方法文章

DNA幕揭示同源重组过程中复杂分子系统的机制

3.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61320

⸱

2020年6月23日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

DNA幕提供了一种新方法，可实时观察数百甚至数千个DNA结合蛋白与微流控样品室表面排列的DNA分子相互作用的过程。

摘要

同源重组（HR）在所有生物体中对于修复双链DNA断裂（DSBs）以及停滞的复制叉均具有重要作用。HR功能缺陷与人类细胞基因组完整性的丧失及癌变转化密切相关。HR涉及一组复杂蛋白质的协同作用，其中许多蛋白质的功能仍不清楚。本研究所描述的关键技术是一种名为“DNA幕布”（DNA curtains）的方法，该技术可在微流控样品室表面实现DNA分子的有序排列组装，并通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行可视化观察。DNA幕布技术由本实验室首创，能够以毫秒级时间分辨率和纳米级空间分辨率直接获取时空动态信息，而这些信息难以通过其他方法获得。DNA幕布技术的主要优势在于，它简化了从单分子实验中收集具有统计学意义数据的过程。该研究持续为细胞如何调控并维持基因组完整性提供新的见解。

引言

基因组完整性的维持对于所有活细胞的正常功能至关重要1。基因组完整性缺陷可导致多种严重健康问题，包括多种类型的癌症以及与年龄相关的退行性疾病2。同源重组（HR）通过依赖模板的DNA合成来修复DNA双链断裂（DSB）、单链DNA（ssDNA）缺口以及DNA链间交联3。HR在停滞或崩溃的复制叉的恢复过程中也发挥着必要作用3,4。此外，HR对于减数分裂过程中染色体的准确分离至关重要5,6。

同源重组（HR）涉及一系列复杂蛋白质的协同作用，其中许多蛋白质的功能仍不清楚1。例如复制蛋白A（RPA）、Rad51和Rad54等7。原核和真核细胞中的HR反应均涉及单链DNA（ssDNA）中间体，该中间体会迅速被单链DNA结合蛋白包裹（原核生物中为SSB，真核生物中为RPA）8。这些蛋白质可保护ssDNA免受核酸酶降解，消除二级结构，并促进下游因子的招募8,9。Rad51属于高度保守的ATP依赖性Rad51/RecA家族DNA重组酶，存在于所有生物体中1。Rad51可促进DNA链侵入同源双链DNA供体。鉴于其重要性，Rad51受到严格调控，这些调控过程的缺陷通常与基因组完整性丧失及癌变转化相关7。Rad54属于Swi2/Snf2家族的双链DNA易位酶和染色质重塑蛋白10,11。这些蛋白质作为Rad51的关键调控因子发挥作用。重要的是，Rad54能够将Rad51从链侵入产生的双链DNA产物上移除，并防止Rad51在染色质上的异常积聚11。酵母和细菌细胞中参与HR的蛋白质分子功能研究已揭示了它们在HR中的作用，但这些蛋白质活性如何具体贡献于HR过程，目前仍不甚清楚12。

DNA幕已成为一种独特的研究平台，可直接揭示原本难以触及的分子机制和大分子动力学过程13,14。制备DNA幕时，先在微流控腔室表面涂覆一层脂双层膜，并通过生物素-链霉亲和素连接将DNA分子锚定在脂双层上。该脂双层通过模拟天然细胞膜使表面呈惰性。流体动力使DNA沿纳米加工形成的屏障排列，从而可在单个视野内利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）同时观察数百个分子。这些屏障由电子束光刻技术制成，通过改变屏障设计可精确控制DNA的分布和锚定几何构型。该方法可适用于单链DNA（ssDNA）或双链DNA（dsDNA）13,14,15,16,17,18。此外，可同时在基底上纳米加工出柱状结构（与屏障一同制备），使DNA的两端均可锚定于样品腔室表面，从而可在无缓冲液流动的条件下进行稳态实验。

通过实时视频观察，可以揭示单个蛋白质-核酸复合物随时间变化的动态过程，并利用延时轨迹图（kymographs）在印刷材料中呈现蛋白质在DNA上位置随时间的变化。DNA幕帘技术的一个重要特点是，它并不一定需要 先验的 能够实时观察单个反应组分的行为，因此可避免对分子机制进行模型构建或假设，从而实现对分子行为的直接观测。本文所述方案详细介绍了如何制备含有双链DNA底物的DNA幕，以及将其应用于研究同源重组过程中中间体的方法。

方案

1. 脂质储备液的制备

  1. 将1 g的18:1 (Δ9-Cis) PC、100 mg的18:1 PEG2000 PE和5 mg的18:1生物素化帽PE溶解于10 mL氯仿中。
    注意：DOPC和DPPE均为特征明确的脂质，因其能够最小化对流动池表面的非特异性吸附而被选用（同时结合PEG修饰）。溶解的脂质母液可分装后于-20 ˚C保存，最长可达12个月。
  2. 使用氯仿清洗有机溶剂专用玻璃注射器，然后将200 µL（最终所需体积的10%）脂质母液转移至玻璃小瓶中。
  3. 用极轻微的压缩氮气流吹扫玻璃小瓶，使氯仿蒸发。在蒸发接近结束时略微增加气流压力，以确保完全去除所有残留的氯仿。
    注意：在蒸发过程中倾斜并旋转小瓶，使脂质在瓶壁上形成均匀的白色薄膜。
  4. 将未加盖的小瓶置于真空环境中过夜。
  5. 向干燥的脂质膜中加入2 mL脂质缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，100 mM NaCl），盖紧瓶盖。室温（RT）孵育至少1小时，并涡旋振荡至完全溶解。
  6. 将溶液转移至5 mL聚苯乙烯圆底试管中，在冰上使用微探头超声仪进行超声处理，参数如下：振幅 = 50，处理时间 = 1.5 min，脉冲 = 15 s，间歇时间 = 2 min。超声后溶液应变得澄清（总能量 = 1,500–2,000 J）。
  7. 使用0.22 µm PVDF针头过滤器过滤溶液，并将脂质储备液于4 ˚C保存，最长可保存1个月。

2. 双链DNA底物的制备

  1. 将λ-DNA储备液（500 μg/mL）加热至65 ˚C。
  2. 配制退火/连接混合液，包含：1.6 pM的λ-DNA，每种寡核苷酸（BioL：5'Phos-AGG TCG CCG CCC-3Bio 和 DigR：5'Phos-GGG CGG CGA CCT-3Dig_N）过量100倍（160 pM），以及60 µL的10x T4连接酶反应缓冲液（总体积为600 µL）。
    注意：BioL和DigR寡核苷酸分别被生物素化（Bio）和修饰了地高辛（Dig）。生物素化可通过链霉亲和素连接将DNA分子结合到生物素化的脂质上。Dig修饰则可通过结合在支座上涂覆的抗Dig抗体与Dig基团实现双端锚定。
  3. 将反应体系在65 ˚C孵育10分钟，使寡核苷酸退火至λ-DNA的cos末端，然后缓慢冷却至室温。
  4. 加入5 µL T4 DNA连接酶，在室温下孵育过夜。
    注意：退火和连接步骤也可在热循环仪中进行。
  5. 通过加入300 µL PEG-8000溶液（30% w/v PEG-8000 和 10 mM MgCl2）沉淀λ-DNA。在4 ˚C孵育至少1小时。
  6. 在室温下以14,000 x g离心5分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。可选步骤：用500 µL预冷的70%乙醇洗涤沉淀一次。
  7. 将沉淀重悬于40 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA [pH 8.0]）中。

3. 铬图案的纳米制造

  1. 使用台式钻床和直径为1.4 mm的金刚石涂层钻头，在一块1" × 3"的石英显微镜载玻片中心钻两个孔（间距约3 cm），钻孔位置几何结构参见图1。
  2. 将钻好孔的载玻片浸入200 mL Piranha溶液（75%浓硫酸[97%]和25%过氧化氢）中进行清洗，孵育30分钟。
    注意：必须格外小心，避免溶液接触皮肤。配制该溶液时，应将冷的过氧化氢极其缓慢地加入浓硫酸中。Piranha废液须按规定倒入指定的废液容器中妥善处理。
  3. 用200 mL双蒸水浸泡载玻片进行冲洗，重复两次以彻底去除残留的Piranha溶液。用温和的压缩氮气流吹干载玻片。
  4. 使用旋涂仪（4,000 rpm，45秒，升速为300 rpm/s），按以下步骤在洁净的载玻片上涂覆光刻胶和导电聚合物：
    1. 在载玻片上涂覆一层3%（w/v）的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA；分子量24.3K；溶于苯甲醚）。
    2. 在载玻片上涂覆一层1.5%（w/v）的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA；分子量495K；溶于苯甲醚）。
    3. 在载玻片上涂覆一层用于电子束光刻的抗静电剂。
  5. 使用配备纳米图形生成系统软件的扫描电子显微镜，通过电子束光刻技术在已涂覆的载玻片上写入障碍物和基座的自定义图案。
  6. 首先用双蒸水冲洗掉电子束光刻所用的抗静电剂，然后将载玻片放入含有50 mL显影液（75%甲基异丁基酮[MIBK]和25%异丙醇；保持在-20 ˚C冷藏）的离心管中，在冰浴中超声处理1分钟（低功率）。
  7. 用异丙醇冲洗掉显影液，并用温和的压缩氮气流吹干。
  8. 使用电子束蒸发仪，以0.5 Å/s的速率在已图案化的表面沉积一层250 Å厚的铬层。
  9. 用喷瓶中的丙酮去除铬层及残留的PMMA，随后将载玻片在丙酮浴中进行超声处理10分钟。再用喷瓶中的丙酮清洗一次。
  10. 为防止残留丙酮产生沉积物，用异丙醇冲洗载玻片，并用温和的压缩氮气流吹干。

4. 流通池的组装

  1. 将一块 35 mm × 5 mm 的矩形纸模板（覆盖铬图案以及预先钻好的进出口孔）放置在石英载玻片上，图案面朝上（图 1A）。
  2. 在石英载玻片上覆盖一层双面胶带（厚度 1 mm），覆盖住纸模板，然后使用剃刀片切割出矩形纸模板的形状（图 1A）。
  3. 将盖玻片置于双面胶带上，并轻轻按压，使盖玻片与胶带密封（图 1A）。盖玻片与载玻片之间由双面胶带密封形成的空隙即为微流控腔室。
    注意：盖玻片与载玻片之间的密封必须足够严密，以防止实验过程中发生泄漏。
  4. 将盖玻片-载玻片夹心结构置于两块玻璃载片之间，并在四边使用文件夹夹子固定，以均匀分布压力。将整个组件放入真空烘箱中，在 135 ˚C 下加热 60 分钟，使双面胶带熔化并完成腔室的密封。
  5. 从烘箱中取出后，卸下文件夹夹子和玻璃载片。
  6. 使用热熔胶枪将微流控接口连接至预先钻好的进出口孔：将组装好的部件放置在加热块（220 ˚C）上 1 分钟，取下后小心施加轻压，确保微流控接口完全密封。待胶完全固化后再进行后续操作。
    注意：组装好的流动池可置于 50 mL 离心管中，并在真空条件下保存。

5. 双链DNA帘的组装

  1. 使用两个10 mL注射器，将进样/出样管路连接至流动池微流控端口，并用20 mL双蒸水清洗腔室。
  2. 在流动池两侧各连接一个装有双蒸水的10 mL注射器，施加推/拉力使水在进样和出样注射器之间流动。此步骤可去除流动池中的所有气泡。
  3. 用3 mL脂质缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，100 mM NaCl）清洗腔室。
    注意：确保所有与流动池的连接均为液滴对液滴连接，以避免将气泡引入流动池。
  4. 将40 µL脂质体溶液与1 mL脂质缓冲液混合。向流动池中注入300 µL脂质溶液，孵育5分钟。重复该注入和孵育步骤2次。
    注意：每次将注射器连接至流动池时，交替使用进样/出样端口进行注入。
  5. 用3 mL脂质缓冲液清洗腔室，并孵育15分钟。
    注意：此孵育时间可根据实验安排在5分钟至2小时之间调整，最终的DNA帘结构组装效果无明显差异。
  6. 将40 µL浓度为1 mg/mL的抗地高辛素原液与200 µL脂质缓冲液混合。注入100 µL该溶液，孵育10分钟。重复该注入和孵育步骤1次，然后用3 mL脂质缓冲液清洗。
    注意：此步骤仅适用于双锚定dsDNA帘实验。单锚定dsDNA帘实验可跳过此步骤。
  7. 用3 mL BSA缓冲液（40 mM Tris-HCl [pH 8.0]，2 mM MgCl2，1 mM DTT，0.2 mg/mL BSA）清洗腔室。
  8. 将10 µL浓度为1 mg/mL的链霉亲和素原液与990 µL BSA缓冲液混合。分两次分别注入400 µL，每次注入后孵育10分钟。
  9. 用3 mL BSA缓冲液清洗腔室，以去除未结合的链霉亲和素。
  10. 将25 ng的dsDNA底物原液稀释至1 mL BSA缓冲液中。每次缓慢注入200 µL DNA溶液，每次注入后孵育5分钟。所需DNA量可根据具体实验类型进行优化。
  11. 将流动池安装至显微镜载物台上，并根据需要调节焦距。
  12. 将输入和输出端口连接至由注射泵和高压切换阀组成的样品注入系统。
  13. 以0.8 mL/min的流速持续用BSA缓冲液清洗腔室5分钟，使DNA双端锚定于基座上（锚定长度为12 µm）。
    注意：可能需要调整流速和时间以优化不同双锚定长度的条件。此步骤仅适用于双锚定DNA帘实验。单锚定dsDNA帘实验可跳过此步骤。
  14. 此时DNA帘已准备就绪，可进行实验。

6. 流通池的回收

  1. 使用刀片小心移除微流控端口和盖玻片之前，先将载玻片浸入乙醇中至少 30 分钟。妥善处理盖玻片，并清除微流控端口上残留的胶水，以便重复使用。彻底擦洗载玻片上的胶残留物。
    注意：操作时注意不要划伤载玻片中心的图案区域。
  2. 用双蒸水彻底冲洗载玻片，并在 2% 碱性液体石英清洗剂中浸泡过夜，同时搅拌。
  3. 用双蒸水彻底冲洗载玻片，然后在 2% 碱性液体石英清洗剂溶液中于 80 ˚C 下搅拌处理 1 小时，随后在 45 ˚C 下超声处理 15 分钟。
  4. 用双蒸水彻底冲洗载玻片，然后在 1 M NaOH 中搅拌浸泡 30–60 分钟。
  5. 用双蒸水彻底冲洗载玻片，然后将其浸入异丙醇中，并在 45 ˚C 下超声处理 15 分钟。
  6. 用乙醇彻底冲洗载玻片，并在乙醇中搅拌浸泡 1 小时。
  7. 将载玻片放入真空烘箱中，在 135 ˚C 下干燥 1 小时。此时载玻片已准备好重新组装为流动池。

结果

上述内容描述了在研究DNA修复中间体中蛋白质-DNA相互作用时，单端和双端固定的dsDNA幕的制备、组装及成像方法。图1A展示了流动池中的所有组件，按其组装顺序分层排列。图1B描绘了单端或双端固定DNA幕的示意图。使用脂质双层对流动池表面进行钝化处理。DNA幕由一端固定在脂质层上、并在铬屏障处排列整齐且垂直于流动方向的平行DNA分子阵列组成。对于双端固定的DNA幕，DNA的另一端通过地高辛（Digoxigenin）与抗地高辛（anti-Digoxigenin）的相互作用固定在基座上，从而可在无流动条件下进行成像，同时保持DNA处于伸展状态。dsDNA可用荧光染料YoYo1染色，并通过全内反射荧光显微镜（TIRF）进行观察。图2A显示了一幅典型的YoYo1染色双端固定DNA幕的宽场成像图。

DNA幕实验采集的时间序列图像通常首先在ImageJ中对每个感兴趣的DNA分子生成延时图像，该图像在纵轴上表示沿DNA分子的位置，横轴表示时间。图2B为代表性延时图像，显示了酵母切除机器GFP-Sgs1（不可见）、Top3-Rmi1和Dna2在单链DNA结合蛋白RPA-mCherry（品红色）和ATP存在条件下，对YoYo1染色的单端固定的λ-DNA（绿色）进行切除的过程。随着Sgs1-Dna2从游离末端对双链DNA进行切除，YoYo1信号随时间逐渐减弱。与此同时，mCherry信号与正在生成单链DNA的DNA末端共定位。通过量化YoYo1信号减弱轨迹的斜率，可提取出与切除过程相关的生物物理特征，如切除速度和持续性。图2C和D分别展示了Sgs1-Dna2介导切除的速度和持续性的分布情况。

DNA底物制备和脂质双层设置示意图；组装步骤和拴系方法展示。
图1：流动池组装和DNA幕的示意图。 （A）流动池组装的逐步示意图。将双面胶带置于石英载玻片顶部，使用纸模板从中部切出一个矩形通道，并用盖玻片密封顶部，形成一个腔室。（B） 完全组装的DNA幕示意图。中间面板展示单端拴系的流动池，而底部面板展示双端拴系的流动池。 请点击此处查看此图的放大版本。

DNA复制动态，屏障-基座装置（A），荧光叠加图像（B），速度直方图（C），存活概率图（D）
图 2：单分子DNA幕可视化与分析。（A）用YoYo1染色的双端锚定λ-DNA幕的代表性宽场图像（绿色）。（B）代表性明暗图，显示在预结合GFP-Sgs1（不可见）存在下，加入Dna2后，在RPA-mCherry（品红色）和2 mM ATP存在时，YoYo1标记的dsDNA（绿色）的切除过程。（C）和（D）为通过量化YoYo1信号随时间衰减的速率和程度，获得的Sgs1-Dna2介导的dsDNA切除的速度分布和持续性曲线。图（B）、（C）和（D）改编自Xue等19。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

DNA幕技术已被证明是研究多种DNA修复过程的多功能平台13,14,15,16。在整个实验过程中，通过持续的缓冲液流动或双端固定于基座上，DNA分子可在表面附近保持伸展状态，从而实现对修复中间体上蛋白质-DNA相互作用的单分子水平全内反射荧光显微镜（TIRFM）成像。该方法提高了实验通量和可预测性，因为数百个DNA分子有序地排列在纳米加工的屏障处，而非非特异性地附着在表面，这进一步有利于大规模数据集的处理。

对获得的时间序列图像进行仔细分析，可定量测量蛋白质-DNA相互作用（例如结合寿命、位置、化学计量比、解离动力学、易位速率、马达蛋白的持续性，以及蛋白质之间和/或DNA之间的共定位与相互作用）。与其他单分子成像技术相比，DNA幕技术在通量上的主要优势是以建立初始设置所需的技术为代价的；其他技术要么将DNA分子直接固定在表面，要么在商用仪器中结合共聚焦成像与力操控13,14,15,16。然而，一旦完成建立，便可在同一个流动池中同时对数百个分子进行数据采集，从而显著节省数据收集所需的时间。

与许多其他单分子成像方法一样，能否制备出洁净的表面在很大程度上决定了用户能否可靠地组装DNA幕。在此情况下，洁净的表面不仅要求从干净的载玻片开始，还必须确保在建立任何流体连接时不会将微小气泡引入腔室。首先，关于载玻片的清洁，上述第6节中详述的步骤应足以作为常规清洁流程。建议使用经过过滤的溶液和缓冲液。其次，在将流动池连接至缓冲液注入系统时，必须采用液滴对液滴的方式连接，以避免引入气泡。用于配制缓冲液的双蒸水进行脱气处理可能会有帮助。同时建议在注射过程中仔细观察，确保无气泡存在。如果在气泡到达中心图案化区域之前已将其引入，可通过从相对一侧的微流控端口注入缓冲液，将气泡推出以补救。

在任何基于荧光的实验中，另一个需要重点考虑的因素是信噪比。观察单个荧光蛋白（例如GFP）的关键在于表面清洁。经过长期使用后，蛋白质聚集体通常会在铬质屏障和基座上积累。因此，如果在添加荧光蛋白之前已在屏障处观察到强烈的荧光信号，建议将载玻片浸入Piranha溶液中处理10分钟。处理时间应保持较短，以避免腐蚀铬结构。Piranha溶液清洗后，应接着进行常规清洗步骤。

由于电子束光刻对设备、设施以及材料科学领域专业知识的要求较高，纳米制造可能具有挑战性。作为替代方案，已开发出一种基于紫外光刻技术的DNA幕铬特征结构制造方法20。本实验方案还提供了一种用于在12 μm处双端固定λ DNA的基本图案（见补充信息）。该图案设计的多个方面可根据不同的实验需求进行调整，包括屏障与基座之间的距离、屏障中相邻孔之间的间距（以控制DNA密度）、以及基座的形状和尺寸（以优化双端固定效率并最小化双端固定长度的不确定性）。其他实际挑战可能还包括蛋白质荧光标记策略的选择、手动数据分析中偏差的最小化，以及开发脚本以实现更高效的数据处理。

尽管本文所述方案涉及双链DNA（dsDNA）底物，但基于单链DNA（ssDNA）的DNA幕技术也已被广泛使用13,14,15,16。制备ssDNA底物需利用M13单链DNA质粒进行滚环复制，并使用生物素标记的引物13。组装ssDNA幕还需使用尿素和单链DNA结合蛋白RPA，以消除二级结构并拉伸ssDNA底物13。此外，DNA幕技术也可能拓展至使用RNA或DNA/RNA杂合分子，用于研究与RNA相互作用的蛋白质。目前，DNA幕平台在组装过程中可进一步实现自动化（如第5节所述），其中大部分步骤为重复注入一组标准缓冲液，自动化将有助于同时开展多个实验，提高效率。此外，开发一套统一的、可能基于机器学习的数据分析脚本工具包，将进一步加快数据处理速度，并最大限度减少人为偏差。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢格林实验室的历届和现任成员在开发、优化和讨论DNA幕技术方案以及对本文稿提出意见方面所做的贡献。本工作得到了美国国家科学基金会（MCB1154511，授予E.C.G.）和美国国立卫生研究院（R01CA217973，授予E.C.G.）资助项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纳米图形生成系统软件JC Nabity Lithography SystemsN/ANPGS 
PFA 管，天然 1/16" 外径 × 0.020" 内径IDEX1512L
聚甲基丙烯酸甲酯，无规（24.3K 分子量）Polymer Source Inc.P9790-MMA
石英显微镜载玻片G. Finkenbeiner Inc.N/A1" × 3" × 1 mm 厚
扫描电子显微镜FEIN/ANova Nano SEM 450
3M 双面胶带，3/4 × 300 英寸3MN/A
超声波破碎仪MisonixS-4000用于脂质制备
超声波破碎仪Branson1800用于超声处理载玻片
链霉亲和素（来自链霉亲和菌 Streptomyces avidinii）Sigma-AldrichS4762溶于 1× PBS，终浓度为 1 mg/mL
硫酸Avantor - J.T.Baker9681-01
注射泵KD Scientific78-0200
注射器，500 µL，型号 750 RN SYR，大号可拆卸针头，22 号，2 英寸，尖端类型 2Hamilton80830专用于脂质操作
T4 DNA 连接酶（400,000 单位/mL）NEBM0202S

参考文献

  1. Kowalczykowski, S. C. An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 016410(2015).
  2. Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: globocan sources and methods. International Journal of Cancer. 144, 1941-1953 (2018).
  3. Li, X., Heyer, W. D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Research. 18, 99-113 (2008).
  4. Michel, B., Baoubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair. 6, 967-980 (2007).
  5. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63, 349-404 (1999).
  6. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  7. Mason, J. M., et al. RAD54 family translocases counter genotoxic effects of RAD51 in human tumor cells. Nucleic Acids Research. 43, 3180-3196 (2015).
  8. Wold, M. S. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annual Review of Biochemistry. 66, 61-92 (1997).
  9. Bianco, P. R. The tale of SSB. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 127, 111-118 (2017).
  10. Hopfner, K. P., Gerhold, C. B., Lakomek, K., Wollmann, P. Swi2/Snf2 remodelers: hybrid views on hybrid molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 22, 225-233 (2012).
  11. Shah, P. P., et al. Swi2/Snf2-related translocases prevent accumulation of toxic Rad51 complexes during mitotic growth. Molecular Cell. 39, 862-872 (2010).
  12. Wright, W. D., Heyer, W. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D loop formation. Molecular Cell. 53, 420-432 (2014).
  13. Ma, C. J., Steinfeld, J. B., Greene, E. C. Single-Stranded DNA Curtains for Studying Homologous Recombination. Methods in Enzymology. 582, 193-219 (2017).
  14. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160, 856-869 (2015).
  15. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural Molecular Biology. 16, 1056-1062 (2009).
  16. Kaniecki, K., De Tullio, L., Greene, E. C. A change of view: homologous recombination at single-molecule resolution. Nature Reviews Genetics. 19, 191-207 (2018).
  17. Redding, S., et al. Surveillance and Processing of Foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas System. Cell. 163, 854-865 (2015).
  18. Lee, J. Y. Base triplet stepping by the Rad51/RecA family of recombinases. Science. 349, 977-981 (2015).
  19. Xue, C., et al. Regulatory control of Sgs1 and Dna2 during eukaryotic DNA end resection. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (13), 6091-6100 (2019).
  20. Gallardo, I. F., Finkelstein, I. J. High-Throughput Universal DNA Curtain Arrays for Single-Molecule Fluorescence Imaging. Langmuir. 31 (37), 10310-10317 (2015).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

DNA DNA
视频即将推出

相关文章