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用于植入物的金属与关节软骨对磨的生物摩擦学测试与分析

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DOI：

10.3791/61304

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2020年5月14日

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1Faculty of Health and Medicine, Department for Health Sciences, Medicine and Research, Center for Regenerative Medicine, Danube University Krems, 2Department of Orthopedics and Traumatology, LK Baden-Mödling-Hainburg, 3AC2T research GmbH

本文内容

摘要

本方案描述了与金属植入材料对磨的骨软骨圆柱体的制备、生物摩擦学测试及分析方法。本方案包含的评估指标有代谢活性、基因表达和组织学分析。

摘要

对于中年患者，局灶性金属植入物可能用于治疗骨软骨缺损。此类植入物最初为膝关节缺损设计，目前已扩展应用于肩关节、髋关节、踝关节以及第一跖趾关节。尽管此类植入物可缓解疼痛并改善临床症状，但在许多患者中仍观察到对侧软骨出现进行性退行性改变。导致此类损伤的具体机制尚不完全清楚。本实验方案描述了一种模拟金属-软骨配对的摩擦学实验方法，并对关节软骨进行系统性分析。实验中采用金属植入材料与牛骨软骨圆柱体配对，以模拟人体关节软骨的反应。通过施加不同的载荷和滑动速度，可模拟生理状态下的力学加载条件。为全面评估对关节软骨的影响，本方案详细介绍了组织学分析、代谢活性检测以及基因表达分析。摩擦学测试的主要优势在于可自由调节加载参数，以模拟体内实际条件。此外，还可使用不同的测试溶液，以研究润滑剂或促炎因子对软骨的影响。通过检测软骨特异性基因及分解代谢相关基因的表达水平，可发现关节软骨细胞在机械载荷作用下早期发生的代谢变化。

引言

骨软骨缺损的治疗具有挑战性，在许多情况下需要手术干预。对于中年患者的局灶性骨软骨病变，局灶性金属植入物是一种可行的选择，尤其是在骨髓刺激（BMS）或自体软骨细胞移植（ACI）等初始治疗失败后1。部分关节表面置换可被视为挽救性手术，能够减轻疼痛并改善关节活动范围2。这些植入物通常由钴铬钼（CoCrMo）合金制成，并提供多种尺寸和偏移构型，以匹配正常的解剖结构3。尽管此类植入物最初是为膝关节股骨内侧髁的缺损设计的，但目前已有适用于髋关节、踝关节、肩关节和肘关节的型号并已投入临床使用4,5,6。为了获得满意的治疗效果，评估关节的力学对线以及对侧软骨的状态至关重要。此外，研究表明，正确植入且不使植入物突出关节面是手术成功的关键因素7。

临床研究显示，对于中年患者，针对不同部位的治疗在短期内均能显著减轻疼痛并改善功能5,6,8。与同种异体移植物植入相比，局灶性金属植入物可实现早期负重。然而，在相当数量的患者中，对侧关节软骨出现加速磨损9,10。因此，即使植入位置正确，原生软骨的退变在许多情况下似乎仍不可避免，而其潜在机制尚不明确。类似退行性改变也见于髋关节双极半髋成形术后11，且随着活动和负荷增加而加重12。

摩擦学实验为在体外研究此类配对以及模拟生理条件下发生的不同载荷情况提供了可能13。使用骨软骨针提供了一种简单的几何模型，可用于研究关节软骨与天然软骨或任何植入材料之间的摩擦学特性14，并可进一步应用于全关节模拟模型中15。与软骨-软骨配对相比，金属-软骨配对表现出更快速的软骨磨损、细胞外基质破坏以及表层区域细胞活力下降16。软骨损伤主要表现为表层与中层之间的分层剥离17。然而，导致软骨退变的机制尚未完全明确。本实验方案提供了对关节软骨生物合成活性的全面分析方法。通过测定代谢活性及分解代谢相关基因的表达水平，可识别出软骨降解的早期征象。体外摩擦学实验的优势在于可调节载荷参数，以模拟多种不同的载荷条件。

因此，以下方案适用于模拟金属-软骨配对，代表一种实验性半关节成形术模型。

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方案

1. 金属圆柱体的制备

  1. 使用扫描电子显微镜（SEM）结合能谱仪（EDS），按照制造商提供的方案对符合外科植入物标准规格的圆柱形钴铬钼（CoCrMo）棒进行化学成分分析，以验证其标称值。
    注：本实验所用CoCrMo合金的元素组成为65% Co、28% Cr、5% Mo和2%其他元素。
  2. 使用碳化硅砂纸对样本进行湿磨，起始粒径为500，随后依次使用粒径递增至4000的砂纸。
  3. 用3号砂纸打磨圆柱体 µ米和1 µ使用研磨膏处理，以达到金属外科植入物（ISO 5832-12:2019）以及全关节和部分关节置换植入物（ISO 21534:2007）表面光洁度要求所规定的表面粗糙度公差范围。
    注：使用共聚焦显微镜测定平均表面粗糙度。
  4. 切割 CoCrMo 棒材Ø 直径为6 mm的圆柱体切割为长度10 mm的圆柱体。

2. 获取骨软骨圆柱

  1. 使用骨骼成熟牛的膝关节（屠宰时年龄为18-24个月），并在屠宰后24小时内保持关节完整并低温保存，直至解剖。
    注意：关节从当地屠夫处购买。在解剖前保持关节闭合状态。
  2. 在无菌条件下采集圆柱形骨软骨组织块时，需对膝关节进行消毒，并行关节切开术，暴露股骨内侧髁。
    注意：解剖过程中应小心操作，避免损伤关节面。
  3. 检查关节面是否存在肉眼可见的损伤。
    注意：若软骨失去正常的乳白色、光滑且有光泽的外观，或出现水疱、裂隙或较大缺损，则弃用该样本。
  4. 将切割套管垂直对准负重区的关节面，用锤子施加稳固冲击力，使装置进入软骨及软骨下骨。当穿透深度达到15 mm时，迅速顺时针旋转装置。
  5. 取出装置，插入白色旋钮并拧紧，直至骨软骨组织块的底端可见。
  6. 使用无菌记号笔标记样本的前后方向，以便在测试过程中正确安置骨软骨圆柱体。
    注意：关节软骨独特的力学性能依赖于其三维胶原网络及其复杂结构，在样本定向时应予以考虑。
  7. 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样本，以去除血液和脂肪组织。
  8. 重复上述步骤，采集所需数量的骨软骨组织块（直径8 mm，长度15 mm）。
    注意：通常可从股骨内侧髁负重区获取9至12个骨软骨圆柱体。
  9. 将样本置于含10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）中，添加抗生素（青霉素200 U/mL；链霉素0.2 mg/mL）和两性霉素B 2.5 µg/mL，并在4 °C下保存至测试前，以维持细胞活性。
  10. 在采集后立即分析对照组骨软骨组织块，以建立基线值（见分析部分）。

3. 摩擦学测试

  1. 使用市售的往复式摩擦计，采用圆柱体-平板构型进行实验。设备需具备垂直加载功能，并可调节载荷和滑动速度。此外，液体池可使实验在润滑液中进行。
  2. 利用压力测量膜测定CoCrMo-软骨系统中的接触压力。将压力测量膜置于界面处，施加30秒静态载荷，以确定初始接触压力、接触面积和形状。由于金属圆柱体和关节软骨均呈凸面，该构型下的初始接触区域呈椭圆形。
    注意：压力测量膜在达到或超过阈值压力的区域会显示红色变色。在1 N载荷下，通过与已知接触压力进行视觉比对，测得接触压力约为2 MPa。
  3. 将骨软骨圆柱体固定在底部样品夹具上，标记方向与滑动方向对齐，并将CoCrMo圆柱体安装至上方的载荷传感器上。
  4. 将测试溶液（含3 g/L透明质酸的PBS）加入液体池中，使骨软骨圆柱体完全浸没，并覆盖金属-软骨滑动界面。
  5. 设定测试参数（规定的法向力、行程和滑动速度），并在整个测试过程中保持这些参数不变。
    注意：往复运动的行程长度应根据接触面积设定，以形成迁移接触区域（MCA）。对于直径为8 mm的样品，2 mm的行程可为软骨提供充分的再水化。
  6. 启动CoCrMo圆柱体在润滑液中与关节软骨之间的往复滑动，使用预设的加载参数进行实验。
  7. 在实验过程中监测摩擦系数（COF）。
    注意：摩擦系数可由仪器自动测定，也可通过公式μ=F/W计算（μ—摩擦系数；F—摩擦力；W—系统施加的法向载荷）。
  8. 在预定的测试时间结束后终止实验。
  9. 从样品夹具中取出骨软骨样品，用PBS冲洗后置于培养基中保存，待进行后续生物学分析（见下文）。
  10. 将对照样品在室温下浸入测试溶液中，持续时间与机械加载样品相同，并与受机械载荷作用的样品一同进行分析。

4. 分析

注意：通过分析骨软骨圆柱的代谢活性和基因表达来研究其生物学活性；通过组织学检查来研究软骨表面完整性和其下基质结构。

  1. 组织学
    1. 用于组织学分析时，将骨软骨塞浸入4%缓冲甲醛溶液中，在室温下保存直至进一步处理。
    2. 用PBS冲洗样品，并将其放入塑料容器中。
    3. 加入过量的即用型脱钙液，确保所有样品均被覆盖。
    4. 持续振荡4周，以实现完全脱钙。
    5. 脱钙后，将样品包埋于水溶性乙二醇和树脂中，并在−80 °C下保存。
    6. 通过冷冻切片横向切取接触区域，获得6 µm厚的切片。
    7. 随后，按照制造商提供的方案对样品进行Safranin O染色及Fastgreen复染。
    8. 使用显微镜采集组织学图像，并利用图像处理软件进行处理。
  2. 代谢活性
    注意：采用基于XTT的离体毒理学检测法评估关节软骨中软骨细胞的代谢活性。
    1. 用PBS冲洗骨软骨塞，并将样品置于培养皿中。
    2. 将24孔板放在天平上并归零。
    3. 用手术刀将骨软骨移植物上的软骨完整切下。
    4. 将软骨均分为两部分，使接触区域均匀分布于两块软骨上；将其中一半切碎为1 mm³大小的组织块。另一半用于基因表达分析。
    5. 将切碎的软骨转移至已准备好的24孔板的一个孔中，并测定组织重量。
    6. 对每个样品重复上述步骤，并向每孔加入1 mL生长培养基。
    7. 根据制造商说明加入XTT溶液（490 µL XTT标记试剂和10 µL活化试剂），混匀。
    8. 在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。
    9. 孵育结束后，移除上清液并转移至5 mL离心管中。
    10. 向24孔板中的软骨组织加入0.5 mL二甲基亚砜（DMSO），室温下持续振荡1小时，以提取四唑盐产物。
    11. 移除DMSO溶液，并与先前收集的XTT溶液合并。
    12. 取100 µL样品，每样本设三个复孔，加入96孔板中，在酶标仪上测定492 nm波长处的吸光度，参考波长为690 nm。
    13. 将所得吸光度值归一化至各样品湿重，并使用软件进行分析。
  3. 基因表达分析
    1. RNA提取
      注意：RNA提取使用商用试剂盒（材料表）进行，操作步骤依据制造商说明书稍作修改。
      1. 将从骨软骨塞获取的另一半软骨组织切碎成小块。
      2. 转移至含有陶瓷珠和300 µL裂解缓冲液（含1% β-巯基乙醇）的离心管中。
        注意：样品可在液氮中冷冻保存，待后续处理。
      3. 室温解冻2分钟，使用商用组织破碎仪对组织进行均质化处理。以6500 rpm处理20秒（均质步骤），重复四次，每次运行后在4 °C冷却2分钟（使用商用破碎仪冷却装置），以充分破坏组织结构。
      4. 向每管中加入20 µL蛋白酶K和580 µL无RNase水，55 °C孵育30分钟。
      5. 将样品以10,000 x g离心3分钟，转移上清液至1.5 mL离心管中。
      6. 向每管中加入0.5体积的90%乙醇，混匀。
      7. 取700 µL样品加入置于2 mL收集管中的RNA结合柱中，8,000 x g离心15秒。
      8. 弃去穿流液，对剩余裂解液重复离心步骤。
      9. 向柱中加入350 µL RW1缓冲液，8,000 x g离心15秒，弃去穿流液。
      10. 将10 µL DNase储备液与70 µL RDD缓冲液混合，加入RNA纯化膜中，室温孵育15分钟。
      11. 向柱中加入350 µL RW1缓冲液，8,000 x g离心15秒，弃去穿流液。
      12. 向柱中加入500 µL RPE缓冲液，8,000 x g离心15秒，弃去穿流液。
      13. 向RNA纯化柱中加入500 µL RPE缓冲液，8,000 x g离心2分钟。
      14. 将柱置于1.5 mL收集管中，加入30 µL无RNase水，8,000 x g离心1分钟。
      15. 将提取的RNA在-80 °C保存，直至进行cDNA合成。
    2. cDNA合成
      注意：为从信使RNA（mRNA）合成互补DNA（cDNA），使用了商用试剂盒（材料表）。添加噬菌体MS2的RNA以在cDNA合成过程中稳定提取的RNA。
      1. 解冻并混匀试剂。单次反应的组分如表1所示。
      2. 向单次反应体系（14 µL）中加入16 µL RNA样品。
      3. 在热循环仪中进行cDNA合成，程序如下：25 °C孵育10分钟（引物退火），50 °C孵育60分钟（DNA合成），85 °C孵育5分钟（变性），20 °C孵育5分钟（冷却）。
      4. cDNA在-20 °C保存，直至进行实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）。
    3. RT-qPCR
      注意：针对牛源样品的RT-qPCR，使用商用实时定量PCR软件（如IDT）设计GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、COL2A1（II型胶原）、ACAN（聚集蛋白聚糖）、COL1A1（I型胶原）、MMP-1（基质金属蛋白酶-1）和MMP-13（基质金属蛋白酶-13）基因的引物和探针。牛源引物和双淬灭探针由IDT提供。单次反应所用试剂及其用于评估扩增效率和基因表达的情况见表2。
      1. 向96孔PCR板的每个孔中加入单次反应主混合液9 µL，并向每孔加入1 µL cDNA。每个样品设三个复孔。
      2. 用封油密封PCR板，在4 °C、877 x g条件下离心10分钟。
      3. 使用精密热循环仪进行RT-qPCR，程序如下：95 °C预变性10分钟，45个扩增循环（95 °C变性10秒，退火30秒，cDNA合成），最后37 °C延伸30秒。
        注意：不同引物需使用特定的退火温度。
      4. 使用GAPDH与目标基因共同验证扩增效率。
      5. 使用配套软件计算各基因的扩增效率。
      6. 将循环阈值（CT）归一化至参考基因GAPDH的表达水平，并采用ΔΔCT法进行定量分析。

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结果

必须使用压力测量膜确认接触面积和接触压力（图1）。通过与已知接触压力的标准印迹进行比较，可验证生理载荷条件。测试过程中需持续监测摩擦系数。当接触区域发生迁移时，摩擦系数可在至少1小时内保持较低水平（图2）。通过番红O染色可确定细胞外基质的组成与结构（图3）。番红O染色强度与蛋白聚糖含量成正比。快绿用于对非胶原位点进行复染，从而与番红O染色形成清晰对比。蛋白聚糖含量在关节表面各区域间存在差异，但在基线样本的组织切片中应保持均匀分布（图3A）。浸没于测试溶液中的对照样本显示糖胺聚糖（GAGs）发生流失，而机械载荷可抵消该效应（图3B, 3C）。牛关节软骨细胞的代谢活性与取材部位无关，但与无载荷对照组相比，施加机械载荷后其代谢活性升高（图4）。在生理载荷条件下，软骨特异性基因（COL2A1, ACAN）的表达水平上...

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讨论

局灶性金属植入物是骨软骨缺损的一种补救性手术方法，尤其适用于中年患者以及初次治疗失败后的病例。尽管临床研究显示出良好的短期效果，但已观察到的一种并发症是对侧天然软骨的损伤10。尸体和生物力学研究表明，将植入物正确地置于平整或轻度凹陷的位置，可维持正常的接触压力19。摩擦学实验为体外测试多种软骨配对提供了可能。在此类实验中，载荷条件、润滑环境、材料配对及实验持续时间均可根据需要进行调整。

牛软骨在当地屠宰场可大量获得，其细胞密度和分层结构与人类股骨髁极为相似20。然而，蛋白聚糖含量具有部位特异性，而基因表达水平在关节面范围内则显示为均匀分布。在本方案中，骨软骨柱取自承重区域。软骨厚度、胶原结构以及由此产生的摩擦学特性在关节面不同区域之间存在差异16。使用骨软骨柱时，在无侧限加载条件下，其胶原网络已被破坏，液体压力状态发生改变，与完整关节模型相比存在局限性，需予以考虑。

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本研究由下奥地利州研究与教育有限公司（NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H.）及下奥地利州政府通过生命科学资助计划（项目编号：LSC15-019）以及奥地利COMET计划（项目K2 XTribology，资助编号：849109）提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
两性霉素BSigma?Aldrich Chemie GmbHA-2942-100ML
4% 缓冲甲醛溶液VWR97131000
细胞增殖试剂盒II（XTT）Roche Diagnostics11465015001基于XTT的离体毒理学检测
CoCrMo 原料Acnis International直径为6 mm的CoCrMo棒材
CryoStar NX70 冷冻切片机Thermo Fischer Scientific冷冻切片设备
二甲基亚砜（DMSO）Sidma-Aldrich ChemieD 2438-10ML
Dulbecco’s 改良伊格尔’s 培养基Sigma?Aldrich Chemie GmbH培养基
胎牛血清Gibco
透明质酸Anika Therapeutics Inc.润滑液组分
iCyclerBioRad热循环仪
Leica 显微镜 DM?1000Leica组织学显微镜
LightCycler 480 密封箔Roche Diagnostics
LightCycler 96Roche Diagnostics用于PCR的热循环仪
MagNA Lyser Green BeadsRoche Diagnostics3358941001
骨软骨自体移植系统（OATS）Arthrex Inc.用于获取骨软骨圆柱体的切割管
osteosoftMerck1017279010脱钙液
青霉素/链霉素Sigma?Aldrich Chemie GmbHP4333-100ML
磷酸盐缓冲液Sigma?Aldrich Chemie GmbHPBS
Prescale 低压压力感应膜Fujifilm压力指示膜
RNeasy 纤维组织试剂盒QIAGEN74404
Synergy 2BioTek Instruments酶标仪
Tetra?Falex MUSTFalex Tribology摩擦计
Tissue? Tek O.C.T.SAKURA4583包埋剂
Transcriptor 第一链cDNA合成试剂盒Roche Diagnostics40897030001
β-巯基乙醇Sidma-Aldrich ChemieM3148

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