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方法文章

基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

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DOI：

10.3791/61317

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2020年5月10日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

本文内容

摘要

本实验方案的目的是展示由Janus基底纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组装仿生纳米基质（NM）的方法。当与人源间充质干细胞（hMSCs）共培养时，该纳米基质在促进hMSCs黏附方面表现出优异的生物活性。

摘要

开发了一种仿生纳米膜（NM），用作组织工程的生物支架，可增强干细胞的锚定。该仿生纳米膜通过JBNTs与FN在水溶液中自组装形成。JBNTs长度为200-300 µm，具有内部疏水的中空通道和外部亲水的表面。JBNTs带正电，而FN带负电。因此，当将其注入中性水溶液时，二者通过非共价键结合，形成纳米膜束。该自组装过程在数秒内完成，无需任何化学引发剂、热源或紫外光。当纳米膜溶液的pH值低于FN的等电点（pI 5.5-6.0）时，由于FN带正电，纳米膜束将自发解离释放。

纳米膜（NM）在形态上可模拟细胞外基质（ECM），因此可用作可注射的支架材料，为增强人骨髓间充质干细胞（hMSC）的黏附提供优良平台。细胞密度分析和荧光成像实验表明，与阴性对照组相比，纳米膜显著增加了hMSC的锚定。

引言

人源间充质干细胞（hMSCs）具有自我更新和沿不同间充质谱系自我分化的能力，有助于组织的再生与维持1。基于其分化潜能，hMSCs被视为治疗间充质组织损伤和造血系统疾病的重要候选细胞2。研究表明，hMSCs能够通过促进组织修复、血管生成以及减轻炎症反应来加速伤口愈合3。然而，在缺乏生化因子或生物材料辅助的情况下，hMSCs靶向迁移至目标组织并在特定部位发挥功能的效率较低4。尽管已有多种工程化支架被用于引导hMSCs黏附于损伤部位，但某些解剖位置（如位于长骨中部的生长板骨折处）难以通过传统预制支架有效到达，且这些支架可能无法与形状不规则的损伤区域完全贴合。

在此，我们开发了一种可原位自组装并可注射至难以到达靶区域的仿生纳米材料。这种可注射的生物支架纳米材料（NM）由Janus基纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组成。JBNTs也被称为玫瑰花结纳米管（RNTs），来源于DNA碱基对，特别是胸腺嘧啶和腺嘌呤5,6,7。如图1所示，当六个衍生的DNA碱基对分子通过氢键自组装形成一个平面时，即形成纳米管结构6。随后，六个分子通过强烈的π-π堆叠相互作用在平面上层层堆叠7，可形成长达200–300 µm的结构。JBNTs在形态上被设计为模拟胶原纤维，以使纤连蛋白（FN）能够与其发生反应。

纤连蛋白（FN）是一种高分子量的黏附性糖蛋白，存在于细胞外基质（ECM）中9。它可介导干细胞与其他ECM成分（尤其是胶原蛋白）之间的黏附10。我们设计的JBNTs在形态上模拟胶原纤维，使FN能够通过非共价键在数秒内与其反应并形成NM。因此，NM是一种有前景的生物支架材料，可注射至传统制备的支架难以到达的骨骨折部位。在此，这种可注射的NM在体外表现出优异的增强人骨髓间充质干细胞（hMSC）锚定能力，显示出其作为组织再生支架的应用潜力。

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方案

1. JBNTs 的合成

注意：JBNT 单体的制备方法如先前文献所述11。

  1. 化合物 A1 的合成
    1. 将 8.50 g 2-氰基乙酸和 9.80 g 乙基氨基甲酸酯溶于 25 mL 甲苯和 2.5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，制备成溶液。逐滴加入 4.90 mL 三氯氧磷，然后将混合物加热至 70 °C，持续搅拌 1.5 小时。
    2. 将反应混合物冷却至室温，倒入 100 g 冰水中。用乙酸乙酯（3 × 250 mL）萃取水相，并用 100 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除挥发性物质，得到淡黄色固体。
    3. 将黄色固体进行硅胶快速柱层析（3% 甲醇/二氯甲烷），得到 15.61 g 白色粉末状化合物 A1。
  2. 化合物 A2 的合成
    1. 将 3.12 g 化合物 A1 和 2.75 g 碳酸钾加入 50 mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下搅拌 2 小时。
    2. 向反应悬浮液中加入 2.6 mL 二硫化碳，继续搅拌 4 小时。
    3. 在 0 °C 下向反应混合物中加入无水乙醇，过滤析出的黄色沉淀，并用乙醚洗涤。减压干燥过夜，得到 6.18 g 淡黄色固体状化合物 A2。
  3. 化合物 A3 的合成
    1. 将 2.7 mL 碘甲烷加入 15 mL 乙腈中。另取 6.18 g 化合物 A2 溶于 80 mL 水/乙腈（7:3）混合溶剂中，制备成溶液。将两种溶液混合，室温下搅拌 30 分钟。
    2. 将反应混合物加热至 95 °C，持续搅拌 3 小时。
    3. 将反应混合物冷却至室温，然后减压蒸除挥发性物质。
    4. 用 100 mL 乙酸乙酯对残留物萃取 3 次，并用饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到黄色固体。
    5. 将黄色固体进行硅胶快速柱层析（30% 乙酸乙酯/正己烷），得到 4.52 g 浅黄色固体状化合物 A3。
  4. 化合物 A4 的合成
    1. 将 925 µL 烯丙胺加入 20 mL 乙醇中，制备成烯丙胺溶液。将该溶液在 30 分钟内逐滴加入由 3.14 g A3 溶于 75 mL 无水乙醇所制得的化合物 A3 溶液中。然后将反应混合物加热回流 16 小时。
    2. 将反应混合物冷却至室温，减压蒸除挥发性物质，得到黄色固体。
    3. 将黄色固体进行硅胶快速柱层析（洗脱梯度：50% 乙酸乙酯/正己烷 至 2% 甲醇/二氯甲烷），得到 1.80 g 白色晶体状化合物 A4。
  5. 化合物 A5 的合成
    1. 将 2.05 g 盐酸胍和 7.8 mL 乙醇钠（21 wt% 乙醇溶液）加入 14 mL 无水乙醇中，加热至 45 °C 反应 15 分钟。
    2. 过滤除去不溶物，将滤液直接加入由 2.70 g A4 溶于 40 mL 无水乙醇所制得的化合物 A4 溶液中。将反应混合物加热回流 16 小时。
    3. 过滤析出的沉淀，得到 2.65 g 类白色固体状化合物 A5。
  6. 化合物 A6 的合成
    1. 将 2.11 g 化合物 A5 和 1.10 g 4-二甲氨基吡啶加入 120 mL 四氢呋喃中，形成浆状混合物，于 1 分钟内缓慢加入 24.9 mL 三乙胺。室温下搅拌 2 分钟。
    2. 向反应混合物中逐滴加入 20.7 mL 二叔丁基二碳酸酯，室温下继续搅拌 40 小时。
    3. 加入 20 mL 水淬灭反应，减压蒸除挥发性物质。
    4. 用 500 mL 乙酸乙酯萃取红色粘稠残留物，依次用 250 mL 水、75 mL 10% 柠檬酸、2 × 200 mL 水、200 mL 饱和碳酸氢钠溶液和 200 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到红/橙色固体。
    5. 将该固体进行硅胶快速柱层析（0–20% 乙酸乙酯/正己烷），得到 3.87 g 白色泡沫状化合物 A6。
  7. 化合物 A7 的合成
    1. 将 N-甲基吗啉-N-氧化物（50 wt.% 水溶液，1.64 mL）逐滴加入由 2.93 g 化合物 A6 溶于丙酮/水（8:1，58.5 mL）所制得的溶液中，室温下搅拌 5 分钟。
    2. 在 3 分钟内逐滴加入四氧化锇（4% 水溶液），室温下继续搅拌 24 小时。
    3. 用 1.0 M 亚硫酸钠水溶液淬灭反应，直至溶液变为无色。减压除去挥发性物质，得到含白色浆状物的水相。用 350 mL 二氯甲烷萃取残留物，依次用 150 mL 水和 150 mL 饱和食盐水洗涤。
    4. 用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到 2.45 g 白色固体状化合物 A7。
  8. 化合物 A8 的合成
    1. 将 760 g 高碘酸钠加入由 1.36 g 化合物 A7 溶于二氯甲烷/水（6:1，35 mL）所形成的混合物中，室温下搅拌 42 小时。
    2. 过滤除去不溶物，减压浓缩滤液。用 250 mL 二氯甲烷萃取所得残留物，依次用 100 mL 水和 100 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到粗产物。
    3. 将粗产物进行硅胶快速柱层析（5–40% 乙酸乙酯/正己烷，随后 5% 甲醇/二氯甲烷），得到 1.08 g 化合物 A8。
  9. 化合物 A9 的合成
    1. 将 830 mg 化合物 A8 溶于 15 mL 1,2-二氯乙烷中，制备成溶液。在 3 分钟内将该溶液逐滴加入由 6-苄氧羰基氨基-2-L-氨基己酸三甲基硅乙酯（649.5 mg）和 N,N-二异丙基乙胺（591 µL）溶于 24 mL 1,2-二氯乙烷所形成的混合物中，室温下搅拌 15 分钟。
    2. 向溶液中加入 360.3 mg 三乙酰氧基硼氢化钠，室温下继续搅拌 24 小时。
    3. 用 6 mL 水淬灭反应混合物。用 200 mL 二氯甲烷萃取反应混合物 3 次，依次用 200 mL 10% 柠檬酸水溶液、2 × 200 mL 水、200 mL 饱和碳酸氢钠溶液和 200 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到粗产物。
    4. 将粗产物进行硅胶快速柱层析（5–30% 乙酸乙酯/正己烷），得到 885 mg 化合物 A9。
  10. JBNT 单体的合成
    1. 将 0.54 g 化合物 A9 溶于 10 mL 94% 三氟乙酸/硫代苯甲醚溶液中，室温下搅拌 72 小时。
    2. 向反应混合物中加入乙醚（80 mL），离心收集沉淀。倾去含三氟乙酸的上清液，用乙醚和甲醇洗涤白色沉淀，得到 168.6 mg 粗制 JBNT 单体（补充文件 1）。
    3. 采用反相高效液相色谱（HPLC）对粗制 JBNT 单体进行纯化。分离程序如下：流动相 A：100% 水；流动相 B：100% 乙腈；流动相 C：pH = 1 的盐酸水溶液；流速：3 mL/min（见 表 1）。
    4. 收集约 7.2 分钟处的主峰组分。

2. JBNT/FN 的制备

  1. 将80 µL浓度为1 mg/mL的JBNT水溶液加入40 µL浓度为1 mg/mL的FN水溶液中，并用移液器反复吹打数次。
  2. 吹打约10秒后，观察是否有白色固体悬浊物生成。
    注意：已拍摄视频以记录NM的自组装过程（补充文件2）。

3. 冻干样品的观察

注意：此步骤旨在展示由 JBNTs 和 FN 制备的 NM 的支架结构。

  1. 制备用于观察冻干材料的 FN、JBNT 和 FN/JBNT 纳米材料（NM）溶液。将 10 µL 浓度为 100 µg/mL 的 FN 用 40 µL 蒸馏水稀释，配制成浓度为 20 µg/mL 的 FN 溶液。
  2. 通过将 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNTs 用 45 µL 去离子水稀释，配制浓度为 100 mg/mL 的 JBNTs 溶液。
  3. 在 35 µL 去离子水中混合 10 µL 浓度为 100 µg/mL 的 FN 和 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNTs，形成 NM 溶液。
  4. 分别用 FN 溶液、JBNT 溶液和 NM 溶液包被 96 孔透明圆底微孔板中的三个孔，每孔加入 50 µL 溶液。
  5. 按以下步骤进行冻干处理，以观察 NM 的支架结构：
    1. 将微孔板在 -80 °C 下冷冻过夜。
    2. 打开冻干仪和真空泵。
    3. 按下 cool down 按钮，使系统温度降至 -50 °C。
    4. 将已冷冻的微孔板放入冻干仪中，并关闭仪器所有开口。
    5. 点击 start 按钮，使系统压力降至 0.9 mbar。
    6. 4 小时后，按下 aerate 按钮并打开阀门，使系统压力升至大气压。
    7. 将微孔板从冻干仪中取出。
    8. 使用显微镜观察 FN、JBNTs 及所形成的自组装 NM 结构，并用相机拍摄材料的多张照片。

4. 吸收光谱测量

注意：利用 FN 和 JBNTs 光谱的变化来展示自组装的 JBNT/FN 纳米材料12。

  1. 取30 µL浓度为100 µg/mL的FN与15 µL蒸馏水和5 µL浓度为1 mg/mL的JBNTs混合，制备JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液。反复吹打溶液数次后可见白色固体悬浮物。
    注意：溶液中JBNTs和FN的最终浓度分别为100 µg/mL和60 µg/mL。同时配制与NM溶液中相同浓度的JBNTs和FN溶液作为对照溶液。
  2. 将5 µL浓度为1 mg/mL的JBNTs用45 µL蒸馏水稀释，制备JBNT对照溶液。
  3. 将30 µL浓度为100 µg/mL的FN用20 µL蒸馏水稀释，制备FN对照溶液。
  4. 使用紫外-可见分光光度计（见材料表）测定FN、JBNT和JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液的紫外-可见吸收光谱，以表征纳米复合物的组装情况。
    1. 点击UV-Vis按钮。清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL蒸馏水。在190–850 nm范围内进行空白测定。
    2. 清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL FN溶液。在190 nm至850 nm范围内测定FN溶液的紫外-可见吸收光谱。
    3. 清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL JBNT溶液。在190 nm至850 nm范围内测定JBNT溶液的吸收光谱。
    4. 清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液。在190 nm至850 nm范围内测定JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液的吸收光谱。

5. 用于透射电子显微镜（TEM）的JBNT/FN纳米材料制备

  1. 使用基础等离子清洗机（见材料表）在负染色前清洗数个载网。
  2. 按照两种不同流程对样品进行负染色。
    1. 分别在不同的载网上滴加3 µL浓度为1 mg/mL的JBNT水溶液和3 µL JBNT/FN NM溶液，静置2分钟。然后用100 µL的0.5%醋酸铀（UA）溶液冲洗每个载网。用滤纸吸去多余液体，并将载网在空气中干燥。
    2. 将9 µL JBNT/FN NM溶液与3 µL 2.0% UA溶液混合，并用移液器反复吹打数次。将混合溶液滴加到载网上，在载网上保持2分钟。用滤纸吸去载网上的混合溶液，并在室温下干燥载网。
  3. 最后，利用透射电子显微镜（TEM）对JBNTs、经步骤5.2.1染色的JBNT/FN NM以及经步骤5.2.2染色的JBNT/FN NM样品进行表征。

6. 体外生物学功能检测

  1. 分别向8孔板的每个孔中加入200 µL的阴性对照（NC，PBS）、JBNTs、FN和JBNT/FN NM溶液。
  2. 使用冷冻干燥仪器对8孔板盖玻片进行冷冻干燥，使材料涂覆在孔底。冷冻干燥的程序与步骤3.5相同。
  3. 然后每孔加入10,000个/孔的hMSCs细胞（第3代），在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  4. 培养结束后，用移液器吸出各孔中的细胞培养基，并用1× PBS溶液清洗细胞培养层。
  5. 向含细胞的各孔中加入100 µL固定液，静置5分钟。用1× PBS轻柔冲洗细胞两次。
  6. 将1% Triton-X 100稀释至0.1%。向含细胞的各孔中加入100 µL 0.1% Triton-X 100，静置10分钟。用1× PBS轻柔冲洗细胞两次。
  7. 将罗丹明-鬼笔环肽（Rhodamine Phalloidin）稀释至1.65 µM。向含细胞的各孔中加入100 µL罗丹明-鬼笔环肽，将8孔板避光置于室温下孵育30分钟。用1× PBS轻柔冲洗细胞两次。
  8. 使用荧光显微镜拍摄细胞图像。
  9. 统计每组荧光图像中的细胞数量。通过计算每个孔内三个随机区域的平均值，得出细胞黏附密度。
  10. 所有数据以平均值±标准差（SD）表示。采用单尾t检验进行统计分析，随后进行方差分析（ANOVA），以p<0.05为差异具有统计学意义。

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结果

我们的研究发现，JBNTs与FN形成NM的过程非常迅速，仅需10秒即可完成。如图2所示，当JBNT溶液与FN溶液混合并反复吹打数次后，即可观察到白色絮状物的生成。NM的形成过程完全仿生，无需任何外部刺激。该制备工艺比某些新兴生物材料更为简便，后者通常依赖紫外光或化学引发剂来实现交联13。

我们采集并分析了FN、JBNTs和NM的显微图像（图3）。在FN组中，除少量短的白色斑点外，未观察到长纤维。这些短簇是由FN组成的蛋白聚集体，表明仅靠FN无法形成支架结构（图3A）。如图3B所示，长而细的纤维表明JBNTs的存在。与JBNTs相比，NM中白色条带的宽度更宽，说明JBNTs与FN相互交联形成了NM。NM纤维的长度可生长至数厘米（图3C）。

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讨论

在本研究中，我们开发了一种自组装的仿生纳米膜（NM），该膜由仿DNA结构的JBNTs和FN组成。在配制JBNT溶液时，应将JBNT冻干粉溶解于水中，而非PBS中，因为PBS会引起JBNT的聚集，从而抑制其自组装。此外，若希望观察NM的纳米原纤维结构，也应在水中进行NM的组装，因为PBS中的盐离子会与NM纤维发生束集作用，显著降低成像分辨率。

尽管已有大量研究致力于制备用于促进人骨髓间充质干细胞（hMSCs）黏附与分化的组织再生支架，但脱细胞基质（NM）作为一种新型组织工程支架仍展现出巨大潜力。然而，大多数此类材料均为预先制备成特定形状，例如3D打印支架18,19，因此难以植入关节内部较深的损伤部位。相比之下，本文中的NM溶液可作为液体直接注射，并随后作为细胞黏附的支架发挥作用。

一个局限性在于纳米材料（NM）的机械强度不高。与聚合物不同，它们通过非共价相互作用的自组装方式制备，因此无法承受较大的机械载荷或张力。...

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披露

Yupeng Chen 博士是 NanoDe Therapeutics, Inc. 的联合创始人。

致谢

本工作获得美国国立卫生研究院（NIH）（资助号 1R01AR072027-01、1R03AR069383-01）、美国国家科学基金会职业奖（1653702）和康涅狄格大学的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二氯乙烷Alfa Aesar39121
2-氰基乙酸Sigma-AldrichC88505
4-二甲氨基吡啶TCI AmericaD1450
8孔腔室盖玻片Thermo Fisher155409
96孔板Corning353072
无水乙醇Thermo FisherBP2818500
丙酮Sigma-Aldrich179124
乙腈Sigma-Aldrich34851
烯丙胺Sigma-Aldrich145831
基础等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC32G
柠檬酸Sigma-Aldrich251275
浓盐酸Sigma-AldrichH1758
去离子水Thermo Fisher15230147
二氯甲烷Sigma-Aldrich270997
乙醚Sigma-Aldrich296082
二叔丁基二碳酸酯Sigma-Aldrich361941
乙酸乙酯Sigma-Aldrich319902
氨基甲酸乙酯Sigma-AldrichU2500
纤连蛋白Thermo FisherPHE0023
固定液（磷酸盐缓冲液配制的4%甲醛）Thermo FisherR37814
盐酸胍Alfa AesarA13543
己烷Sigma-Aldrich227064
人源间充质干细胞LonzaPT-2501
甲醇Sigma-Aldrich34860
碘甲烷Sigma-Aldrich289566
N,N-二异丙基乙胺Alfa AesarA17114
N,N-二甲基甲酰胺Sigma-Aldrich227056
N-甲基吗啉-N-氧化物Alfa AesarA19802
四氧化锇Alfa Aesar45385
青霉素-链霉素Thermo Fisher15140163
磷酸盐缓冲液Thermo Fisher20012050
三氯氧磷Sigma-Aldrich201170
碳酸钾Sigma-Aldrich347825
反相色谱柱Thermo Fisher25305-154630
罗丹明鬼笔环肽Thermo FisherR415
硅胶TCI AmericaS0821
碳酸氢钠Sigma-AldrichS6014
乙醇钠Alfa AesarL13083
高碘酸钠Sigma-Aldrich71859
硫酸钠Sigma-Aldrich239313
亚硫酸钠Sigma-AldrichS0505
三乙酰氧基硼氢化钠Alfa AesarB22060
分光光度计（NanoDrop One/Onec UV-Vis）Thermo FisherND-ONE-W
干细胞生长培养基子弹套装LonzaPT-3001
四氢呋喃Sigma-Aldrich401757
硫代苯甲醚Sigma-AldrichT28002
甲苯Sigma-Aldrich179418
三乙胺Alfa AesarA12646
三氟乙酸Alfa AesarA12198
吐温X-100Thermo FisherHFH10
胰蛋白酶-EDTA溶液Thermo Fisher25200056

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基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附
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