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方法文章

在一组啮齿类动物脑样本中同时测量卒中后脑水肿、梗死区域及血脑屏障破坏

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DOI：

10.3791/61309

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2020年10月23日

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1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine, Dnepropetrovsk State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种在同一批啮齿类动物脑样本上测量缺血性脑损伤三个最重要参数的新技术。仅使用一个脑样本在伦理和经济成本方面具有显著优势。

摘要

全球发病率和死亡率最常见的原因之一是缺血性脑卒中。传统上，用于模拟缺血性脑卒中的动物模型包括大脑中动脉阻塞（MCAO）。脑梗死区域、脑水肿以及血脑屏障（BBB）破坏被用作反映MCAO后脑损伤程度的检测指标。该方法的一个重要局限性在于，这些指标通常需在不同的大鼠脑组织样本中分别测定，因而为了获得足够的样本量需要处死大量大鼠，带来伦理和经济上的负担。本文介绍一种可在同一批大鼠脑组织中同时测定梗死区域、脑水肿和血脑屏障通透性的方法，以准确评估MCAO后的脑损伤情况。这一新技术为评估脑卒中的病理生理机制提供了更高效的研究手段。

引言

全球范围内，卒中是导致发病和死亡的最常见原因之一。其中，缺血性卒中占全球所有卒中病例的68%，而在美国，缺血性卒中占卒中病例的87%1,2据估计，脑卒中给美国带来的经济负担高达340亿美元。2 以及 €450亿（欧盟）3. 研究脑卒中的病理生理机制、开发新的评估方法并提出新的治疗方案，需要借助卒中动物模型4.

缺血性脑卒中通常由大脑主要动脉闭塞引起，最常见的是大脑中动脉或其分支的闭塞5。因此，缺血性脑卒中的动物模型历史上多采用大脑中动脉闭塞（MCAO）的方法6,7,8,9,10,11,12。在MCAO后，神经功能损伤通常通过以下三种方式评估：采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定梗死区域（IZ）13，通过干燥法或计算半球体积来评估脑水肿（BE）14,15,16，以及利用伊文思蓝染色结合分光光度法检测血脑屏障（BBB）通透性17,18,19。

传统的MCAO方法对每项脑部测量均使用不同的脑组织样本。当样本量较大时，这会导致大量实验动物被实施安乐死，从而带来额外的伦理和经济负担。一种可减轻这些成本的替代方法是在同一组MCAO后啮齿类动物脑组织中同时测量全部三项参数。

既往已有尝试在同一脑样本中联合测量多个参数。在同一批脑样本中，已有研究在TTC染色后采用同时进行的免疫荧光染色方法20以及其他分子和生物化学分析方法21。我们此前曾在同一批脑组织中通过计算大脑半球体积来评估脑水肿，并进行TTC染色以计算梗死区域15。

在本实验方案中，我们介绍了一种改良的MCAO技术，通过在同一组啮齿类动物脑组织中测定IZ、BE和BBB通透性来评估缺血性脑损伤。IZ通过TTC染色法测定，BE通过计算半球体积确定，BBB通透性则采用光谱法测定19。在本方案中，我们采用了一种改良的MCAO模型，该模型基于将单丝缝合线导管直接插入并固定于颈内动脉（ICA），进而阻断大脑中动脉（MCA）的血流22。与传统的MCAO方法相比，该改良方法的死亡率和发病率显著降低16,22。

这种新方法为测量大脑中动脉闭塞（MCAO）后的神经损伤提供了一种经济可行且符合伦理的模型。对缺血性脑损伤主要参数的评估将有助于全面研究其病理生理机制。

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方案

以下实验均按照《赫尔辛基宣言》《东京指南》以及欧洲共同体《实验动物使用指南》的建议进行。本研究亦获得内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。

1. 实验前大鼠的准备

  1. 选取无明显病理特征的成年雄性Sprague-Dawley大鼠，每只体重在300至350 g之间。
  2. 实验前将所有大鼠饲养在22 °C室温下，保持12小时光照与12小时黑暗的循环环境。
  3. 确保食物和水自由获取。
  4. 所有操作均在上午6:00至下午2:00之间进行。

2. 手术前大鼠的准备

  1. 用异氟烷（诱导浓度4%，维持浓度2%）和24%氧气（1.5 L/min）对大鼠进行30分钟麻醉。
    1. 通过检查大鼠是否存在足底回缩反射来测试其麻醉深度。
  2. 将24号导管插入大鼠尾静脉。
    注意：不进行尾部加温以促进血管扩张。
    1. 将大鼠仰卧位放置于操作台上，使用医用胶带固定其四肢。
  3. 手术前将测温探头插入大鼠直肠。
  4. 操作过程中，使用加热板维持大鼠核心体温在37 °C。
  5. 在大鼠双眼涂抹眼膏以作保护。
  6. 剃除手术区域毛发，并使用10%聚维酮碘溶液消毒三次，随后使用70%异丙醇消毒。

3. 右侧大脑中动脉阻塞

注意：MCAO 采用改良技术进行，如先前所述16,22,23，并使用 McGarry 等人24 和 Uluç 等人25 描述的器械。

  1. 使用手术镊和弯头手术剪沿颈部腹侧中线解剖皮肤和浅筋膜。
  2. 辨认由颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）和颈总动脉（CCA）构成的肌三角区域。
  3. 使用血管外科用显微镊小心地将右侧颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）与迷走神经分离。
  4. 暴露右侧颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）。使用微型夹或血管外科专用止血带阻断从颈总动脉（CCA）流向颈内动脉（ICA）的血流。使用血管外科用显微剪在颈内动脉（ICA）上做一约1 mm的切口。
  5. 将单丝尼龙导管（4-0）直接经颈内动脉（ICA）插入，从右侧颈总动脉分叉处起约18.5–19 mm，直至大脑前交通动脉环（circle of Willis），插入至遇到轻微阻力为止，以阻塞大脑中动脉（MCA）26。
  6. 在颈总动脉分叉点上方对颈内动脉（ICA）进行结扎。
  7. 对于假手术对照组，插入尼龙线，但不执行步骤3.5和3.616,22。
  8. 通过腹腔注射给予0.9%氯化钠溶液5 mL。
  9. 缝合切口，并将大鼠转移至恢复区域。
    注意：麻醉结束后数分钟，大鼠将苏醒并在笼内自主活动。
  10. 在大脑中动脉闭塞（MCAO）后23小时，通过套管27经尾静脉向两组手术大鼠注射生理盐水中2%伊文思蓝溶液（4 mL/kg）23,26。
    注意：该染料用于示踪血脑屏障通透性。允许循环60分钟。

4. 梗死区域的确定

  1. 按照先前描述的方法9,15,18,19,26，在MCAO术后24小时测量梗死体积（IZ）。
    注意：体重减轻超过20%、出现癫痫发作或偏瘫的大鼠将被排除在实验之外。
  2. 通过将吸入气体混合物替换为20%氧气和80%二氧化碳，直至大鼠自主呼吸停止，以实施安乐死。
  3. 使用剪刀和外科镊子，在肋弓下方通过腹壁做5-6 cm的侧向切口，打开胸腔。
  4. 使用剪刀和外科镊子，沿整个肋弓长度进行横膈膜切开。
  5. 小心移开肺组织，用剪刀沿左右两侧从肋弓剪至锁骨处28。
  6. 通过心脏左心室灌注200 mL生理盐水。
  7. 用剪刀穿刺或切开心脏右心房。
  8. 使用断头器进行断头，并收集脑组织。
  9. 使用虹膜剪，从枕骨大孔开始，沿后颅骨表面两侧向远端边缘剪开。
  10. 将嗅球、颅骨腹侧和背侧的神经连接与脑组织分离。
  11. 将脑组织从头颅中取出。
  12. 使用厚度为0.009英寸的未涂层单刃不锈钢剃须刀片，制作2 mm厚的水平切片，共获得6个脑切片。
  13. 在0.05% TTC溶液中37 °C孵育30分钟。
  14. 将脑组织置于显微镜载玻片上，以1600×1600 dpi的分辨率对这6个脑切片进行光学扫描（示例见补充材料1）。
  15. 使用图像编辑软件（如Adobe Photoshop CS2）的通道混合器功能（图像 > 调整 > 通道混合器）添加蓝色滤镜，并将图像保存为JPEG格式。
    注意：应用蓝色滤镜后，图像将呈现为灰度图像。
  16. 在ImageJ 1.37v29,30中打开已保存的图像。
    注意：该计算机程序使用阈值函数来分离并计算黑色或白色像素的数量（见图1）。
  17. 对图像中每个脑切片的左右半球（右侧为损伤同侧，左侧为未损伤对侧），使用主菜单中的“多边形选区”工具分别选择并保存为独立的图像文件。
  18. 在ImageJ软件主菜单中选择图像 > 调整 > 阈值，使用自动阈值功能设定阈值，测量单个脑切片每侧半球的像素数量。
    注意：此步骤可在ImageJ中使用宏命令完成（代码见补充材料2）。阈值是决定将哪些像素转换为白色、哪些转换为黑色的关键参数，取决于灰度深浅（示例见补充材料3和补充材料4）。ImageJ随后通过比较白色与黑色像素来确定梗死体积。根据染色方案和扫描仪设置，我们采用0.220的固定阈值。
  19. 采用同侧与对侧大脑半球比值法（RICH法）13,23校正组织肿胀对梗死体积（IZ）的测量（示例见补充材料5）。
    校正后的梗死体积计算公式；神经学研究中的公式；半球大小比值。
    注意：梗死体积以对侧半球体积的百分比表示。

5. 脑水肿的测定31

注意：使用 ImageJ 1.37v 测量 BE32,33。

  1. 在大脑中动脉阻塞（MCAO）后 24 小时测量脑水肿（BE）。计算 BE 时，使用左右半球体积（以单位计）的数据。
  2. 以 1600×1600 dpi 的分辨率进行光学扫描（示例见补充资料 1）。
  3. 选择脑半球，并按照上文第 4.17–4.19 节所述，使用 ImageJ 1.37v 设置用于确定 BE 的阈值。
  4. 将 BE 面积表示为未受累对侧半球标准面积的百分比，采用 RICH 方法并通过以下公式计算（示例见补充资料 5）23,34。
    脑水肿程度公式，脑半球体积比，数学表达式
    注：脑水肿（BE）程度以对侧半球的百分比表示。

6. 血脑屏障破坏的测定

  1. 在大脑中动脉闭塞（MCAO）后24小时检测血脑屏障（BBB）的破坏情况。
  2. 将右侧和左侧半脑各分为六个切片，每个切片放入一个微量离心管中。
  3. 根据每1 g脑组织加入4 mL 50%三氯乙酸的计算比例，用三氯乙酸对每一片脑组织进行匀浆处理。
  4. 以10,000 × g 离心20分钟。
  5. 用96%乙醇将上清液按1:3比例稀释。
  6. 使用分光光度计软件，安装样品板，并按照以下参数进行样品检测：荧光强度激发波长620 nm（带宽10 nm），发射波长680 nm（带宽10 nm）23,35；顶部模式；检测次数25；手动模式100；振荡1秒，振幅1 mm。
    注意：使用激发波长620 nm（带宽10 nm）和发射波长680 nm（带宽10 nm）进行检测。23,35

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结果

梗死区域测量

独立样本 t 检验显示，接受永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）的19只大鼠相比16只假手术大鼠，脑梗死体积显著增加（MCAO=7.49% ± 3.57 vs. 假手术=0.31% ± 1.9，t(28.49) = 7.56，p < 0.01（见图2A））。数据以对侧半球的平均百分比±标准差表示。

脑水肿测量

独立样本 t 检验显示，与 16 只假手术大鼠相比，接受永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）的 19 只大鼠在术后 24 小时脑水肿程度显著增加（MCAO=12.31% ± 8.6 vs. 假手术组=0.64% ± 10.2，t(29.37) = 3.61，p = 0.01，d = 1.23（见图 ...

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讨论

本实验方案的主要目标是展示对缺血性损伤三个主要参数——梗死区（IZ）、脑水肿（BE）和血脑屏障（BBB）通透性——进行一致测量的方法。该领域先前的研究已证明可在同一样本中同时检测其中一至两个参数。除了该三联方法可降低实验成本外，它还提供了一种更符合生物伦理的模型，减少了需要手术并随后实施安乐死的动物数量。与所有组织学技术一样，该方法的局限性在于无法动态观察缺血性损伤过程。

图像分析中使用了四个计算机程序：ImageJ 1.37v、Adobe Photoshop CS2、 Microsoft Excel 365 和 IBM SPSS Statistics 22。ImageJ 用于测量梗死区域的范围和脑水肿程度。Adobe Photoshop 用于消除伊文思蓝对脑组织的影响，因为蓝色表明血脑屏障（BBB）破坏。在计算梗死区域之前，必须从图像中去除蓝色，否则会影响梗死区域测量的准确性（见图1B、1D、1F）。Excel 和 SPSS 用于数据处理。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢乌克兰第聂伯罗彼得罗夫斯克市奥列斯·冈查尔第聂伯罗国立大学生物、生态与医学系生理学教研室的 Maryna Kuscheriava、Maksym Kryvonosov、Daryna Yakumenko 和 Evgenia Goncharyk 在讨论中提供的支持与有益贡献。所获得的数据属于 Ruslan Kuts 博士论文的一部分。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL注射器布劳恩4606027V
70% 酒精溶液中的 2% 氯己定Sigma-Aldrich500 cc为手术区域皮肤提供常规消毒
27 G 针头配注射器布劳恩305620
3-0 丝线缝合线Henry Schein1007842
4-0 尼龙缝线4-00
大脑 &与组织基质Sigma-Aldrich15013
Cannula Venflon 22 GKD-FIX183603985447
Sigma 2-16P 离心机Sigma-AldrichSigma 2-16P
紧凑型分析天平Sigma-AldrichHR-AZ/HR-A
电子天平Sigma-Aldrich4,000 卢比
解剖剪Sigma-AldrichZ265969
Eppendorf 移液器Sigma-AldrichZ683884
Eppendorf管Sigma-AldrichEP0030119460
荧光检测器Tecan, Männedorf 瑞士型号：Infinite 200 PRO 多功能酶标仪可选。
荧光检测器Molecular Devices LLCVWR 货号 # 10822 512 SpectraMax Paradigm 多功能微孔板读板仪基础仪器可选。
纱布敷料Fisher22-362-178
带温度计的加热器加热板-1型号：HEATINGPAD-1/2
止血微型夹Sigma-Aldrich
Horizon-XLMennen Medical Ltd
输注袖带ABNIC-500
微型镊子Sigma-Aldrich
微型剪刀Sigma-Aldrich
多集合梯瓦医疗998702
奥林巴斯 BX 40 显微镜Olympus
操作镊子Sigma-Aldrich
使用剪刀Sigma-Aldrich
光学扫描仪佳能Cano Scan 4200F分辨率 3200 x 6400 dpi
培养皿Sigma-AldrichP5606
普瑞纳饲料普瑞纳5001实验中向大鼠随意提供的啮齿类动物实验室饲料是一种生命周期营养饲料，已用于生物医学研究五十多年。该饲料同样适用于小鼠和仓鼠。
大鼠笼具Techniplast2000P啮齿类动物常规饲养环境。实验全程使用笼具饲养大鼠
11号手术刀片Sigma-AldrichS2771
<强>软件
Adobe Photoshop CS2 for WindowsAdobe
ImageJ 1.37v美国国立卫生研究院源代码可免费获取。作者 Wayne Rasband（wayne@codon.nih.gov）来自美国马里兰州贝塞斯达市国家精神卫生研究院研究服务部
SPSS Statistics 22IBM
Office 365 ProPlusMicrosoft-Microsoft Office Excel
Windows 10微软
<强>试剂
2,3,5-三苯基氯化四氮唑Sigma-Aldrich298-96-4
50% 三氯乙酸Sigma-Aldrich76-03-9
乙醇 96 %Romical易燃液体
伊文思蓝 2%Sigma-Aldrich314-13-6
异氟烷，USP 100%Piramamal Critical Care, IncNDC 66794-017

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大脑中动脉闭塞梗死区域测量脑水肿分析TTC染色ImageJ分析三氯乙酸匀浆发光光谱光度法缺血性脑卒中模型
在一组啮齿类动物脑样本中同时测量卒中后脑水肿、梗死区域及血脑屏障破坏
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