经大池双次直接注射血液作为蛛网膜下腔出血模型

摘要

本方案中，我们描述了一种通过向小脑延髓池两次注射自体全血来建立标准化的蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型的方法。这种双次注射操作具有高度的标准化，属于一种中度至急性SAH模型，且在死亡率方面相对安全。

摘要

在脑卒中类型中，继发于脑动脉瘤破裂的蛛网膜下腔出血（SAH）约占5-9%，但其导致的脑卒中相关死亡率约为30%，且在神经功能预后方面具有显著的致残率。SAH后常出现迟发性脑血管痉挛（CVS），多与迟发性脑缺血相关。目前已有多种SAH动物模型被应用，包括血管内穿刺法、向小脑延髓池或视交叉前池直接注射血液等，每种模型各有其优缺点。本文介绍一种通过两次向小脑延髓池定量注射自体全血建立的标准化小鼠SAH模型。简言之，首先称量小鼠体重，随后通过吸入异氟烷进行麻醉。然后将动物置于加热垫上呈仰卧位，维持直肠温度在37 °C，并固定于立体定位仪上，颈部弯曲约30°。定位完成后，使用显微操作器将一根细长玻璃微移液管的尖端垂直接触枕骨大孔膜，该微移液管内充满来自同性别、同龄（C57Bl/6J）小鼠颈动脉采集的同源动脉血。随后向小脑延髓池注入60 µL血液，接着将动物体位向下倾斜30°，持续2分钟。第二次向小脑延髓池注射30 µL血液在首次注射后24小时进行。每只动物均进行每日个体化监测（包括体重和健康状况的仔细评估）。该方法可实现血液分布的可预测性和高度可重复性，可能伴随颅内压升高，这一效应可通过等量人工脑脊液（CSF）注射模拟，且该模型属于急性至轻度SAH模型，死亡率较低。

引言

蛛网膜下腔出血（SAH）占所有中风病例的5%左右，是一种相对常见的疾病，年发病率为每10万人中7.2至9例，死亡率因研究不同而异，介于20%至60%之间^1,2,3在急性期，死亡率主要归因于出血严重程度、再出血、脑血管痉挛（CVS）和/或内科并发症⁴在幸存者中，早期脑损伤（EBI）与出血向脑实质的扩展以及颅内压的急剧升高相关，这些因素可能导致原发性脑缺血。⁵ 约10%至15%的病例中立即死亡⁶。在初始之后 "急性" SAH 的阶段，预后取决于是否发生 "继发性" 或迟发性脑缺血（DCI），在近40%的患者中可通过脑部计算机断层扫描检出，而在磁共振成像（MRI）后可在高达80%的患者中检出^7,8除了大多数蛛网膜下腔出血患者在动脉瘤破裂后4至21天内发生脑血管痉挛（CVS）外，迟发性脑缺血（DCI）⁹ 可能由微血栓形成、脑灌注减少、神经炎症和皮质扩散性抑制（CSD）继发的多因素弥漫性脑损伤引起

方案

所有操作均在 H. Castel 的监督下进行，遵循法国伦理委员会以及欧洲议会关于用于科学目的动物保护的 2010/63/EU 指令和欧洲理事会指南。本项目已获得当地 CENOMEXA 及国家动物研究与实验伦理委员会的批准。使用 8 至 12 周龄的雄性 C57Bl/6J Rj 小鼠（Janvier），在标准环境条件下饲养：温度 22 °C ± 1 °C，12 小时光照/12 小时黑暗循环，水和食物可自由获取。

1. 蛛网膜下腔出血手术的设置及注射前准备

1. 手术开始前，使用显微拉针仪拉制足够数量的玻璃毛细管。注射用毛细管的内径应为0.86 mm，外径应为1.5 mm。
2. 为假手术组准备人工脑脊液（aCSF）。
   1. 配制含有119 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM NaH₂PO₄、1.3 mM MgCl₂、10 mM葡萄糖、26.2 mM NaHCO₃的H₂O溶液，调节pH至7.4。
   2. 用95% O₂和5% CO₂混合气体对aCSF通气15分钟，然后加入2.5 mM CaCl₂。
   3. 使用0.22 µm滤器装置对充氧后的aCSF进行灭菌。aCSF溶液在4 °C下....

结果

实验时间线、操作步骤、随访及死亡率
图1A 和 图1B 总结了通过两次脑池内注射血液建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型的实验方案。简而言之，在SAH诱导的第一天（D-1），向SAH组小鼠小脑延髓池内注射60 µL来自同源小鼠的血液，假手术组（sham）则注射60 µL人工脑脊液（aCSF）。次日（D0），SAH组小鼠注射30 µL同源小鼠血液，假手术组注射30 µL aCSF。术后24小时处死小鼠并进行脑组织分析，可观察到血液在血管周围间隙的分布情况，如图1C所示。为评估从D1至终点的整体健康状况，自D1至D8每日监测小鼠体重，结果显示SAH组小鼠从D1至D8的体重增长显著低于假手术组（图1D），提示SAH后存在持续较久的恢复过程及长期的病理变化。术后死亡率为26.7%（截至D7），大多数动物死亡发生在术后D1或D4（

讨论

尽管在过去二十年中，蛛网膜下腔出血（SAH）领域的研究强度不断加大，并且血管内治疗和药物治疗等治疗策略不断发展，但患者在入院后第一周内的死亡率仍然很高，并在随后的6个月内达到约50%^24,25。目前这一通过每日两次向小脑延髓池注射同源动脉血建立的临床前模型，因其有效性以及与较低死亡率相关而得到广泛认可。事实上，在SAH啮齿类动物模型中，报道的死亡率范围较广：单次向小脑延髓池注血模型的死亡率为0–16%^{26,27,28,29,30,31,32.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可吸收止血剂	Ethicon	Surgicel
可吸收缝合线	Ethicon	Vicryl 5.0
自动温控电热毯	Harvard Apparatus	50-7087-F
毛细管固定用蓝丁胶	UHU	Patafix
电子天平	Denver Instrument	MXX-2001
玻璃毛细管	Harvard Apparatus	GC150F-15	内径 0.86 mm 外径 1.5 mm
异氟烷蒸发器	Phymep	V100
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Company	P-97
26 G 针头	BD microbalance	300300
不可吸收缝合线	Peters surgical	Filapeau 4.0
立体定位仪	David Kopf instruments	Model 902
外科手术器械	Kent scientific	钳子、显微剪刀、细剪刀
20 mL 注射器 TERUMO	Thermofisher	11866071