使用组合前体同位素标签和同位素标记 （cPILOT） 实现自动样品多路复用

Summary

组合前体同位素标记和同位素标记 （cPILOT） 是一种增强的样品多路复用策略，能够增加可与可用同位素标记同时分析的样本数量。机器人平台的整合大大提高了实验的吞吐量、可重复性和定量精度。

Abstract

我们引入了高通量定量蛋白质组学工作流程，组合前体同位素标记和同位素标记（cPILOT），能够在单个实验中分别用串联质量标记或正半核 N、N-二甲基利素等水标记进行多路复用多达 22 或 24 个样本。这种增强的样品多路复用大大缩短了质谱采集时间，并增加了昂贵的商用等量试剂的效用。然而，策略中样品处理和移液步骤的手动过程可能耗费大量，耗时，并引入样品丢失和定量误差。这些限制可以通过结合自动化来克服。在这里，我们将手动 cPILOT 协议转移到一个自动液体处理设备，可以并行准备大量样品（即 96 个样本）。总体而言，自动化提高了cPILOT的可行性和可重复性，并允许具有可比自动化设备的其他研究人员广泛使用。

Introduction

基于质谱 （MS） 的蛋白质组学是识别疾病特定生物标志物、了解疾病进展和为治疗开发创造线索不可或缺的研究工具。这可以从一系列与疾病相关的临床样本，如血清/血浆，近源液和组织^1，2。蛋白质组学生物标志物的发现和验证最近得到了重要的考虑，由于样品多路复用策略^{3，4的力量}。样品多路复用是一种技术，可以同时比较和定量在单个MS注射^5，6中两个^{或两个多个样本条件}。样品多路复用是通过用化学、酶或代谢标签从多个样品中条形码肽或蛋白质，并在单个 MS 或 MS/MS 实验中从所有样品获取 MS 信息实现的。其中可用的等量标记试剂（iTRAQ），商业串联质量标签（TMT），和内部合成的等量N，N-二甲基柳辛（DiLeu）试剂的能力分别高达16丛⁷和21-丛^8。

组合前体同位素标记和同位素标记 （cPILOT） 是一种增强的样品多路复用技术。cPILOT 结合了肽 N-termini 的同位素标记与轻 [（CH₃）_2]和重 [（¹³C²H₃）_2]同位素在低 pH （∼2.5）， 使裂氨酸残留物可用于后续的高 pH （8.5） 同位素标签使用 TMT， DiLeu，或 iTRAQ 标记^{3，9，10，11，12，13，14}。cPILOT 策略的双标记方案在附加图 1 中描述，其中两个样本使用示例肽。基于TMT的MS²水平定量的精度和精度可能会受到影响，因为存在称为干扰效应¹⁵的污染共隔离和共分离离子。在不准确的记者离子比的这种限制，可以克服与tribrid轨道质量光谱仪的帮助。例如，可以通过在质谱仪的MS¹水平上隔离一个二甲基化对中的峰，在线性离子陷阱中将轻或重峰分^段分段，然后为HCD-MS³进行最强烈的^MS2碎片来获取定量信息，来克服干扰效应。为了增加选择无裂氨酸胺的肽的机会，可以生成报告离子，也可以使用基于y-1片段的选择性MS³采集，这种方法可导致cPILOT⁹可量化的肽比例更高。轻标签和重标签的组合将样品多路复用功能增加 2 倍，而单个等值标签可达到这一功能。我们最近使用cPILOT将多达24个样品结合在一次实验中与DiLeu试剂^16。此外，cPILOT还用于研究氧化后转化后修饰^14，包括蛋白质硝化^17，其他全球蛋白质组^9，并演示了在阿尔茨海默病小鼠^模型11中的多个组织样本的应用。

可靠的样品制备是 cPILOT 实验中的关键步骤，既耗时又费力且范围广泛。增强型样品多路复用需要大量的移液和高度熟练的实验室人员，有几个因素可以严重影响实验的可重复性。例如，必须仔细处理样品，以确保所有样品的反应时间相似，并维持轻和重二甲基化样品的适当缓冲pH值。此外，手动制备数十至数百个样品可引入高实验误差。因此，为了减少样品制备的可变性，提高定量精度，提高实验吞吐量，我们开发了自动化的cPILOT工作流程。自动化是使用机器人液体处理装置实现的，该装置可以完成工作流程的许多方面（图1）。在自动液体处理机上进行了从蛋白质定量到肽标记的样品制备。自动液体处理机与正压装置 （PPA） 集成，用于固相提取 （SPE） 板、轨道摇床和加热/冷却装置之间的缓冲交换。机器人平台包含 28 个甲板位置，可容纳板和缓冲器。有两个带夹持器的吊舱可转移甲板位置内的板板:一个 96 通道固定体积移液头 （5-1100 μL） 和 8 通道可变体积探头 （1-1000 μL）。机器人平台使用软件进行控制。在使用机器人液体处理机之前，用户需要经过专业培训。本研究的重点是自动化手动 cPILOT 工作流，该工作流可以劳动密集型，用于在单个批次中处理 12 个样本。为了提高cPILOT方法¹¹的吞吐量，我们将cPILOT协议转移到一个机器人液体处理程序中，以并行处理10多个样本。该自动化还允许在样品制备过程的各个步骤中对每个样品并行进行类似的反应，这需要训练有素的用户在手动 cPILOT 期间实现。该协议侧重于实现自动化液体处理装置以执行cPILOT。本研究描述了使用这种自动化系统的协议，并演示了其性能使用22丛"概念证明"分析小鼠肝同质质。

Protocol

所有动物协议都经过匹兹堡大学动物护理和使用委员会的批准。一只雄性对照小鼠（C57/BLJ）被商业购买，并存放在匹兹堡大学实验室动物资源系。老鼠被喂食标准啮齿动物实验室周，并保持在12小时光/暗循环。肝脏组织收获并储存在+80°C。

1. 蛋白质提取

注:这些步骤是手动执行的。

1. 用盐水和均质洗小鼠肝脏（100毫克），用500μL的8 M尿素用机械均质器使用水化基A珠，4米/s20 s。
   注:在这项研究中，未添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂，但如有必要，可根据实验将蛋白酶或磷酸酶抑制剂添加到缓冲液中。此外，蛋白质提取步骤可以相应地调整各种样品类型。
2. 将组织均质转移到新的微离心管中，冲洗并用 100-500 μL 的 PBS 与 8 M 尿素混合。
3. 将均质组织（12，800 x g、4°C 和 15 分钟）离心并收集上一代。
   注:其余步骤在用户实验室中可用的机器人液体处理机上执行。液体处理器必须能够从 ANCI 指定板的类型中吸气和分配缓冲液，且操作员参与最少。
4. 根据制造商的说明，使用双辛辛酸（BCA）测定确定蛋白质浓度。
5. 打开 PPA、加热/冷却装置和真空泵，并连接所有附件与液体处理机。液体处理程序在连接到计算机并准备操作后显示蓝光。
6. 要试剂板 1 （96 井板），将 30 μL 的 25 mM 1，4-二甲醇 （DTT）、25 mM 30 μL 的半胱氨酸和 25 mM 30 μL 的碘二甲酰胺 （IAA） 分别添加到第 1 行、第 2 行和第 3 行。
7. 将 8 M 尿素和 20 mM Tris 与 10 mM CaCl₂ （pH 8.2） 添加到储液罐板中。将 500 μL 的 5% 甲酸添加到 2 mL 深井板中，将 20 μL 的 trypsin 添加到 trypsin 板的第 1 行中，并按方法指定的位置放置在甲板上位置。
   注:在添加到样品之前，IAA 和 trypsin 被添加到 96 井板中。
8. 1.300 μL的肝脏均质化成500μL管，放在2 mL深井板上，放在4°C，直到协议开始。对于这个实验，22个等分来自单个肝脏均质。
   注:添加内部质量控制标准（例如，牛α卡辛或其他外源蛋白），比1μg标准:100μg蛋白质样本。
9. 根据表 1 定义要按变量名称和值添加到样本的 缓冲区量。基于 BCA，在电子表格上输入样品和规范化缓冲区（8 M 尿素）的体积并附加到软件（表 2）。
   注:如果蛋白质浓度过高，可能需要用缓冲液进一步稀释。由此产生的肝脏组织样本浓度为10微克/μL。缓冲液的体积针对100μg蛋白进行了优化。
10. 从 4°C 中去除样品管，放在自动液体处理机的指定甲板位置，并允许加热 10 分钟。
11. 打开方法，按照说明将所需的提示（1070、90 和 230 μL）和实验室软件放入所需位置。一旦所有实验室软件和提示都到位，交叉检查与最终的甲板布局， 然后单击"下 一步"以继续协议。
    注:引导式设置通知用户根据协议和要保留的甲板位置向特定实验室软件添加所需的缓冲区量。

2. 样品还原、烷基化和消化

1. 从储液罐中装载 230 μL 尖端，吸入 90 μL 的 8 M 尿素，并分配到黑色 2 mL 深井板的第 1 排。卸载提示。重复此步骤，直到将 8 M 尿素添加到与 22 个样本对应的所有孔中。
   注:变性缓冲液展开蛋白质三维结构，产生初级结构，使蛋白酶可以有效地起到行动和断裂的蛋白质。8 通道移液器可为 8 个通道吸气不同的卷，并可分配到实验室软件中的不同位置。在此步骤中，所有通道的吸气量与软件中定义的相同。
2. 添加变性缓冲液后，使用 8 通道移液器将 90 μL 尖端和吸气 10 μL（对应于 100 μg）小鼠肝脏均质质，加载到黑色 2 mL 深井板中。卸载提示。重复此步骤，直到传输所有 22 个样本。
3. 每次转移后，执行混合步骤，吸气并分配50μL的井内，以确保蛋白质与缓冲液混合，以表现出1:1的比例。
   注:去除库存均质样品，并放在-80°C中。
4. 为了减少变性蛋白，从试剂板1中装载一排90μL尖端，并吸入3μL的DTT。将 DTT 分配到黑色 2 mL 深井板的第 1 行和 2 行，然后卸载尖端。
   注:蛋白质:DTT摩尔比维持在1:40，以减少二硫化物键。摩尔比的计算基于牛血清白蛋白（BSA）的蛋白质质量，即66.5 x 10³ 克/摩尔。
5. 用铝箔密封样品板，在37°C下孵育600秒，转速为300转/分。
6. 在使用前将 30 μL 的 0.25 M IAM 添加到试剂板 1 的第 3 行，然后放在甲板上。解封样品板并返回甲板。
   注:IAM 对光敏感。
7. 加载一排 90 μL 尖端，从第 3 排的试剂板 1 中吸气 6 μL 的 IAM，然后分配到样品板的第 1 行。卸载提示。
   注:蛋白质:每次样品的IAM摩尔比维持在1:80。这种反应必须在黑暗中进行。
8. 在加热/冷却装置上，在 300 rpm 转速下，密封样品板并在 4 °C 下孵育 30 分钟。
   注:密封板以防止样品从光线，蒸发和溢出从井。
9. 解封样品板，在第 2 排从试剂板 1 中装出一排 90 μL 尖端，并吸入 5 μL 的半胱氨酸。分配到样品板的第 1 行和第 2 行并卸载尖端。在室温下孵育30分钟。
   注:蛋白质:L-半胱氨酸摩尔比保持在1:40。
10. 将样品板放在轨道摇床上，执行 1800 rpm 的时时抖动 30 分钟。
11. 在样品板的每个井中加入 800 μL 的 20 mM Tris 缓冲液，并加入 10 mM CaCl₂ （pH 8.2）的样品，将尿素浓度稀释至 2 M。
    注:在尿素浓度较高时，三辛的活性受到阻碍，因此必须降低到2 M以下。本研究用蛋白质对50:1的三辛摩尔比进行了14小时。
12. 将 20 μL 的 trypsin 添加到 96 井板的第 1 排、第 1-12 排，并放在甲板上的指定位置。
13. 从 trypsin 板第 1 行加载一排 90 μL 尖端，吸气 2 μL 的 trypsin，然后分配到样品板的第 1 行和 2 行。卸载提示。
14. 在加热/冷却装置上，在 37 °C 下，在 37 °C 下密封板并孵育 14 小时。
15. 孵育后，解封样品板，将5%的甲酸加入深井收集板的第3列1-12中，并放在指定的甲板上。
16. 从甲酸板第 3 行中加入 150 μL 的 5% 甲酸，并分配到第 1 排和 2 排的样品板，从而停止消化。卸载提示。

3. 脱盐步骤 1

1. 用含有20毫克Targa C-18材料的SPE板对肽进行脱盐。将每个缓冲交换的体积固定为 600 μL，并固定压力为 100 mbar。
2. 加载 1070 μL 尖端并吸气 600 μL 的乙酰酸盐，并分配到 SPE 板的第 1 排和 2 行。将 SPE 板放在 PPA 上并施加压力。
3. 使用相同的尖端，吸气 600 μL 的乙酰三叶草，并分配到 SPE 板的第 1 行和第 2 行。将 SPE 板放在 PPA 上并施加压力。
   注:流经可使用吸油泵排空废物。
4. 加载 1070 μL 尖端并吸气 600 μL 的缓冲液 A（0.1% 甲酸中 100% 的水），并分配到 SPE 板的第 1 排和第 2 行。将 SPE 板放在 PPA 上并施加压力。
   注:如果缓冲器的体积没有显著减小，请尝试增加压力或时间。
5. 加载 2 行 1070 μL 尖端，吸气 534 μL 的消化样品，并分配到 SPE 板的第 1 行和 2 行。将 SPE 板放在 PPA 上并施加压力。重复此步骤，直到加载所有示例。
   注:由于加入甲酸后的总体积为1068μL，样品在两次中加入。
6. 加载 2 行用过的 1070 μL 尖端，吸气 600 μL 的缓冲器 A，并分配到 SPE 板的第 1 行和 2 行。将 SPE 板放在 PPA 上并施加压力。
7. 重复上述步骤一次以清洁样品。
8. 加载 1 排 1070 μL 尖端，吸气 600 μL 的 ACN:水 （60:40），并分配到 SPE 板的第 1 排和 2 行。将 SPE 板放在收集板的顶部，使用 PPA 对肽进行分管并施加压力。
9. 重复上述步骤以在收集板中分一步。将收集板干燥至干燥，并储存在-80°C，直到进一步加工。

4. 二甲基化标签（肽N-termini）

1. 将所需的提示（1070、90 和 230 μL）和实验室软件放入软件中所需的位置。一旦所有实验室软件和提示都到位，交叉检查与最终的甲板布局， 然后单击"下 一步"以继续协议。
2. 对于试剂板2，分别向第1、2、3和4行加入450 μL 1%醋酸、50 μL轻甲醛（CH₂O）、50 μL重甲醛^（13CD₂O）和150μL甲酸。
3. 要试剂板 3 将 50 μL 的轻 CB、50 μL 的重 CB 添加到第 1 排和 2 排以及第 50 列，将氨添加到第 3 行和第 4 行。
4. 从试剂板 2 的第 1 行装载 2 行 230 μL 尖端，从试剂板 1 行吸入 100 μL 1% 醋酸，然后分配到样品板 2（脱盐步骤的收集板）第 1 行和 2 行中干燥的肽，并在 1800 rpm 转速下执行 5 分钟的时空摇动。
5. 负载 90 μL 尖端和吸气 16 μL 的 60 mM （4%）CH₂O （37% wt/v） 从试剂板 2 行，并分配到样品板的第 1 行。卸载提示。
6. 加载 1 排 90 μL 尖端，吸气 16 μL 的 60 mM （4%） ¹³从_试剂板第2 行的 CD 2 O（20% wt/v），并分配到样品板的第 2 行。卸载提示。
   注:本研究第1行对应于光，第2行对应于重二甲基样品（见图1）。
7. 从试剂板第 3 行装载 2 行 90 μL 尖端和吸气 16 μL 的 24 mM NaBH₃CN 和 24 mM NaBD_{3 CN，}并分别分配到样品板的第 1 行和第 2 行。
8. 在转速为 1800 rpm 时，卸载尖端并执行 15 分钟的时时摇动。
   注:添加氰氨基钠会引发反应，从而减少实验之间的变异性，此步骤每批执行一次。
9. 从试剂板第 3 行和第 4 行装载 2 排 90 μL 尖端和吸气 32 μL 1% 氨（±28-30% v/v），并分别分配到样品板 2 的第 1 行和第 2 行。卸载提示。
   注:添加氨会停止反应，从而减少实验之间的变异性，此步骤每批执行一次。
10. 将同等体积的轻质和重（1:1）二甲基多肽组合到新的2 mL深井板中，用于脱盐。
    注:本研究将第1排90μL的井内注与90μL第2行从样品板2与新的2 mL收集板（样品板3）相结合。轻比:重混合取决于实验方案，本研究中采用1:1的比例。
11. 将 2 行 230 μL 吸头，将 32 μL 的 5% 甲酸吸入到组合样品中，并在 1800 rpm 转速下执行 30 s 的时空抖动。
    注:二甲基化效率取决于反应混合物的pH值，缓冲pH的任何变化都会导致肽N-termini的不完全标记。在肽N-termini中搜索为动态修饰时，二甲基化效率应大于97%。在这项研究中，轻质和重肽的贴标效率分别为99.7%和99.5%。

5. 淡化步骤 2

1. 对组合样品执行类似于脱盐步骤 1 的样品脱盐。
2. 使用速度真空干燥样品板中的样品，并在 -80°C 下储存，直到进一步处理。

6. isobaric 标记（Lys 残留物）

1. 按照引导式实验室软件设置，将所需的提示（1070、90 和 230 μL）与适当的缓冲区放在一起。一旦所有实验室软件和提示都到位，交叉检查与最终的甲板布局， 然后单击"下 一步"以继续协议。
2. 将 250 μL 的 100 mM 三乙基碳酸氢铵 （TEAB），30 μL 的羟基胺 （10% w/v） 添加到第 1 行，2 列试剂板 4。根据表3中的电子表格，将TMT管放在2 mL深井 板上。
3. 将空的 1.5 mL 管放在管架支架中，用于汇集标记的肽。将干燥的样品板放在 P9 和 TMT 加工板的 P14 上。
4. 要重组肽，从 TEAB 板第 1 排装载 230 μL 尖端并吸气 100 μL 100 mM 三乙基碳酸氢铵 （TEAB） 缓冲液 （pH +8.5），然后分配到样品板 3 行第 3 排的干肽。在 1800 rpm 时将板放在轨道摇床上 30 秒。
   注:以1微克/微升的浓度重组100μg二甲基肽。
5. 从 TMT 板的 H12 中装载 90 μL 尖端并吸入 10 μL 无水乙酰酸盐，然后分配到每个干燥的 TMT 管中。
6. 拆下 TMT 管、涡流，快速旋转管，然后返回深井板的甲板。
7. 将组合二甲基多肽装载 1 排 90 μL 尖端和吸气 12.5 μL，并分配到 TMT 加工板的第 1 行。卸载提示。
   注:本实验的TMT:肽比维持在1:8。
8. 加载 1 排 90 μL 尖端，吸气 10 μL 的 TMT 并分配到 TMT 加工板的第 1 行。卸载尖端，在 1800 rpm 转速下执行 1 小时的时时摇动。
9. 在 TEAB 板的第 2 排装载 1 排 90 μL 尖端和吸气 8 μL 的羟基胺 （10% w/v），然后分配到 TMT 加工板的第 1 行。卸载尖端，在 1800 rpm 转速下执行 15 分钟的时时摇动。
10. 将 TMT 标记的肽从 TMT 加工板的 30.5 μL 组合到 1.5 mL 管中。每次传输后卸载提示。
11. 用池状样品取出管子并干燥以蒸发乙酰酸盐。在0.2 mL水中重组肽，在0.1%的甲酸中，然后返回甲板。
    注:等号标签的标签效率也是pH的特异性，每个制造商的说明标签效率应高于98%。本研究对裂解光和重肽的TMT贴标效率分别为99.4%和99.5%。

7. 脱盐步骤

1. 对一个样品执行类似于脱盐 1 的样品脱盐。
2. 干燥样品，储存在-80°C，直到分析。

8. 液相色谱–串联质谱仪（LC-MS/MS）和MS³

1. 用0.1%FA重新组织MS级水中的肽，获得±1μg/μL浓度。使用含有 0.65 μm 过滤器的微离心管过滤样品。在 12，000 x g 下离 心 肽 3 分钟，然后将流量放入自动采样器小瓶中。
   注:如果需要，可在此阶段确认肽浓度。肽需要在LC-MS级水中重组，并接受B半肽测定。在这项研究中，肽BBA测定没有进行，所有肽量都基于最初的蛋白质BCA测定。
2. 准备移动相位缓冲器如下:100%（v/v）水与0.1%FA（A）和100%ACN与0.1%FA（B）。
3. 将 1 μL 样品注入装有 2 厘米 C_{18 材料（3} μm，100 μ 孔径）的陷阱柱上。
   注:陷阱上的样品清洁如下:10分钟，100%A;使用 2ΜD 液相色谱系统 2 μL/min。
4. 运行分析分离方法。使用 100 μm i.d. x 26 厘米激光拉尖熔融石英毛细管柱，该柱装有 C₁₈ 材料（2.5 μm，100 Ω）。梯度为:0-10分钟，10%B;10-30分钟，10-15%B;30-75分钟，15-30%B;75-88分钟，30-60%B;88-92分钟，60-90%B;92-99分钟，90%B;99-100分钟，90-10%B，100-120分钟，10%B;300 nL/min，120分钟
5. 在分析分离方法运行时运行质谱仪的数据采集。
   1. 使用以下参数进行 MS 测量扫描:375-1，500 m/z、120，000 分辨率、循环时间 3 s（最高速度）、自动增益控制 （AGC） 目标 4.0e5、最大喷射时间 50 ms。
   2. 使用以下参数的CID+MS/MS与离子陷阱:数据依赖采集（DDA）扫描每个 结果，2m/z 隔离宽度，35%的规范化碰撞能量（NCE），0.25激活q，10ms激活时间，1.0e4 AGC，100 ms最大喷射时间。
   3. 使用以下参数的HCD+MS3 SPS 10:扫描范围100-400 m/z，依赖扫描数10，AGC 5.0e4，最大喷射时间118 ms，HCD碰撞能量55%，MS2隔离窗口2。

9. 数据分析

1. 使用蛋白质分析软件对照适当的数据库搜索生成的 RAW 文件，以查看蛋白质和肽列表。
   注意:本研究中生成的 RAW 文件是在鼠标 Uniprot 数据库上搜索的。
2. 由于一个 RAW 文件中同时有轻标签和重标记，因此使用两个工作流在每个文件中搜索轻质和重二甲基多肽。
3. 搜索RA原始文件对鼠标Uniprot数据库（07/13/2019）与53035序列与以下参数:trypsin裂解与最多两个错过的裂解， 肽具有最小 6 氨基酸长度，15 ppm 父质量耐受性，1 Da 碎片耐受性静态修饰:轻二甲基化 （+28.031，肽 N-1nus） 或重二甲基化 （+36.076 Da， 肽 N-terminus），碳酰胺基（+57.021 Da， C），动态修改:氧化（+15.995 Da，M），11-丛等标（229.163 Da，K），1%FDR，记者离子定量与30ppm峰值集成容差，最自信的中心体为集成方法。
   注:重二甲基化峰还包括另一个修改，这是+7 Da（+35.069 Da，肽N-术语）从轻二甲基化峰值，因此另一个搜索节点应该纳入，包括此修改也。
4. 根据强度执行记者离子定量，65%SPS质量匹配，平均S/N比10，同位素校正，规范化和缩放未执行。
   注:可以根据总肽量或添加到样品中的特定蛋白质进行规范化和缩放。QC样本也可以包括到基于双尾内部参考缩放18的批次间或批次内规范化的^通道中。不同TMT通道的同位素污染没有提供给搜索，建议用户添加不同报告离子的同位素污染。

Results

图 2 显示了从 22 丛 cPILOT 实验中所有 22 个处理器离子通道中识别出的肽的代表性 MS 数据，包括工作流复制。 图 2（ 顶部）描绘了一个双带电峰对，用 4 Da m/z 间距分隔 ，表示在肽中并入的单个二甲基组。轻重二甲基化峰对被分离和分离，独立分离，产生肽的序列。肽的序列为G（二甲基）AAELMQQK（TMT-11plex），与蛋白质β氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶相对应。光和重二甲基峰（未显示）的最强烈的碎片离子被进一步隔离为^{MS 3} 碎片，报告离子（m/z 126-131）如图 2（ 底部）所示。记者离子强度与样品中的肽丰度成正比。样品的肽丰度意味着机器人平台的移液能力在22个样品中相当均匀。总体而言，这项22丛cPILOT实验的结果是3098（6137-光/5872重）肽（表4）对1326（1209-光/1181重）蛋白质的鉴定。 图 3 显示了所有 22 个通道中日志 10 丰度与总记录器离子强度的框图，显示井间/样本间变异性较小。通过检查22个样本中每种蛋白质中报告离子丰度误差，对完全自动化进行了评估。 图 4 显示，使用机器人平台进行采样处理导致 CV 值非常低。具体来说，在3098肽中，光和重二甲基多肽的平均CV为12.36%和15.03%。在这些肽中，2032种肽中的记者离子信号高于最低阈值，被认为是可量化的。

图1。实验工作流程，可与自动 cPILOT 协议并行处理 22 个样本。请单击此处查看此图的较大版本。

图2.在22个样本中量化肽。 示例 MS（顶部）和 MS^3（ 底部）肽 G（二甲基）AAELMQQK（TMT-11plex）光谱在 22 丛自动 cPILOT 实验中量化为轻二甲基化（左下）和重二甲基化（右下）峰。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3.使用蛋白质组发现器 2.3 的总记者离子强度与 22 个样本的日志 10 丰度之间的框图。 RAW 文件被搜索了两次轻和重肽，蛋白质 ID 分别与 TMT 作为动态修改，轻 （+28.031 Da） 和重 （+36.076 和 +35.069 Da） 二甲基化在肽 N-termini 作为静态修饰.使用 Proteome 发现 2.3 运行与上述所有修改的组合搜索，以在所有通道中获取日志 10 肽强度的可度。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4.从通道126-131 m/z的总结记者离子强度中共同有效变异肽丰度的小提琴图。对轻（2373）和重（2533）的可量化肽的平均CV值进行量化。请单击此处查看此图的较大版本。

补充图 1.使用单肽的 cPILOT 的插图。显示两种不同样品的同位素标记和带TMT¹²⁶的同位素标记，所得混合物被注射到MS的LC-MS^3。请点击这里下载此文件。

变量名称	价值	描述
德萨尔特桑普1	1065	用于脱盐步骤 1 的卷
德萨尔特桑普2	392	用于脱盐步骤 2 的卷
德萨尔特桑普3	100	用于脱盐步骤 3 的卷
德夫模式	假	False 将孵化时间缩短到 30 秒 - True 将遵循协议中的孵育时间。
德特沃尔	3	DTT 的体积
过滤板	塔尔加	用于脱盐的板
过滤器板Vol	600	脱盐量
哈沃特瓦什	假	SPE 板上的水洗数
伊姆姆沃尔	2	碘多乙酰胺体积
肽TMTVol	12.5	用于TMT标签的肽量
压力	100	ppa 的 mbar 压力
坦波夫集	1	温度变化
特姆特沃尔	10	要添加的 Isobaric 标记卷
特里斯沃尔	800	消化前稀释样品的体积
西普辛沃尔	2	trypsin 的体积
使用流行时间器	真	True 显示对板施加压力的选项（如果需要）

表1.自动 cPILOT 协议中使用的变量列表。

迪尔源	迪尔韦尔	德斯特	德斯特韦尔	迪尔沃卢姆	库存来源	斯托克韦尔	样品Vol	样品 ID
8M_Urea	1	样品	A1	90	Stock_Samples	A1	10	1
8M_Urea	1	样品	A2	90	Stock_Samples	A1	10	2
8M_Urea	1	样品	A3	90	Stock_Samples	A1	10	3
8M_Urea	1	样品	A4	90	Stock_Samples	A1	10	4
8M_Urea	1	样品	A5	90	Stock_Samples	A1	10	5
8M_Urea	1	样品	A6	90	Stock_Samples	A1	10	6
8M_Urea	1	样品	A7	90	Stock_Samples	A1	10	7
8M_Urea	1	样品	A8	90	Stock_Samples	A1	10	8
8M_Urea	1	样品	A9	90	Stock_Samples	A1	10	9
8M_Urea	1	样品	A10	90	Stock_Samples	A1	10	10
8M_Urea	1	样品	A11	90	Stock_Samples	A1	10	11
8M_Urea	1	样品	A12	90	Stock_Samples	A1	10	12
8M_Urea	1	样品	B1	90	Stock_Samples	A1	10	13
8M_Urea	1	样品	B2	90	Stock_Samples	A1	10	14
8M_Urea	1	样品	B3	90	Stock_Samples	A1	10	15
8M_Urea	1	样品	B4	90	Stock_Samples	A1	10	16
8M_Urea	1	样品	B5	90	Stock_Samples	A1	10	17
8M_Urea	1	样品	B6	90	Stock_Samples	A1	10	18
8M_Urea	1	样品	B7	90	Stock_Samples	A1	10	19
8M_Urea	1	样品	B8	90	Stock_Samples	A1	10	20
8M_Urea	1	样品	B9	90	Stock_Samples	A1	10	21
8M_Urea	1	样品	B10	90	Stock_Samples	A1	10	22
8M_Urea	1	样品	B11	90	Stock_Samples	A1	10	23
8M_Urea	1	样品	B12	90	Stock_Samples	A1	10	24

表2.小鼠肝均质和800万尿素的体积。

源井	源井2	记者 伊恩	德斯特韦尔 1	德斯特韦尔 2	体积	样品 ID
A1	C1	126	A1	E1	10	1
A3	C3	127N	A2	E2	10	2
A5	C5	127C	A3	E3	10	3
A7	C7	128N	A4	E4	10	4
A9	C9	128C	A5	E5	10	5
A11	C11	129N	A6	E6	10	6
B2	D2	129C	A7	E7	10	7
B4	D4	130N	A8	E8	10	8
B6	D6	130C	A9	E9	10	9
B8	D8	131N	A10	E10	10	10
B10	D10	131C	A11	E11	10	11

表3.肽、蛋白质和肽光谱匹配（PSM）的总数。

	自动 CPILOT
	光	重
蛋白质	1209	1181
肽	6137	5872
Psms	14948	16762

表4.用轻重标签样品对等号标签进行条形码。

Discussion

cPILOT 是一种增强的多路复用策略，可以在单个实验中分析多达 24 个样本。多路复用容量取决于可用的同位素和等值标记组合的数量。TMTpro⁷的引入，它能够在单个实验中标记16个样本，可以将cPILOT的极限推高到32丛。cPILOT 由多个移液步骤组成，需要广泛的护理和用户技能来执行样品制备。即使使用专家用户，手动错误也是不可避免的，这就促使使用机器人平台在 cPILOT 策略中处理样本。由于cPILOT使用肽的pH相关标记，因此需要为轻质和重二甲基化样品保持pH。轻度酸性基本pH值可导致N-termini和Lysine残留物的二甲基化。cPILOT 的一个优点是，它只需要半个等号标签，因为肽N-termini被二甲基组占据。这提供了更多的样品标签，成本的一半。处理较大的样本数要求试剂暴露时间与批次中第一个和最后一个样品的曝光时间相似。使用机器人液体处理设备，可以最好地实现可同时容纳多达 32 个样品的移液器分配器。

为了通过 cPILOT 处理多个样本，对手动工作流进行了修订，以纳入自动化。本研究中使用的机器人液体处理器有两个具有 96 通道和 8 通道移液能力的吊舱，其抓斗可将板放在可用的 28 个甲板位置。液体处理器与正压装置、轨道摇床和用于96井板中加热/冷却样品的装置集成在一起。正压装置有助于在清理过程中在SPE板中执行缓冲交换，而轨道摇床则有助于涡流/混合样品。机器人平台被编程为吸气和分配缓冲液和样品到96孔板，孵育，涡流样品，和转移板。具有不同粘度的液体（如乙酰胺和水）需要特定的移液注意事项，也可以编程到方法中。

从 BCA 的蛋白质定量到用等量标记（即 TMT）标记肽，CPILOT 工作流程在液体处理系统中执行。整个协议被扩展为使用96个深井板，可以容纳2 mL每井。缓冲液是在实验开始之前准备的，并添加到96井板中，以便进行平行样品处理。本研究将22种小鼠肝均质的工作流程复制添加到深井板中，并通过cPILOT协议进行。最后，将由22丛等量小鼠肝脏标记肽组成的单个样本注射到质谱仪中。报告器离子强度与样品中的肽丰度相对应，表明使用液体处理器处理的样品的简历比手动协议（未显示的数据）低。机器人平台还大大提高了样品加工的可重复性。在处理大量样品时，可重复性和鲁棒性是非常重要的因素。移液错误可能导致数据完全误读，因此机器人平台提供了低样本间变异。此外，使用机器人平台进行 cPILOT 缩短了准备样品的时间。例如，在开发自动化方法后，需要 2.5 小时来处理 22 个样本，而手动 cPILOT 需要 7.5 小时。我们的实验室正在进行实验，以进一步评估手动和自动 cPILOT 工作流的比较。根据我们实验室先前的报告，手动cPILOT中蛋白质报告器离子强度的CV%平均为20%，有些异常值超过^此值12。

cPILOT 是肽级的化学衍生策略，可用于任何样品类型，如细胞、组织和体液。cPILOT 提供增强的样品多路复用，通过结合自动化，可以促进蛋白质组学中的高通量样品多路复用。这种吞吐量对于进一步推进疾病和生物理解和生物标志物发现是必要的。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL eppendorf 管，500 件装	Fisher Scientific	05-408-120	任何品牌的 0.6 mL eppendorf 管都足够
0.65 µm Ultrafree MC DV 离心过滤装置	EMD Millipore	UFC30DV00
1.5 mL eppendorf 管，500 件装	Fisher Scientific	05-408-129	任何品牌的 1.5 mL eppendorf 管都足够
2 ml 黑色深孔板	Analytical Sales and Services， Inc.	59623-23BKGC	任何品牌的黑色 96 孔板都足够
2 ml 透明深孔板	VWR	75870-796
乙酸	J.T. Baker	9508-01
乙腈 - MS 级	Fisher Scientific	A955-4	4 L 数量不是必需的
Agilent 500µL 板	安捷伦	203942-100	添加缓冲液的试剂板
甲酸铵	Acros Organics	208-753-9
氢氧化铵溶液 （28 - 30%）	Sigma Aldrich	320145-500ML
分析天平	梅特勒-托利多	AL54
BCA 蛋白检测试剂盒	皮尔斯 Thermo Fisher Scientific	23227
Biomek i7 hybrid	Beckmann		任何能够使用正压、加热/冷却和涡旋样品的液体处理设备。
C18 填料 （2.5 µm， 100 Å）			此项目不再从 Bruker 提供。具有所列规格的替代包装材料就足够
了 带板转子的离心机	Thermo Scientific	69720
Micro 21R 离心机	Sorval	5437
Dionex 3000 UHPLC	Thermo Scientific		此型号已停产。任何带有自动进样器的纳 LC 就足够了。
二硫苏糖醇 （DTT）	Fisher Scientific	BP172-5
甲醛 （13CD2O） 溶液;D2O 中 20 wt %，D98 原子 %，13C 13C	Sigma Aldrich，化学	596388-1G
甲醛 （CH2O） 溶液;H2O 中 36.5 - 38%	Sigma Aldrich，生命科学	F8775-25ML
甲酸	Fluka 分析	94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass光谱仪	Thermo Scientific		此型号已停产。可以使用其他高分辨率仪器（例如 Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion 或 Orbitrap Fusion Lumos）。
盐酸羟胺	Sigma Aldrich，化学	255580-100G
碘乙酰胺 （IAM）	Acros Organics	144-48-9
同量异位标记试剂盒 （TMT 11-plex）	Thermo Fisher Scientific	90061
L-1-甲苯酰酰胺-2 苯乙基胆胺酮 （TPCK） 处理的牛胰腺胰蛋白酶	Sigma Aldrich，生命科学	T1426-100MG
L-半胱氨酸	Sigma Aldrich，化学	168149-25G
机械均质器（即 FastPrep-24 5G）	MP 生物医学	116005500
pH 10 缓冲液	Fisher Scientific	06-664-261	任何品牌的 pH 缓冲液 10 都足够
pH 7 缓冲液 Fisher	Scientific	06-664-260	任何品牌的 pH 缓冲液 7 都足够
pH 计 （Tris兼容）	Fisher Scientific （Accumet）	13-620-183	任何品牌的 pH 计都足够
了 蛋白质软件（例如 Proteome Discoverer）	Thermo Scientific
保存板 200 ml	Agilent	204017-100
氰基硼乙化钠;96 原子 % D，98% CP	Sigma Aldrich，化学	190020-1G
氰基硼氢化钠;试剂等级，95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	任何品牌的能够容纳深孔板的 speed vac 就足够
搅拌板	VWR	12365-382	任何品牌的搅拌板都足够
Targa 20 mg SPE 板	Nest Group， Inc.	HNS S18V	这些是C18小柱
三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲	Sigma Aldrich，生命科学	T7408-100ML
Tris	Biorad	161-0716
Biomek 24位试管架支架	Beckmann	373661
尿素	Biorad	161-0731
水 - MS级	Fisher Scientific	W6-4	不需要 4 L 量