蛋白酶可降解的海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器用于猪卵母细胞包封

摘要

本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中；第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒（微型生物反应器）共同封装。这两种系统均可提供最佳条件，以维持卵母细胞的三维结构。

摘要

在生殖生物学中，始于人工授精和胚胎移植技术的生物技术革命，推动了辅助生殖技术的发展，例如卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）以及通过体细胞核移植实现的家畜克隆。其中，IVM技术具有特别重要的意义。该技术是为多种应用提供成熟、高质量卵母细胞的基础平台，这些应用包括缩短具有重要经济价值或濒危物种的世代间隔、人类体外生殖相关研究，以及用于细胞治疗的转基因动物生产。卵母细胞质量这一术语涵盖了其完成成熟、受精并最终产生健康后代的能力。这意味着高质量的卵母细胞对于包括IVF在内的成功受精过程至关重要。然而，要建立一种可靠的培养方法，不仅支持人类卵母细胞，还能支持其他大型哺乳动物卵母细胞的生长，仍面临诸多挑战。IVM的第一步是卵母细胞的体外培养。本研究描述了两种猪卵母细胞三维（3D）培养的方案。第一种方案中，将三维模型的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包埋于纤维蛋白-海藻酸盐微珠互穿网络结构中，其中纤维蛋白与海藻酸盐混合物同时发生凝胶化。第二种方案中，将COCs悬浮于液滴中，并用氟乙烯丙烯（FEP；六氟丙烯与四氟乙烯的共聚物）粉末颗粒包裹，形成被称为“液态弹珠”（LM）的微型生物反应器。这两种3D培养系统均能维持稳定的气体环境以支持体外培养。同时，它们通过防止COCs扁平化及其导致的间隙连接破坏，保持了COCs的三维结构，从而维系了卵母细胞与其周围卵泡细胞之间的功能关系。

引言

开发各种培养系统（包括三维（3D）培养系统）旨在为从卵泡中分离出的早期阶段卵母细胞提供最佳的生长和成熟条件。这对于辅助生殖技术（ART）具有重要意义，特别是考虑到越来越多女性在癌症治疗后面临不孕问题¹。卵母细胞在体外条件下的成熟（IVM）已成为一项成熟的技术，主要用于家畜繁殖中的体外胚胎生成²。然而，在大多数哺乳动物物种中，即使卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的成熟率较高（范围为60至90 ％）³，其发育潜能仍无法满足实际需求。这是因为通过该方式获得的受精卵即使发育至囊胚阶段的比例也较低，且移植到代孕动物体内后其妊娠至足月的存活率下降。因此，有必要提高经IVM程序处理的卵母细胞所获得胚胎的发育潜能⁴。为此，研究人员正在设计新的成熟培养基⁵，测试不同的体外培养时间^6,7，并尝试在培养基中添加各种生长因子和分子^8,9。

任何完整的体外成熟（IVM）系统的首要步骤是在体外培养期间为卵母细胞的可持续生长创造....

方案

以下实验程序已获得雅盖隆大学动物学与生物医学研究中心动物福利委员会的批准。

1. 猪卵丘-卵母细胞复合体的分离

1. 为获取卵泡分离材料，需在当地屠宰场摘取未成年母猪（约6-7月龄，体重70至80公斤）的卵巢。每次实验从10只动物中选取约20个猪卵巢用于卵母细胞- cumulus复合体（COCs）的分离。
   注：假设每个卵巢可获得3–5个卵泡，则卵泡总数在60至100个之间。
2. 将卵巢置于装有含1%抗生素/抗真菌溶液（AAS）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4；38 °C）的保温瓶中。确保实验材料在1小时内运送至实验室，并用含抗生素的无菌PBS冲洗两次。
3. 冲洗卵巢后，将其转移至盛有HM培养基的烧杯中，并在38 °C培养箱中保存，以供后续所有操作使用。
   注：为在卵母细胞操作过程中获得最佳效果，所有操作应在DMEM/F12培养基（操作培养基，HM）中进行，添加2.5%抗生素/抗真菌溶液（AAS）和10%胎牛血清（FBS），并在带有温度控制（38 °C）的加热台和层流罩内操作，以控制环境中的CO₂水平并维持pH，同时最大限度减少细菌污染。
4. 从大型猪卵泡（直径6-8 mm）中通过抽吸收集卵泡液（FF），并在室温下以100 x g离心10分钟。随后，使用连接无菌注射器的0.2 μm孔径膜滤器过滤上清液，并立即在-80 °C速冻保存。

结果

在使用两种IVM系统的COCs中，颗粒细胞彼此紧密黏附，且大多数回收的COCs具有完整的卵丘细胞层（图1A,B）。此外，仍有相当比例的卵丘细胞得以保留。

从卵丘-卵母细胞复合体（COCs）活力分析获得的结果证实，两种用于在三维体外条件下包封猪卵母细胞的系统均能确保最佳生长条件（图2）。在两组实验中均仅观察到高活力的卵母细胞，其中FAB组V1为13%，V2为87%，LM组V1为10%，V2为90%（表1）。

通过透射电子显微镜（TEM）观察，线粒体在卵母细胞中呈均匀分布，体外成熟（IVM）后的线粒体形态呈壳状⁴⁵。仅有少数线粒体呈伸长形态，且其聚集现象偶见（图1C,D）。内质网可见，或与线粒体相关联，或游.......

讨论

不仅维持卵母细胞体外生长，同时维持其周围卵丘细胞的生长并支持卵母细胞成熟，这对于辅助生殖技术的成功以及深入理解体细胞与卵母细胞之间的相互作用至关重要，尤其是在人类或猪等经历较长卵泡发育周期的物种中尤为如此。不断改进的体外成熟（IVM）技术正成为一种有用的工具，可用于多囊卵巢综合征（PCOS）、卵巢早衰或确定性不孕（如癌症治疗后）等情况下生育力的保存。此外，由于某些卵巢功能障碍可能由卵泡发育调控异常引起，阐明调控卵母细胞正常发育的分子与细胞机制，可为这些疾病的病理生理学机制及合理治疗提供重要见解。为在IVM过程中维持卵丘-卵母细胞复合体（COCs）三维结构的体外培养系统，需将其包封于基质或生物反应器中的步骤。本文描述了一种适用于猪卵母细胞培养的实验方案。本文所介绍的两种用于诱导猪COCs生长与发育的三维体外培养系统均操作简便，可有效调控卵母细胞和卵丘细胞的存活。

本文首次介绍了一种利用卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包埋于纤维蛋白-海藻酸盐水凝胶微珠（FAB）中的体外培养方法，可实现卵母细胞在具有活跃细胞响应性的基质环境中进行三维生长。此前发表的基于海藻酸盐水凝胶的实验方案通常用于研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
常规
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）100 ml	Thermo Fisher	15240062	处理培养基中终浓度为2.5%。PBS中为1%（步骤1.2）
DMEM/F12（500 ml）	Sigma-Aldrich	D8062	处理培养基和成熟培养基
DPBS（不含Ca、Mg），1×，500 ml	Thermo Fisher	14190144
FCS（100 ml）	Thermo Fisher	16140063	处理培养基和成熟培养基中终浓度均为10%（步骤：1.5，2.6）
PBS（1×，pH 7.4）500 ml	Thermo Fisher	10010023
TBS储存液（10×，pH 7.4）500 ml	Cayman Chemicals	600232	终浓度为1×。可使用其他品牌
成熟培养基
hCG（1瓶，10,000 U）	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG	BioVendor	RP1782721000
纤维蛋白-海藻酸盐微珠
海藻酸盐裂解酶	Sigma-Aldrich	A1603	（步骤2.11.1）
凝血酶	Sigma-Aldrich	T9326-150UN	（步骤2.1）
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670	（步骤2.1）
纤维蛋白原（250 mg）	Sigma-Aldrich	F3879	（步骤2.2）
海藻酸钠	Sigma-Aldrich	W201502	（步骤2.3）用于配制海藻酸盐溶液
液态弹珠
FEP	Dyneon GmbH 3M AdMD	A-66670
形态学检测
哺乳动物细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit）	Thermo Fisher	L3224	（步骤4.1）荧光发射波长：钙黄绿素为494 nm，EthD-1为528 nm；检测波长：钙黄绿素为517 nm，EthD-1为617 nm
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000	封片介质
超微结构检测
戊二醛溶液	Sigma-Aldrich	G5882	终浓度为2.5%（步骤4.2.1）
LR White 树脂	Sigma-Aldrich	L9774	（步骤4.2.4）
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140	（步骤4.2.5）
四氧化锇	Sigma-Aldrich	O5500	（步骤4.2.3）
三水合二甲胂酸钠	Sigma-Aldrich	C0250	用于配制0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）
醋酸铀	POCH	868540111	（步骤4.2.4）
专用仪器与工具
30 mm 培养皿	TPP	93040
60 mm 体外受精培养皿	Falcon	353653
Ez-Grid Premium 细胞操作移液器	RI Life Sciences	8-72-288
Ez-Tip	RI Life Sciences	8-72-4155/20
加热台	SEMIC		可使用其他品牌
培养箱	Panasonic	MCO-170AIC-PE	可使用其他品牌
无菌培养皿（10 cm）	NEST Biotechnology	704002
带0.2 µm 滤膜的无菌注射器滤器	GOOGLAB SCIENTIFIC	GB-30-022PES
保温瓶	Quechua	5602589	可使用其他品牌