方法文章

新生小鼠缺氧缺血期间的连续视频脑电图监测

DOI：

10.3791/61346

⸱

2020年6月11日

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1Department of Pediatrics, University of Virginia, 2Department of Neurology, University of Virginia, 3Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 4Brain Institute, University of Virginia, 5Department of Neuroscience, University of Virginia

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本论文描述了一种对经历缺氧缺血的新生小鼠使用多个深部电极进行连续视频脑电图记录的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

缺氧缺血是新生儿惊厥最常见的病因。动物模型对于理解新生儿惊厥及缺氧缺血的潜在机制和生理学至关重要。本文描述了一种在新生小鼠中进行连续视频脑电图（EEG）监测的方法，用于检测惊厥并分析缺氧缺血期间的EEG背景活动。联合使用视频与脑电图可描述惊厥的半定性特征并确认惊厥事件。该方法还可用于分析实验期间的功率谱图和EEG背景模式的变化趋势。在此缺氧缺血模型中，该方法可在损伤前记录EEG以获得正常基线，并在损伤期及恢复期持续记录。总的监测时间受限于幼鼠与母鼠分离不得超过四小时。尽管本文采用的是缺氧-缺血性惊厥模型，但该新生小鼠视频脑电图监测方法亦可应用于啮齿类动物的多种疾病模型和惊厥模型。

引言

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缺氧缺血性脑病（HIE）是一种每年影响约千分之1.5新生儿的疾病，也是新生儿惊厥最常见的病因1,2。存活婴儿面临多种神经系统残疾的风险，如脑性瘫痪、智力障碍和癫痫3,4,5。

动物模型在理解与研究缺氧缺血及新生儿惊厥的病理生理机制中发挥着关键作用6,7。改良的Vannucci模型被用于在出生后第10天（p10）诱导缺氧缺血（HI）7,8。这一年龄段的小鼠幼崽在神经发育上大致相当于足月人类新生儿9。

将连续视频脑电图（EEG）监测与该损伤模型结合使用，有助于进一步理解并表征新生儿缺氧缺血性癫痫发作。以往的研究采用多种方法分析啮齿类动物的新生儿癫痫发作，包括视频记录、有限的脑电图记录以及遥测脑电图记录10

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方案

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所有动物实验均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 电极制备/电缆制备

  1. 使用单极绝缘不锈钢丝（裸线直径 0.005”，涂层后直径 0.008”）制作电极，并将其连接至雌性插座连接器（雌性插孔连接器 0.079）。
  2. 使用特制的定制电缆将动物连接至放大器。
    1. 将一个4针公头连接器（公头连接器 0.079”）连接至4通道单位增益阻抗匹配运算放大器（运放）。将一个10K电阻连接至与9 V电池相连的导线上。一条未连接至运放的接地导线作为电池的中点。
    2. 将电缆的一端（AWG，外径 0.012”）连接至运放，另一端连接至放大器。

2. 电极植入手术

  1. 将幼鼠（出生后第9天）置于向下气流罩内，使用4-5%异氟烷进行麻醉。在手术开始前，向幼鼠皮下注射布比卡因（0.02–0.05 mL，0.25%局部浸润）。
  2. 待动物完全不动后，将其转移至带有鼻罩的立体定位仪上。使用耳杆的反面固定头部，因其质地较软，适合固定；此阶段幼鼠耳道尚未发育完全，不可使用耳杆的尖端。
  3. 降低异氟烷气流，维持浓度在2.5–3%。在整个手术过程中密切观察幼鼠呼吸是否平稳。轻捏尾部以检测痛觉反应，确认麻醉效果后进行切口操作。
  4. 使用聚维酮碘和酒....

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

发作症状学

新生小鼠暴露于缺氧-缺血后，会出现全身性和局灶性癫痫发作（图1A-C）。视频脑电图（EEG）记录可将脑电活动发现与视频中的行为表现相对应。这些行为采用既往发表的新生啮齿类动物行为性癫痫发作评分（BSS）进行评分16。除BSS外，我们还根据行为表现为局灶性/单侧性、双侧性或混合性对事件进行了分类（图1B）。

在此模型中，小鼠通常表现出三种类型的癫痫发作症状：1）向结扎侧重复转圈并伴有对侧肢体伸展，2）姿势丧失并伴有躯干屈曲和尾巴向结扎侧卷曲，或 3）姿势丧失并伴有单侧或双侧肢体划动（严重程度和持续时间各异）。大多数观察到的发作事件表现为局灶性/单侧性或混合性行为（图1B）。此外，在缺氧期间，部分小鼠出现非惊厥性癫痫活动，表现为幼鼠身体不动，但.......

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讨论

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我们提出了一种在缺氧缺血性发作期间对新生小鼠进行连续视频脑电图（video-EEG）监测的模型。结合脑电图的视频分析可用于表征发作的半临床学特征。脑电图分析可提取功率谱图并进行背景振幅分析。

在本方案中，电极的正确且谨慎放置至关重要，因为在电极植入过程中造成的损伤或位置不准确会显著影响实验结果。在损伤前评估正常的基线脑电图（EEG）活动极为关键，因为尽管电极植入过程中发生出血或损伤的情况较为罕见，但仍有可能出现。其次，为了确认电极位置的准确性，可对脑组织进行切片并检查电极穿行轨迹是否位于正确位置。此外，若未将幼崽成组放回母鼠身边（而是单独放置），可能导致电极头戴装置受损，或幼崽被母鼠伤害或遗弃。

该方法的一个局限性在于，深度电极记录在微小的新生儿大脑中空间定位能力有限，这限制了在脑电图（EEG）记录中精确定位特定癫痫发作病灶的能力。在缺氧缺血模型中，另一个局限性是癫痫发作负荷的变异性。此前已有充分报道，在该啮齿类动物缺氧缺血模型中，病变范围和行为缺陷存在显著差异7,

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢以下资助来源：美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所——K08NS101122（JB）、R01NS040337（JK）、R01NS044370（JK），以及弗吉尼亚大学医学院（JB）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
外科手术
圆头涂布器Metrex Research8300-Fi-bond 涂布器
颅骨成形材料（粉剂/树脂）ColteneH00383Perm Reline/Power
I-BondKulzer GmbH, Germany
LOOK 丝线缝合线Surgical Specialities CorporationSP115LOOK SP115 黑色编织非吸收性外科缝合线
RS-5168 Botvin 镊子Roboz Surgical InstrumentRS5168用于手术/结扎的镊子
RS-5138 Graefe 镊子Roboz Surgical InstrumentRS5138用于手术/结扎的镊子
I-Bond 用紫外灯Blast Lite By First MediaBL778I-Bond 用紫外灯
Vannas 显微解剖剪Roboz Surgical InstrumentRS5618用于结扎的剪刀
Vet Bond3M Vetbond1469SB兽用胶水
缺氧
缺氧装置Starr Life Science
氧气传感器Medical ProductsMiniOxI—用于缺氧装置的氧气分析仪/传感器
脑电图记录
0.079" 雌性插座连接器Mill-Max Manufacturing Corp832-10-024-10-001000从 Digikey 订购
Grass 放大器Natus Neurology IncorporatedGrass 产品
LabChart ProADI Instruments用于运行系统的软件
0.079" 雄性插孔连接器Mill-Max Manufacturing Corp833-43-024-20-001000从 Digikey 订购
运算放大器Texas Instruments, Dallas, TX, USATLC2274CDTLC2274 四通道低噪声轨到轨运算放大器
运算放大器Texas Instruments, Dallas, TX, USATLC2272ACDRTLC2274 四通道低噪声轨到轨运算放大器
不锈钢丝A-M Systems7914000.005" 裸线 / 0.008" 涂层线，100 英尺
超柔性导线McMaster-Carr9564T136 号多色导线

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vasudevan, C., Levene, M. Epidemiology and aetiology of neonatal seizures. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).
  2. Volpe, J., et al. Neonatal Seizures. Volpe's Neurology of the Newborn. , Elsevier. 275-321 (2018).
  3. Shankaran, S., et al.

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