经大池双次直接注射血液作为蛛网膜下腔出血模型

摘要

本方案中，我们描述了一种通过向小脑延髓池两次注射自体全血来建立标准化的蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型的方法。这种双次注射操作具有高度的标准化，属于一种中度至急性SAH模型，且在死亡率方面相对安全。

摘要

在脑卒中类型中，继发于脑动脉瘤破裂的蛛网膜下腔出血（SAH）约占5-9%，但其导致的脑卒中相关死亡率约为30%，且在神经功能预后方面具有显著的致残率。SAH后常出现迟发性脑血管痉挛（CVS），多与迟发性脑缺血相关。目前已有多种SAH动物模型被应用，包括血管内穿刺法、向小脑延髓池或视交叉前池直接注射血液等，每种模型各有其优缺点。本文介绍一种通过两次向小脑延髓池定量注射自体全血建立的标准化小鼠SAH模型。简言之，首先称量小鼠体重，随后通过吸入异氟烷进行麻醉。然后将动物置于加热垫上呈仰卧位，维持直肠温度在37 °C，并固定于立体定位仪上，颈部弯曲约30°。定位完成后，使用显微操作器将一根细长玻璃微移液管的尖端垂直接触枕骨大孔膜，该微移液管内充满来自同性别、同龄（C57Bl/6J）小鼠颈动脉采集的同源动脉血。随后向小脑延髓池注入60 µL血液，接着将动物体位向下倾斜30°，持续2分钟。第二次向小脑延髓池注射30 µL血液在首次注射后24小时进行。每只动物均进行每日个体化监测（包括体重和健康状况的仔细评估）。该方法可实现血液分布的可预测性和高度可重复性，可能伴随颅内压升高，这一效应可通过等量人工脑脊液（CSF）注射模拟，且该模型属于急性至轻度SAH模型，死亡率较低。

引言

蛛网膜下腔出血（SAH）占所有中风病例的5%左右，是一种相对常见的疾病，年发病率为每10万人中7.2至9例，死亡率因研究不同而异，介于20%至60%之间^1,2,3在急性期，死亡率主要归因于出血严重程度、再出血、脑血管痉挛（CVS）和/或内科并发症⁴在幸存者中，早期脑损伤（EBI）与出血向脑实质的扩展以及颅内压的急剧升高相关，这些因素可能导致原发性脑缺血。⁵ 约10%至15%的病例中立即死亡⁶。在初始之后 "急性" SAH 的阶段，预后取决于是否发生 "继发性" 或迟发性脑缺血（DCI），在近40%的患者中可通过脑部计算机断层扫描检出，而在磁共振成像（MRI）后可在高达80%的患者中检出^7,8除了大多数蛛网膜下腔出血患者在动脉瘤破裂后4至21天内发生脑血管痉挛（CVS）外，迟发性脑缺血（DCI）⁹ 可能由微血栓形成、脑灌注减少、神经炎症和皮质扩散性抑制（CSD）继发的多因素弥漫性脑损伤引起^10,11,12,13这影响了30%的蛛网膜下腔出血（SAH）幸存者，损害包括视觉记忆、言语记忆、反应时间以及执行功能、视空间功能和语言功能在内的认知能力。¹⁴ 影响日常生活¹⁵目前，预防蛛网膜下腔出血（SAH）患者发生脑血管痉挛（CVS）和/或认知功能不良结局的标准治疗策略主要基于阻断Ca²⁺²⁺ 信号传导与血管收缩通过使用 Ca²⁺ 通道阻滞剂如尼莫地平。然而，近期针对血管收缩的临床试验揭示了患者神经功能预后与预防脑血管痉挛之间存在分离现象¹⁶，提示蛛网膜下腔出血的长期后果涉及更为复杂的病理生理机制。因此，迫切需要更深入地了解伴随蛛网膜下腔出血发生的各种病理事件，并建立有效且标准化的动物模型，以评估创新性治疗干预措施。

导致人类蛛网膜下腔出血（SAH）的颅内动脉瘤破裂，在临床前动物模型中可能难以准确模拟。目前，可通过穿刺小脑中动脉（血管内穿刺模型）来初步测试动脉瘤破裂和SAH的情况，该模型可在小鼠中引发脑血管痉挛（CVS）以及感觉运动功能障碍^17,18。由于该模型无法控制出血的发生时机及血液扩散范围，研究人员已在啮齿类动物中开发出其他无需血管内破裂即可建立SAH模型的方法。更具体地说，这些方法包括通过单次或双次向枕大池¹⁹注射动脉血，或单次向前交叉池注射动脉血²⁰，直接将血液注入蛛网膜下腔。这类无需血管内破裂的小鼠模型主要优势在于能够可重复地精确控制手术操作过程以及注入血液样本的质量和数量。相较于血管内穿刺模型，该模型另一优势在于能更好地维持动物的整体健康状态。事实上，该手术的侵入性较低，技术难度也低于诱导颈动脉壁破裂所需的手术操作。在后一种模型中，动物需要进行气管插管并接受机械通气，同时将单丝线经由颈外动脉插入，并推进至颈内动脉，这一过程可能因导丝路径造成血管阻塞而引发短暂性缺血。因此，与血管内穿刺模型相比，双次注射模型相关的手术共病率（濒死状态、严重疼痛和死亡）显著降低。除了能更稳定地模拟SAH外，双次直接注射法还符合实验动物福利原则（减少麻醉时间、手术组织损伤带来的疼痛及动物应激反应），并可最大限度减少实验方案研究和人员培训所需的动物总数。

此外，该方法可用于转基因小鼠，从而实现对同一流程的应用，有助于深入理解蛛网膜下腔出血（SAH）的病理机制，并为潜在治疗化合物的比较测试提供可能。本文介绍一种标准化的小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型，即在6至8周龄的雄性C57Bl/6J小鼠中，通过向小脑延髓池每日两次连续注射自体动脉血建立模型。该模型的主要优势在于相较于血管内穿刺模型，能够更好地控制出血量，并可在不显著升高颅内压的情况下强化出血事件²¹。近期，向小脑延髓池进行两次直接注血的方法已在小鼠模型中被充分描述，涵盖了实验操作及病理生理学方面的诸多问题。事实上，我们近期已证实，在此模型中，SAH后第3天至第10天（D3–D10）可观察到大脑主要动脉（基底动脉（BA）、大脑中动脉（MCA）和大脑前动脉（ACA））的脑血管痉挛（CVS）、脑血管内纤维蛋白沉积以及细胞凋亡现象，同时伴有脑旁血管脑脊液循环障碍及小鼠感觉运动功能和认知功能的损害，上述表现可持续至SAH后10天²²。因此，该模型已被充分掌握、验证并表征，适用于研究SAH后短期及长期的病理事件，理想情况下可用于新靶点的前瞻性鉴定，以及针对SAH相关并发症的有效治疗策略的研究。

方案

所有操作均在 H. Castel 的监督下进行，遵循法国伦理委员会以及欧洲议会关于用于科学目的动物保护的 2010/63/EU 指令和欧洲理事会指南。本项目已获得当地 CENOMEXA 及国家动物研究与实验伦理委员会的批准。使用 8 至 12 周龄的雄性 C57Bl/6J Rj 小鼠（Janvier），在标准环境条件下饲养：温度 22 °C ± 1 °C，12 小时光照/12 小时黑暗循环，水和食物可自由获取。

1. 蛛网膜下腔出血手术的设置及注射前准备

1. 手术开始前，使用显微拉针仪拉制足够数量的玻璃毛细管。注射用毛细管的内径应为0.86 mm，外径应为1.5 mm。
2. 为假手术组准备人工脑脊液（aCSF）。
   1. 配制含有119 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM NaH₂PO₄、1.3 mM MgCl₂、10 mM葡萄糖、26.2 mM NaHCO₃的H₂O溶液，调节pH至7.4。
   2. 用95% O₂和5% CO₂混合气体对aCSF通气15分钟，然后加入2.5 mM CaCl₂。
   3. 使用0.22 µm滤器装置对充氧后的aCSF进行灭菌。aCSF溶液在4 °C下可稳定保存3-4周。若出现污染（溶液变浑浊）或沉淀形成，则应弃用并重新配制新鲜aCSF。
3. 从同源小鼠供体采集血液
   1. 沿气管分离颈总动脉，并通过穿刺颈总动脉采集尽可能多的血液。
   2. 实际操作中，将小鼠放入麻醉舱，通入5%异氟烷直至动物失去意识。
   3. 通过夹闭一只后肢检查反射是否消失，以确认可开始手术实验操作。
   4. 使用26 G针头将肝素溶液（肝素钠）涂布于1 mL注射器内壁，以防止后续步骤中血液凝固。
   5. 将动物仰卧位固定，四肢分开，鼻部置于麻醉面罩中（以2%至2.5%异氟烷维持麻醉）。
   6. 纵向解剖肩胛舌骨肌，沿气管分离颈总动脉。动脉暴露后，在显微解剖钩和镊子辅助下将针头朝向心脏方向插入，通过穿刺颈总动脉采集尽可能多的血液（每只蛛网膜下腔出血小鼠需60 µL）。
   7. 采血完成后，立即通过颈椎脱位法处死已麻醉的供体小鼠。

2. 动物（8-10周龄C57BL/6J雄性小鼠）准备

1. 使用电子天平精确称量每只小鼠的体重。在本研究中，小鼠在手术前的体重应在 20 至 25 克范围内。
2. 如前所述（见步骤 1.3.2 和 1.3.3），对将要进行手术的小鼠实施麻醉。
3. 使用合适的电动剃毛器剃除颈部及两耳之间的毛发。
4. 将动物以俯卧位固定在立体定位仪上，四肢分开，鼻部置于麻醉面罩中（以 2% 至 2.5% 异氟烷维持麻醉）。
5. 检查小鼠是否已进入睡眠状态，并确认其头部被妥善固定。
6. 使用 26 G 针头在小鼠下背部皮下注射 100 µL 布托啡诺（0.1 mg/kg），以预防苏醒后疼痛。
7. 使用保护性液体凝胶防止角膜干燥，并通过自动温控电热毯维持直肠温度在 37 °C。
8. 使用消毒液（聚维酮碘或氯己定）和无菌棉签处理后颈部已剃毛的区域。
9. 对所有接触已准备皮肤/皮下组织的器械进行预灭菌处理（200 °C 加热 2 小时），并以无菌方式操作。

3. 蛛网膜下腔出血（SAH）诱导

1. 第一天（D-1）
   1. 用精细剪刀在动物后颈部做1 cm切口，沿中线分离肌肉以暴露小脑延髓池。
   2. 用精细剪刀剪去空玻璃移液管的尖端，然后将其连接至带有柔性硅胶接头的注射器上。
   3. 使用精密微量移液器将60 µL血液或人工脑脊液（aCSF）（分别用于蛛网膜下腔出血（SAH）组或假手术组）转移至0.5 mL离心管中。
   4. 用玻璃移液管吸取60 µL血液（SAH组）或60 µL aCSF（假手术组）。
   5. 注射时，将移液管安装在立体定位仪的夹环或蓝丁胶上，并通过微调装置缓慢将移液管尖端移至小脑延髓池膜处。
   6. 使用立体定位仪的微调装置，缓慢将移液管尖端穿过枕骨下膜进入小脑延髓池。
   7. 将预先装有血液或aCSF的移液管连接至已准备就绪的注射器，以进行压力注射。
   8. 以约10 µL/min的低速推动注射器活塞进行注射，以避免颅内压急剧升高。
   9. 注射过程中，密切监测动物的呼吸频率和直肠温度。
   10. 注射结束后，通过微调装置小心撤出移液管，并肉眼确认撤出过程中无液体渗漏。
   11. 使用可吸收性止血材料实现止血，并用编织的不可吸收缝合线缝合两针。
   12. 手术后立即隔离动物，将其置于倾斜卧位，并用保温毯覆盖，置于开放盒中直至恢复。
2. 诱导的第二天（D0）
   1. 24小时后，再次诱导麻醉（参见步骤1.3.2和1.3.3）。皮下注射100 µL丁丙诺啡（0.1 mg/kg），并使用保护性液体凝胶防止角膜干燥（参见步骤2.7和2.8）。
   2. 将动物再次安装在立体定位仪上，操作同前一日。
   3. 使用显微剪刀小心拆除缝线。
   4. 按前述方法准备枕骨下膜，并用无菌棉棒在颈部剃毛区域涂抹消毒液。
   5. 以低速注射30 µL血液或aCSF（参见步骤3.1.2至3.1.8）。监测呼吸频率和直肠温度。
   6. 注射结束后，小心撤出移液管，并确认撤出过程中无血液渗漏。
   7. 实现止血，并用编织的可吸收缝合线缝合两针。

4. 术后随访与实验结束

1. 手术后立即取出小鼠，将其置于开放的盒子中，仰卧位，背部覆盖保温毯，以利于恢复。
2. 称重并每日仔细观察每只小鼠的行为，直至处死（例如术后第7天）。
3. 在人道终点中，显著的体重减轻（>通常会观察到重量的15%。A "驼背" 姿势异常、动作迟缓、伏卧不起、疼痛相关的异常叫声和/或明显的攻击性行为也是动物遭受痛苦的重要指征。一旦出现上述任何一种或多种指征，将在数小时内加强对该动物的监测。若动物福利状况在48小时内恶化或未见改善，则视为已达到无法忍受的痛苦程度，需实施安乐死。
4. 在选定时间点，通过断头法处死麻醉小鼠，并取出大脑用于后续分析。
5. 在异氟烷麻醉（5%）后实施安乐死（断头）。

结果

实验时间线、操作步骤、随访及死亡率
图1A 和 图1B 总结了通过两次脑池内注射血液建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型的实验方案。简而言之，在SAH诱导的第一天（D-1），向SAH组小鼠小脑延髓池内注射60 µL来自同源小鼠的血液，假手术组（sham）则注射60 µL人工脑脊液（aCSF）。次日（D0），SAH组小鼠注射30 µL同源小鼠血液，假手术组注射30 µL aCSF。术后24小时处死小鼠并进行脑组织分析，可观察到血液在血管周围间隙的分布情况，如图1C所示。为评估从D1至终点的整体健康状况，自D1至D8每日监测小鼠体重，结果显示SAH组小鼠从D1至D8的体重增长显著低于假手术组（图1D），提示SAH后存在持续较久的恢复过程及长期的病理变化。术后死亡率为26.7%（截至D7），大多数动物死亡发生在术后D1或D4（

讨论

尽管在过去二十年中，蛛网膜下腔出血（SAH）领域的研究强度不断加大，并且血管内治疗和药物治疗等治疗策略不断发展，但患者在入院后第一周内的死亡率仍然很高，并在随后的6个月内达到约50%^24,25。目前这一通过每日两次向小脑延髓池注射同源动脉血建立的临床前模型，因其有效性以及与较低死亡率相关而得到广泛认可。事实上，在SAH啮齿类动物模型中，报道的死亡率范围较广：单次向小脑延髓池注血模型的死亡率为0–16%^{26,27,28,29,30,31,32...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可吸收止血剂	Ethicon	Surgicel
可吸收缝合线	Ethicon	Vicryl 5.0
自动温控电热毯	Harvard Apparatus	50-7087-F
毛细管固定用蓝丁胶	UHU	Patafix
电子天平	Denver Instrument	MXX-2001
玻璃毛细管	Harvard Apparatus	GC150F-15	内径 0.86 mm 外径 1.5 mm
异氟烷蒸发器	Phymep	V100
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Company	P-97
26 G 针头	BD microbalance	300300
不可吸收缝合线	Peters surgical	Filapeau 4.0
立体定位仪	David Kopf instruments	Model 902
外科手术器械	Kent scientific	钳子、显微剪刀、细剪刀
20 mL 注射器 TERUMO	Thermofisher	11866071