本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体(COCs)包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中;第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒(微型生物反应器)共同封装。这两种系统均可提供最佳条件,以维持卵母细胞的三维结构。
本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体(COCs)包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中;第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒(微型生物反应器)共同封装。这两种系统均可提供最佳条件,以维持卵母细胞的三维结构。
在生殖生物学中,始于人工授精和胚胎移植技术的生物技术革命,推动了辅助生殖技术的发展,例如卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)以及通过体细胞核移植实现的家畜克隆。其中,IVM技术具有特别重要的意义。该技术是为多种应用提供成熟、高质量卵母细胞的基础平台,这些应用包括缩短具有重要经济价值或濒危物种的世代间隔、人类体外生殖相关研究,以及用于细胞治疗的转基因动物生产。卵母细胞质量这一术语涵盖了其完成成熟、受精并最终产生健康后代的能力。这意味着高质量的卵母细胞对于包括IVF在内的成功受精过程至关重要。然而,要建立一种可靠的培养方法,不仅支持人类卵母细胞,还能支持其他大型哺乳动物卵母细胞的生长,仍面临诸多挑战。IVM的第一步是卵母细胞的体外培养。本研究描述了两种猪卵母细胞三维(3D)培养的方案。第一种方案中,将三维模型的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)包埋于纤维蛋白-海藻酸盐微珠互穿网络结构中,其中纤维蛋白与海藻酸盐混合物同时发生凝胶化。第二种方案中,将COCs悬浮于液滴中,并用氟乙烯丙烯(FEP;六氟丙烯与四氟乙烯的共聚物)粉末颗粒包裹,形成被称为“液态弹珠”(LM)的微型生物反应器。这两种3D培养系统均能维持稳定的气体环境以支持体外培养。同时,它们通过防止COCs扁平化及其导致的间隙连接破坏,保持了COCs的三维结构,从而维系了卵母细胞与其周围卵泡细胞之间的功能关系。
开发各种培养系统(包括三维(3D)培养系统)旨在为从卵泡中分离出的早期阶段卵母细胞提供最佳的生长和成熟条件。这对于辅助生殖技术(ART)具有重要意义,特别是考虑到越来越多女性在癌症治疗后面临不孕问题1。卵母细胞在体外条件下的成熟(IVM)已成为一项成熟的技术,主要用于家畜繁殖中的体外胚胎生成2。然而,在大多数哺乳动物物种中,即使卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的成熟率较高(范围为60至90 %)3,其发育潜能仍无法满足实际需求。这是因为通过该方式获得的受精卵即使发育至囊胚阶段的比例也较低,且移植到代孕动物体内后其妊娠至足月的存活率下降。因此,有必要提高经IVM程序处理的卵母细胞所获得胚胎的发育潜能4。为此,研究人员正在设计新的成熟培养基5,测试不同的体外培养时间6,7,并尝试在培养基中添加各种生长因子和分子8,9。
任何完整的体外成熟(IVM)系统的首要步骤是在体外培养期间为卵母细胞的可持续生长创造....
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以下实验程序已获得雅盖隆大学动物学与生物医学研究中心动物福利委员会的批准。
1. 猪卵丘-卵母细胞复合体的分离
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在使用两种IVM系统的COCs中,颗粒细胞彼此紧密黏附,且大多数回收的COCs具有完整的卵丘细胞层(图1A,B)。此外,仍有相当比例的卵丘细胞得以保留。
从卵丘-卵母细胞复合体(COCs)活力分析获得的结果证实,两种用于在三维体外条件下包封猪卵母细胞的系统均能确保最佳生长条件(图2)。在两组实验中均仅观察到高活力的卵母细胞,其中FAB组V1为13%,V2为87%,LM组V1为10%,V2为90%(表1)。
通过透射电子显微镜(TEM)观察,线粒体在卵母细胞中呈均匀分布,体外成熟(IVM)后的线粒体形态呈壳状45。仅有少数线粒体呈伸长形态,且其聚集现象偶见(图1C,D)。内质网可见,或与线粒体相关联,或游.......
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不仅维持卵母细胞体外生长,同时维持其周围卵丘细胞的生长并支持卵母细胞成熟,这对于辅助生殖技术的成功以及深入理解体细胞与卵母细胞之间的相互作用至关重要,尤其是在人类或猪等经历较长卵泡发育周期的物种中尤为如此。不断改进的体外成熟(IVM)技术正成为一种有用的工具,可用于多囊卵巢综合征(PCOS)、卵巢早衰或确定性不孕(如癌症治疗后)等情况下生育力的保存。此外,由于某些卵巢功能障碍可能由卵泡发育调控异常引起,阐明调控卵母细胞正常发育的分子与细胞机制,可为这些疾病的病理生理学机制及合理治疗提供重要见解。为在IVM过程中维持卵丘-卵母细胞复合体(COCs)三维结构的体外培养系统,需将其包封于基质或生物反应器中的步骤。本文描述了一种适用于猪卵母细胞培养的实验方案。本文所介绍的两种用于诱导猪COCs生长与发育的三维体外培养系统均操作简便,可有效调控卵母细胞和卵丘细胞的存活。
本文首次介绍了一种利用卵丘-卵母细胞复合体(COCs)包埋于纤维蛋白-海藻酸盐水凝胶微珠(FAB)中的体外培养方法,可实现卵母细胞在具有活跃细胞响应性的基质环境中进行三维生长。此前发表的基于海藻酸盐水凝胶的实验方案通常用于研.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者非常感谢:雅盖隆大学动物学与生物医学研究所发育生物学与无脊椎动物形态学系的 dr Waclaw Tworzydlo 提供透射电子显微镜(TEM)技术设施;雅盖隆大学动物学与生物医学研究所内分泌学系的 Beata Snakowska 女士提供技术协助;以及雅盖隆大学动物学与生物医学研究所细胞生物学与成像系提供的 JEOL JEM 2100HT(JEOL,东京,日本)。本研究由波兰国家科学中心资助,项目编号为 2018/29/N/NZ9/00983。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 常规 | |||
| 抗生素-抗真菌剂(100倍浓缩液)100 ml | Thermo Fisher | 15240062 | 处理培养基中终浓度为2.5%。PBS中为1%(步骤1.2) |
| DMEM/F12(500 ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | 处理培养基和成熟培养基 |
| DPBS(不含Ca、Mg),1×,500 ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS(100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 处理培养基和成熟培养基中终浓度均为10%(步骤:1.5,2.6) |
| PBS(1×,pH 7.4)500 ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS储存液(10×,pH 7.4)500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 终浓度为1×。可使用其他品牌 |
| 成熟培养基 | |||
| hCG(1瓶,10,000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| 纤维蛋白-海藻酸盐微珠 | |||
| 海藻酸盐裂解酶 | Sigma-Aldrich | A1603 | (步骤2.11.1) |
| 凝血酶 | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (步骤2.1) |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C5670 | (步骤2.1) |
| 纤维蛋白原(250 mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (步骤2.2) |
| 海藻酸钠 | Sigma-Aldrich | W201502 | (步骤2.3)用于配制海藻酸盐溶液 |
| 液态弹珠 | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| 形态学检测 | |||
| 哺乳动物细胞活力/细胞毒性检测试剂盒(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit) | Thermo Fisher | L3224 | (步骤4.1)荧光发射波长:钙黄绿素为494 nm,EthD-1为528 nm;检测波长:钙黄绿素为517 nm,EthD-1为617 nm |
| VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | 封片介质 |
| 超微结构检测 | |||
| 戊二醛溶液 | Sigma-Aldrich | G5882 | 终浓度为2.5%(步骤4.2.1) |
| LR White 树脂 | Sigma-Aldrich | L9774 | (步骤4.2.4) |
| 亚甲蓝 | Sigma-Aldrich | M9140 | (步骤4.2.5) |
| 四氧化锇 | Sigma-Aldrich | O5500 | (步骤4.2.3) |
| 三水合二甲胂酸钠 | Sigma-Aldrich | C0250 | 用于配制0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.2) |
| 醋酸铀 | POCH | 868540111 | (步骤4.2.4) |
| 专用仪器与工具 | |||
| 30 mm 培养皿 | TPP | 93040 | |
| 60 mm 体外受精培养皿 | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium 细胞操作移液器 | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| 加热台 | SEMIC | 可使用其他品牌 | |
| 培养箱 | Panasonic | MCO-170AIC-PE | 可使用其他品牌 |
| 无菌培养皿(10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| 带0.2 µm 滤膜的无菌注射器滤器 | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| 保温瓶 | Quechua | 5602589 | 可使用其他品牌 |
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