基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

摘要

本实验方案的目的是展示由Janus基底纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组装仿生纳米基质（NM）的方法。当与人源间充质干细胞（hMSCs）共培养时，该纳米基质在促进hMSCs黏附方面表现出优异的生物活性。

摘要

开发了一种仿生纳米膜（NM），用作组织工程的生物支架，可增强干细胞的锚定。该仿生纳米膜通过JBNTs与FN在水溶液中自组装形成。JBNTs长度为200-300 µm，具有内部疏水的中空通道和外部亲水的表面。JBNTs带正电，而FN带负电。因此，当将其注入中性水溶液时，二者通过非共价键结合，形成纳米膜束。该自组装过程在数秒内完成，无需任何化学引发剂、热源或紫外光。当纳米膜溶液的pH值低于FN的等电点（pI 5.5-6.0）时，由于FN带正电，纳米膜束将自发解离释放。

纳米膜（NM）在形态上可模拟细胞外基质（ECM），因此可用作可注射的支架材料，为增强人骨髓间充质干细胞（hMSC）的黏附提供优良平台。细胞密度分析和荧光成像实验表明，与阴性对照组相比，纳米膜显著增加了hMSC的锚定。

引言

人源间充质干细胞（hMSCs）具有自我更新和沿不同间充质谱系自我分化的能力，有助于组织的再生与维持¹。基于其分化潜能，hMSCs被视为治疗间充质组织损伤和造血系统疾病的重要候选细胞²。研究表明，hMSCs能够通过促进组织修复、血管生成以及减轻炎症反应来加速伤口愈合³。然而，在缺乏生化因子或生物材料辅助的情况下，hMSCs靶向迁移至目标组织并在特定部位发挥功能的效率较低⁴。尽管已有多种工程化支架被用于引导hMSCs黏附于损伤部位，但某些解剖位置（如位于长骨中部的生长板骨折处）难以通过传统预制支架有效到达，且这些支架可能无法与形状不规则的损伤区域完全贴合。

在此，我们开发了一种可原位自组装并可注射至难以到达靶区域的仿生纳米材料。这种可注射的生物支架纳米材料（NM）由Janus基纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组成。JBNTs也被称为玫瑰花结纳米管（RNTs），来源于DNA碱基对，特别是胸腺嘧啶和腺嘌呤^5,6,7。如图1所示，当六个衍生的DNA....

方案

1. JBNTs 的合成

注意：JBNT 单体的制备方法如先前文献所述¹¹。

1. 化合物 A1 的合成
   1. 将 8.50 g 2-氰基乙酸和 9.80 g 乙基氨基甲酸酯溶于 25 mL 甲苯和 2.5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，制备成溶液。逐滴加入 4.90 mL 三氯氧磷，然后将混合物加热至 70 °C，持续搅拌 1.5 小时。
   2. 将反应混合物冷却至室温，倒入 100 g 冰水中。用乙酸乙酯（3 × 250 mL）萃取水相，并用 100 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除挥发性物质，得到淡黄色固体。
   3. 将黄色固体进行硅胶快速柱层析（3% 甲醇/二氯甲烷），得到 15.61 g 白色粉末状化合物 A1。
2. 化合物 A2 的合成
   1. 将 3.12 g 化合物 A1 和 2.75 g 碳酸钾加入 50 mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下搅拌 2 小时。
   2. 向反应悬浮液中加入 2.6 mL 二硫化碳，继续搅拌 4 小时。
   3. 在 0 °C 下向反应混合物中加入无水乙醇，过滤析出的黄色沉淀，并用乙醚洗涤。减压干燥过夜，得到 6.18 g 淡黄色固体状化合物 A2。
3. 化合物 A....

结果

我们的研究发现，JBNTs与FN形成NM的过程非常迅速，仅需10秒即可完成。如图2所示，当JBNT溶液与FN溶液混合并反复吹打数次后，即可观察到白色絮状物的生成。NM的形成过程完全仿生，无需任何外部刺激。该制备工艺比某些新兴生物材料更为简便，后者通常依赖紫外光或化学引发剂来实现交联¹³。

我们采集并分析了FN、JBNTs和NM的显微图像（图3）。在FN组中，除少量短的白色斑点外，未观察到长纤维。这些短簇是由FN组成的蛋白聚集体，表明仅靠FN无法形成支架结构（图3A）。如图3B所示，长而细的纤维表明JBNTs的存在。与JBNTs相比，NM中白色条带的宽度更宽，说明JBNTs与FN相互交联形成了NM。NM纤维的长度可生长至数厘米（图3C）。

讨论

在本研究中，我们开发了一种自组装的仿生纳米膜（NM），该膜由仿DNA结构的JBNTs和FN组成。在配制JBNT溶液时，应将JBNT冻干粉溶解于水中，而非PBS中，因为PBS会引起JBNT的聚集，从而抑制其自组装。此外，若希望观察NM的纳米原纤维结构，也应在水中进行NM的组装，因为PBS中的盐离子会与NM纤维发生束集作用，显著降低成像分辨率。

尽管已有大量研究致力于制备用于促进人骨髓间充质干细胞（hMSCs）黏附与分化的组织再生支架，但脱细胞基质（NM）作为一种新型组织工程支架仍展现出巨大潜力。然而，大多数此类材料均为预先制备成特定形状，例如3D打印支架^18,19，因此难以植入关节内部较深的损伤部位。相比之下，本文中的NM溶液可作为液体直接注射，并随后作为细胞黏附的支架发挥作用。

一个局限性在于纳米材料（NM）的机械强度不高。与聚合物不同，它们通过非共价相互作用的自组装方式制备，因此无法承受较大的机械载荷或张力。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二氯乙烷	Alfa Aesar	39121
2-氰基乙酸	Sigma-Aldrich	C88505
4-二甲氨基吡啶	TCI America	D1450
8孔腔室盖玻片	Thermo Fisher	155409
96孔板	Corning	353072
无水乙醇	Thermo Fisher	BP2818500
丙酮	Sigma-Aldrich	179124
乙腈	Sigma-Aldrich	34851
烯丙胺	Sigma-Aldrich	145831
基础等离子清洗仪	Harrick Plasma	PDC32G
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275
浓盐酸	Sigma-Aldrich	H1758
去离子水	Thermo Fisher	15230147
二氯甲烷	Sigma-Aldrich	270997
乙醚	Sigma-Aldrich	296082
二叔丁基二碳酸酯	Sigma-Aldrich	361941
乙酸乙酯	Sigma-Aldrich	319902
氨基甲酸乙酯	Sigma-Aldrich	U2500
纤连蛋白	Thermo Fisher	PHE0023
固定液（磷酸盐缓冲液配制的4%甲醛）	Thermo Fisher	R37814
盐酸胍	Alfa Aesar	A13543
己烷	Sigma-Aldrich	227064
人源间充质干细胞	Lonza	PT-2501
甲醇	Sigma-Aldrich	34860
碘甲烷	Sigma-Aldrich	289566
N,N-二异丙基乙胺	Alfa Aesar	A17114
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	227056
N-甲基吗啉-N-氧化物	Alfa Aesar	A19802
四氧化锇	Alfa Aesar	45385
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140163
磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	20012050
三氯氧磷	Sigma-Aldrich	201170
碳酸钾	Sigma-Aldrich	347825
反相色谱柱	Thermo Fisher	25305-154630
罗丹明鬼笔环肽	Thermo Fisher	R415
硅胶	TCI America	S0821
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6014
乙醇钠	Alfa Aesar	L13083
高碘酸钠	Sigma-Aldrich	71859
硫酸钠	Sigma-Aldrich	239313
亚硫酸钠	Sigma-Aldrich	S0505
三乙酰氧基硼氢化钠	Alfa Aesar	B22060
分光光度计（NanoDrop One/Onec UV-Vis）	Thermo Fisher	ND-ONE-W
干细胞生长培养基子弹套装	Lonza	PT-3001
四氢呋喃	Sigma-Aldrich	401757
硫代苯甲醚	Sigma-Aldrich	T28002
甲苯	Sigma-Aldrich	179418
三乙胺	Alfa Aesar	A12646
三氟乙酸	Alfa Aesar	A12198
吐温X-100	Thermo Fisher	HFH10
胰蛋白酶-EDTA溶液	Thermo Fisher	25200056