DMEM/F12培养基中，置于50 mL锥形管内，充分混匀以完全溶解BM基质1，避免残留晶体形成。 - 将1 mL BM基质1溶液加入6孔板的每个孔中，于37 ˚C孵育1–2小时，或在4 ˚C包裹保鲜膜孵育至少24小时。包被BM基质1的培养板可在4 ˚C保存最多2周。
- 制备包被基底膜（BM）基质2的培养板：将适量BM基质2加入9 mL无菌蒸馏水中稀释，配制成终浓度为5 µg/mL的溶液。向12孔板的每孔加入700 µL BM基质2溶液，在室温下孵育2小时，或在4 ˚C过夜孵育。
- 分别配制浓度为100 µg/mL的BMP7、Activin A和VEGF储备液：将BMP7用含0.1%（质量/体积）BSA的无菌蒸馏水重悬；分别将Activin A和VEGF用含0.1%（质量/体积）BSA的无菌PBS重悬。为避免反复冻融，将每种储备液分装为100 µL，于-20 ˚C保存，最长可达6个月。
- 将10 mg Y27632溶于3.079 mL无菌蒸馏水中，配制成10 mM的储备液。分装100 µL每管，于-20 ˚C保存，最长可达6个月。
- 将2 mg CHIR99021溶于143.4 µL无菌DMSO中，配制成30 mM的储备液。分装为5 µL每管，于-20 ˚C保存，最长1个月（或根据生产商建议）。
- 将10 mg全-trans维甲酸溶于3.33 mL无菌DMSO中。分装为500 µL每管，于-20 ˚C保存，最长可达6个月。
2. 培养基的制备
- 通过将相应的储备液重新配制，制备中胚层分化培养基，终浓度为100 ng/mL Activin A、3 µM CHIR99021、10 µM Y27632，并加入适量含谷氨酰胺补充剂的DMEM/12培养基中，添加1x B27无血清添加剂。
注意：中胚层分化培养基应在分化步骤前新鲜配制，并根据实验规模配制适当体积（通常，50 mL培养基足以用于两块12孔板）。 - 通过将相应的储备液重新配制，制备中间中胚层分化培养基，终浓度为100 ng/mL BMP7、3 µM CHIR99021，并加入含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12培养基中，添加1x B27无血清添加剂。
注意：如需要，可在培养基中补充1%（体积比）青霉素-链霉素。使用含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12调节培养基体积。该培养基可大量配制；但建议分装为较小体积（例如，每50 mL锥形管中分装45 mL），以避免反复冻融。此培养基可在-20 ˚C保存长达3个月，使用前可在4 ˚C过夜解冻。 - 通过将相应的储备液重新配制，制备足细胞诱导培养基，终浓度为100 ng/mL BMP7、100 ng/mL activin A、50 ng/mL VEGF、3 µM CHIR99021、1x B27无血清添加剂以及0.1 µM全反式维甲酸，溶于含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12培养基中。避光保存培养基（例如，用铝箔纸包裹容器）。
注意：该培养基可大量配制，并在-20 ˚C避光保存长达3个月。冷冻分装样品使用前应在4 ˚C过夜解冻。 - 通过在DMEM/F12培养基中加入10%（体积比）热灭活FBS，配制25 mL胰酶中和溶液，并在无菌条件下过滤。
- 为维持干细胞来源的足细胞在分化后的生长，按照生产商说明书将添加剂加入基础培养基中，配制含足细胞维持添加剂的完全培养基，并在4 ˚C保存最多两周。
3. 使用hiPS细胞培养基进行无饲养层hiPS细胞培养
- 吸去预包被板中 BM 基质 1 的残余溶液，用 1 至 2 mL 温热的 DMEM/F12 洗涤孔板 3 次 。
- 吸去 hiPS 细胞的用后 hiPS CCM，用温热的 DMEM/F12 将细胞洗涤 3 次 。加入 1 mL 温热的细胞解离溶液，在 37 ˚C 下孵育 1 分钟以促进细胞解离。在组织培养显微镜下进行细胞形态观察，确保细胞集落边缘呈圆形，然后迅速吸去细胞解离溶液（确保细胞集落仍附着于培养板上，尽管结合较松）。用 DMEM/F12 轻柔冲洗细胞一次，以去除残留的细胞解离溶液。
- 向经细胞解离溶液处理的 hiPS 细胞（每孔 6 孔板）中加入 3 mL hiPS CCM。使用细胞刮刀刮下细胞集落，并用移液器轻柔吹打细胞悬液，使松散附着的细胞脱落。充分冲洗培养板，确保所有细胞均被收集。
注：建议使用 5 mL 移液器，以避免对细胞造成过度剪切力。 - 将 0.5 mL 细胞悬液转移至新的 BM 基质 1 包被的 6 孔板中，每孔预先加入 2 mL hiPS CCM。以“8”字形方式轻柔晃动培养板，使细胞集落在孔内均匀分布，并在 37 ˚C、5 % CO2 培养箱中孵育。每日更换培养基，直至细胞达到传代或用于分化实验的合适状态（约 70 % 汇合度）。
注：在无饲养层条件下使用 hiPS CCM（不含 ROCK 抑制剂）进行常规传代时，理想的 iPSC 集落大小为 200–500 µm。若在解离酶或缓冲液处理过程中细胞被单细胞化，可在 hiPS CCM 中添加 ROCK 抑制剂（例如 10 µM Y27632）以提高细胞存活率。
4. 将hiPS细胞分化为中胚层细胞（第0-2天）
- 在 hiPS 细胞培养处于指数生长期时（传代后约 4 天内，细胞融合度约 70%），需肉眼观察集落内部及边缘是否存在自发分化的细胞。如有必要，无菌条件下刮除分化区域。
- 吸除 hiPS 细胞的 hiPS CCM 培养基，用预热的 DMEM/F12 培养基清洗细胞 3 次 。加入 1 mL 无酶细胞解离缓冲液，在 37 ˚C 下孵育 10 分钟，并在显微镜下检查细胞解离情况。由于不同 hiPS 细胞系之间存在固有差异，具体细胞解离缓冲液的孵育时间需根据特定细胞系进行优化确定。
- 使用细胞刮轻轻刮取培养孔，使松散贴壁的细胞脱落，将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，随后用移液器反复吹打数次，使 hiPS 细胞充分分散成单细胞悬液。
- 用预热的 DMEM/F12 培养基将细胞悬液补至 15 mL，室温下以 290 x g 离心 5 分钟。
- 小心吸除上清液，用预热的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，再次进行离心，以彻底去除残留的 BM 基质 1 及解离缓冲液成分。
- 吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL 上述所述的中胚层诱导培养基中。使用血细胞计数板或库尔特计数器对细胞进行计数，以确定所需中胚层分化培养基的体积，使细胞浓度达到 1 × 105 个细胞/mL。
- 吸除 BM 基质 2 包被培养板中的 ECM 溶液，用预热的 DMEM/F12 培养基清洗培养板 2 次。通过反复吹打轻柔混匀 hiPS 细胞悬液。将 1 mL 细胞悬液加入每孔 BM 基质 2 包被的 12 孔板中，随后轻轻振荡培养板，使细胞分布更均匀。
- 将培养板置于 37 ˚C、5% CO2 的培养箱中孵育。次日更换中胚层诱导培养基。
注：培养 2 天后，hiPS 细胞来源的中胚层细胞即可用于中间中胚层诱导。
5. 将 hiPS 细胞来源的中胚层细胞分化为中间中胚层（第 2–16 天）
- 在分化方案的第2天，吸除中胚层诱导培养基，并每孔补充1 mL中间中胚层诱导培养基。
- 每天更换培养基，以维持代谢活跃细胞所需的生长因子和小分子的精确浓度阈值。如果细胞生长显著且培养基营养成分消耗迅速（表现为培养基变黄），可将12孔板每孔的中间中胚层分化培养基体积增加至1.3 mL。
- 继续培养细胞额外14天，以获得中间中胚层细胞。至第16天，这些细胞可进行冻存，以备后续使用。
6. 将 hiPS 细胞来源的中间中胚层细胞分化为足细胞（第 16 至 21 天）
- 用预热的 DMEM/F12 洗涤中胚层细胞，随后每孔加入 0.5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，在 37 ˚C 下孵育 3 分钟。进行显微镜观察，确保细胞开始解离。
- 使用细胞刮刀刮取细胞，并用 1,000 µL 移液枪头反复吹打细胞悬液，以获得单个细胞或少量小细胞团。
注意：此步骤需确保细胞完全解离，因为聚集的细胞可能无法在本实验方案规定的时间内获得终末分化表型。 - 每孔加入约 2 mL 胰蛋白酶中和液，以终止胰蛋白酶活性。
- 将细胞转移至 50 mL 锥形管中，用 DMEM/F12 补充体积至 50 mL，然后在室温下以 201 x g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将细胞重悬于足细胞诱导培养基中。为获得最佳效果，确保最终接种密度约为每 12 孔板孔 100,000 个细胞。将细胞悬液加入已包被 BM matrix 2 的培养板中，并轻轻振荡培养板以使细胞分布更均匀。
- 将细胞在 37 ˚C 和 5% CO2 条件下孵育，每天更换培养基，持续最多 5 天，以在第 21 天获得足细胞。
注意：所获得的由 hiPS 细胞分化的足细胞可在完全培养基中加入足细胞维持培养基后继续培养 2–4 周。一旦转入足细胞维持培养基，可每隔一天换液一次，并可用于后续实验或下游分析。
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结果
本实验方案的目的是证明在化学成分明确的条件下，可由人诱导多能干细胞（hiPS细胞）分化获得成熟的人肾小球足细胞。本文所展示的数据使用DU11 hiPS细胞系生成17，该细胞系经检测确认无支原体污染。同时进行了染色体分析，结果显示细胞核型正常。从未分化的DU11 hiPS细胞开始，采用本报告中所述的分化策略（图1），首先将干细胞（图2A）分化为表达Brachyury（T）的中胚层细胞（图1B和图2B），随后进一步分化为PAX2阳性的中间中胚层细胞（图2C），最终生成成熟的肾脏肾小球足细胞（图1B、图2D、图3D和
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讨论
本报告中，我们描述了一种从人诱导多能干细胞（hiPS细胞）生成肾脏肾小球足细胞的实验方案。由hiPS细胞分化而来的足细胞表现出与成熟肾脏足细胞表型相关的形态学和分子特征13。在先前的研究中，我们已证明当hiPS细胞来源的足细胞与肾小球微血管内皮细胞在可灌注的微流控器官芯片装置中进行共培养时，能够模拟肾脏肾小球的结构及其选择性滤过功能8,11。
研究人员若有意采用本方案，应考虑以下关键步骤。首先，将人诱导多能干细胞（hiPS细胞）接种至层粘连蛋白包被的培养板以诱导中胚层细胞，是至关重要的一步。尽管推荐接种密度为每孔100,000个细胞，但研究人员可根据所用干细胞系的增殖速率调整初始接种密度。如有必要，此优化可确保中胚层诱导阶段具有适当的细胞密度，并防止形成细胞聚集体或过大的细胞团块，从而避免影响中胚层、中间中胚层或足细胞表型的质量（图3）。还需注意，某些试剂（如...
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披露
S.M. 是一项关于从多能干细胞生成肾小球足细胞的方法的待批专利的发明人之一（美国专利申请号 14/950859）。其余作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作得到了杜克大学普拉特工程学院、杜克大学医学院肾病科、杜克大学医学院内科系主任研究奖以及伯勒斯威康基金PDEP职业转型项目的资助。 临时 S.M. 获得奖项资助。M.B. 受美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目支持。我们感谢 Bursac 实验室慷慨提供 DU11 干细胞系，以及杜克大学 Varghese 实验室临时与我们团队共享组织培养设施。本出版物献给麻省理工学院化学系诺华教授 Laura L. Kiessling 教授，以庆祝她 60 岁生日th 生日
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞 | |||
| DU11 人iPS细胞 | DU11（杜克大学克隆#11）诱导多能干细胞系由杜克大学iPSC核心实验室构建，并由杜克大学Bursac实验室提供给我们。本实验室已对该细胞系进行支原体检测，并于2019年7月完成最近一次核型分析，结果显示核型正常。 | ||
| <强>生长因子与培养基添加剂 | |||
| 全反式维甲酸（500 mg） | 72262 | 干细胞技术 | |
| B27无血清添加剂 | 17504044 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | 可能存在批间差异 |
| 含 CultureBoost-R 的完全培养基试剂盒 | 4Z0-500-R | 细胞系统 | 足细胞维持培养基 |
| DMEM/F12 | 12634028 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| 含GlutaMAX补充剂的DMEM/F12培养基 | 10565042 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | 含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12培养基 |
| 热灭活胎牛血清 | 10082147 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| 人激活素A | PHC9564 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| 人BMP7 | PHC9544 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| 人血管内皮生长因子 | PHC9394 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| mTeSR1 培养基 | 05850 | 干细胞技术 | hiPS 细胞培养基（CCM） |
| 青霉素–链霉素，液体（100×) | 15140-163 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| Y27632 ROCK抑制剂 | 1254 | Tocris | |
| <强>抗体 | |||
| Alexa Fluor 488– 和 Alexa Fluor 594–偶联的二抗 | A32744；A32754；A-11076；A32790 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | 祖细胞 | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| <强>细胞外基质分子 | |||
| iMatrix-511 层粘连蛋白-E8（LM-E8）片段 | N-892012 | Iwai North America | 基底膜（BM）基质2 |
| 基质胶 hESC 验证级基质，5 mL 瓶装 | 354277 | BD 生物科学 | 基底膜（BM）基质1. 可能存在批间差异 |
| <强>酶及其他试剂 | |||
| Accutase | A1110501 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | 细胞解离溶液 |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO 具有毒性，应在化学安全通风橱中操作 |
| 无酶细胞解离缓冲液，Hank’平衡盐溶液 | 13150016 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| 70%（体积/体积）乙醇溶液，生物技术级 | 97065-058 | VWR | 乙醇易燃且有毒 |
| FBS | 431097 | 康宁 | |
| 多聚甲醛（PFA） | 28906 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | PFA 应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。避免吸入及皮肤接触。 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 14190-250 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| 无菌蒸馏水 | 15230162 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | 25300-120 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 单独包装的吸液管 | 29442-462 | 康宁 | |
| Avanti J-15R 离心机 | B99516 | 贝克曼库尔特 | |
| 15 mL 锥形离心管 | 352097 | 康宁 | |
| 50 mL 锥形离心管 | 352098 | 康宁 | |
| 冻存盒 | 3395465 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | 用于储存冻存分装样本 |
| EVOS M7000 | AMF7000 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | 用于获取固定并染色的iPS细胞及其衍生物图像的荧光显微镜 |
| 血细胞计数板 | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 培养箱 | 51030403 | 赛默飞世尔科技/生命技术公司 | 用于iPS细胞及其衍生物的常规培养与维持 |
| 配备 AxioCam 503 相机的倒置 Zeiss Axio Observer 显微镜 | 491916-0001-000（显微镜）；426558-0000-000（相机） | 卡尔·蔡司显微镜 | 用于获取活体iPS细胞及其在足细胞分化各阶段衍生物的相差图像 |
| Kimberly-Clark 丁腈手套 | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes，大号 | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes，小型 | 21905-026 | VWR | |
| P10 精密屏障式移液器吸头 | P1096-FR | 德内维尔科学公司 | |
| P100 防污染吸头 | P1125 | 德文特科学 | |
| P1000 防污染吸头 | P1126 | 德文特科学 | |
| P20 移液器滤芯吸头 | P1121 | 德文特科学 | |
| P200 阻隔式移液器吸头 | P1122 | 德文特科学公司 | |
| 10 mL 血清移液管，独立包装 | 356551 | 康宁 | |
| 25 mL 血清移液管，单独包装 | 356525 | 康宁 | |
| 5 mL 血清移液管，独立包装 | 356543 | 康宁 | |
| Steriflip，0.22 μ米，聚醚砜 | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| 无菌微量离心管 | 1138W14 | Thomas Scientific | 用于分装生长因子 |
| 组织培养–经处理的12孔板 | 353043 | 康宁 | |
| 组织培养–经处理的六孔板 | 353046 | 康宁 | |
| VWR 白色 Techuni 实验服 | 10141-342 | VWR | |
| 宽斜面细胞刮刀 | 3008 | 康宁 |
参考文献
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