本论文描述了一种对经历缺氧缺血的新生小鼠使用多个深部电极进行连续视频脑电图记录的方法。
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本文内容
摘要
摘要
缺氧缺血是新生儿惊厥最常见的病因。动物模型对于理解新生儿惊厥及缺氧缺血的潜在机制和生理学至关重要。本文描述了一种在新生小鼠中进行连续视频脑电图（EEG）监测的方法，用于检测惊厥并分析缺氧缺血期间的EEG背景活动。联合使用视频与脑电图可描述惊厥的半定性特征并确认惊厥事件。该方法还可用于分析实验期间的功率谱图和EEG背景模式的变化趋势。在此缺氧缺血模型中，该方法可在损伤前记录EEG以获得正常基线，并在损伤期及恢复期持续记录。总的监测时间受限于幼鼠与母鼠分离不得超过四小时。尽管本文采用的是缺氧-缺血性惊厥模型，但该新生小鼠视频脑电图监测方法亦可应用于啮齿类动物的多种疾病模型和惊厥模型。
引言
缺氧缺血性脑病（HIE）是一种每年影响约千分之1.5新生儿的疾病，也是新生儿惊厥最常见的病因1,2。存活婴儿面临多种神经系统残疾的风险，如脑性瘫痪、智力障碍和癫痫3,4,5。
动物模型在理解与研究缺氧缺血及新生儿惊厥的病理生理机制中发挥着关键作用6,7。改良的Vannucci模型被用于在出生后第10天（p10）诱导缺氧缺血（HI）7,8。这一年龄段的小鼠幼崽在神经发育上大致相当于足月人类新生儿9。
将连续视频脑电图（EEG）监测与该损伤模型结合使用，有助于进一步理解并表征新生儿缺氧缺血性癫痫发作。以往的研究采用多种方法分析啮齿类动物的新生儿癫痫发作，包括视频记录、有限的脑电图记录以及遥测脑电图记录10,11,12,13,14,15,16。在下文的手稿中，我们将深入讨论在缺氧-缺血期间对幼鼠进行连续视频脑电图记录的过程。这种对新生幼鼠进行连续视频脑电图监测的技术可应用于多种疾病模型和癫痫模型。
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方案
所有动物实验均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 电极制备/电缆制备
- 使用单极绝缘不锈钢丝（裸线直径 0.005”，涂层后直径 0.008”）制作电极，并将其连接至雌性插座连接器（雌性插孔连接器 0.079）。
- 使用特制的定制电缆将动物连接至放大器。
- 将一个4针公头连接器（公头连接器 0.079”）连接至4通道单位增益阻抗匹配运算放大器（运放）。将一个10K电阻连接至与9 V电池相连的导线上。一条未连接至运放的接地导线作为电池的中点。
- 将电缆的一端（AWG，外径 0.012”）连接至运放，另一端连接至放大器。
2. 电极植入手术
- 将幼鼠（出生后第9天）置于向下气流罩内，使用4-5%异氟烷进行麻醉。在手术开始前，向幼鼠皮下注射布比卡因（0.02–0.05 mL，0.25%局部浸润）。
- 待动物完全不动后，将其转移至带有鼻罩的立体定位仪上。使用耳杆的反面固定头部，因其质地较软，适合固定；此阶段幼鼠耳道尚未发育完全，不可使用耳杆的尖端。
- 降低异氟烷气流，维持浓度在2.5–3%。在整个手术过程中密切观察幼鼠呼吸是否平稳。轻捏尾部以检测痛觉反应，确认麻醉效果后进行切口操作。
- 使用聚维酮碘和酒精对颅骨切口区域进行消毒（交替使用碘液和70%乙醇，共3个循环）。用手术巾覆盖周围身体部位，仅暴露手术区域。
- 从眼睛稍上方开始，沿前后方向切开头皮，并向后剥离约0.5 cm的皮肤。重新调整小鼠头部在立体定位仪上的位置，使皮肤向外牵拉，充分暴露颅骨。
- 用棉签在颅骨上涂抹过氧化氢，并使用手术刀片轻轻刮除颅骨表面组织至清洁。此时颅骨非常柔软，刮除时需格外小心。
- 在暴露的颅骨区域滴加一滴粘合剂（约50 µL），并用其配套工具将粘合剂均匀涂抹。暴露于紫外光下40秒，使粘合剂固化。
- 以暴露的前囟点作为参考坐标，双侧植入电极至海马CA1区［背腹向（DV）-3.5 mm，内外侧向（ML）±2 mm，深度（D）-1.75 mm］，双侧植入顶叶皮层［DV -1.22 mm，ML ±0.5 mm，D -1 mm］，并在小脑植入参考电极17。使用32 G针头在标记位置钻孔。
- 清除颅骨表面的血液。借助立体定位臂，将连接至雌性插座接头的电极缓慢插入脑内，并用牙科丙烯酸树脂固定。确保电极准确植入脑组织。插座接头装置位于颅骨顶部，通过牙科丙烯酸树脂粘合固定。
- 电极固定后，在肩胛间区皮下注射酮洛芬（5 mg/kg）。将幼鼠放回母鼠身边。
注意：应将一半数量佩戴装置的幼鼠同时归巢，而非逐个引入，以避免母鼠破坏幼鼠头戴装置。
3. 脑电图设置与记录（基线/损伤前）
- 电极植入后经过24小时恢复期，将每只动物放入一个加热至37 °C的定制有机玻璃舱内进行脑电图（EEG）记录。该舱室也可用作缺氧舱。
- 通过柔性电缆（定制的运算放大器电缆）将舱内的幼鼠连接至视频脑电图监测系统。
注意：佩戴头戴装置后，小鼠可自由活动，行为无明显异常。一旦电极导线连接完成，需在舱内束缚系统中适当调整导线松紧度，以提供合适的松弛量，确保幼鼠可在舱内自由移动。 - 使用Grass放大器以1000 Hz的采样频率和1K增益对脑电数据进行数字化。随后使用软件（例如LabChart Pro）回顾脑电信号（带通滤波范围为3–70 Hz）。
- 在将动物移出舱室进行颈动脉结扎手术前，先记录30分钟的损伤前基线脑电图。
4. 左颈总动脉结扎
- 将幼鼠（出生后第10天）置于向下气流麻醉罩中，使用4-5%异氟烷进行麻醉，并将其放置在水浴垫上特制的装置中。使动物呈仰卧位，并用纸胶带固定前肢。
- 将异氟烷流量降低至2-3%。轻捏尾部以检查疼痛反应，并在整个操作过程中监测呼吸情况。
- 用聚维酮碘和酒精对颈部左侧切口区域（下颌与锁骨之间）进行消毒（交替使用碘液和70%乙醇，共3个循环）。
- 使用显微剪刀在颈部左侧做一个约1 cm长的切口。在解剖显微镜下，小心分离皮下组织和皮肤，暴露颈总动脉。注意识别走行于动脉外侧的迷走神经，并轻柔地将其与动脉分离并牵开。
- 使用显微镊子将一段5 cm长的无菌丝线穿过动脉下方，并在动脉周围打双结扎线以阻断血流。
- 剪除多余的缝线，通过将皮下组织和皮肤复位来覆盖暴露的动脉。使用兽用粘合剂封闭切口。
- 将动物放回室温环境中的连续脑电图监测舱内，舱体置于加热垫上。使用点式红外测温仪检测幼鼠核心体温，避免打开监测舱。在进行低氧处理前，让动物恢复1小时。
5. 脑电图与缺氧
- 持续监测 FiO₂2 （吸入氧浓度）通过氧浓度监测仪在舱内进行监测。
- 以每分钟60升的流速用100%氮气冲洗腔室2 以及100% O₂时为0.415 L/min2当腔室内的氧饱和度达到12%时，将氮气流速降至10 L/min，同时保持氧气流速不变。2 流速保持不变。通过微调，维持 FiO₂2 8% 条件下持续 45 分钟
- 缺氧暴露45分钟后，将FiO₂2 至21%。
- 将幼崽置于恢复舱中，并在缺氧后通过脑电图连续监测2小时。
- 记录期结束后，将小鼠与脑电图记录设备分离，并放回母鼠身边。
6. 脑电图分析
- 使用 LabChart Pro 软件结合视频分析 EEG 文件。由一位盲法研究人员对 EEG 中的癫痫发作及背景模式进行标记17。癫痫发作定义为持续时间超过 10 秒的电生理事件，表现为高频节律性尖波放电（≥基线的 3 倍），并具有明确的演变过程17。
- 由第二位盲法研究人员随机抽查已标记事件，以评估一致性。
- 对每个标记的电生理事件同步审查对应视频，并依据新生啮齿类动物行为性癫痫发作评分16进行分析。简要而言，该评分范围为 0–6 分（从静止不动到严重的强直-阵挛行为）。为进一步描述发作的半定位特征，需分析行为的侧化性（多灶性/双侧运动 vs. 局灶性/单侧运动 vs. 混合性）。
- 生成功率谱图。采用快速傅里叶变换（FFT），使用大小为 1024 个数据点的余弦窗（Cosine-Bell）数据窗，通过 87.5% 的窗重叠率实现谱图横轴的平滑化。功率以 µV218 表示。
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结果
发作症状学
新生小鼠暴露于缺氧-缺血后，会出现全身性和局灶性癫痫发作（图1A-C）。通过视频脑电图（EEG）记录，可将脑电图表现与视频中的行为表现相对应。这些行为采用既往发表的新生啮齿类动物行为性癫痫发作评分（BSS）进行评分16。除BSS外，我们还根据行为表现为局灶性/单侧性、双侧性或混合性对事件进行了分类（图1B）。
在此模型中，小鼠通常表现出3种癫痫发作的临床特征：1）向结扎侧重复转圈并伴有对侧肢体伸展，2）姿势丧失并伴有躯干屈曲和尾巴偏向结扎侧，或3）姿势丧失并伴有单侧或双侧肢体划动（严重程度和持续时间各异）。大多数观察到的发作事件表现为局灶性/单侧性或混合性行为（图1B）。此外，在缺氧期间，部分小鼠出现非惊厥性癫痫活动，表现为幼鼠静止不动但脑...
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讨论
我们提出了一种在缺氧缺血性发作期间对新生小鼠进行连续视频脑电图（video-EEG）监测的模型。结合脑电图的视频分析可用于表征发作的半临床学特征。脑电图分析可提取功率谱图并进行背景振幅分析。
在本方案中，电极的正确且谨慎放置至关重要，因为在电极植入过程中造成的损伤或位置不准确会显著影响实验结果。在损伤前评估正常的基线脑电图（EEG）活动极为关键，因为尽管电极植入过程中发生出血或损伤的情况较为罕见，但仍有可能出现。其次，为了确认电极位置的准确性，可对脑组织进行切片并检查电极穿行轨迹是否位于正确位置。此外，若未将幼崽成组放回母鼠身边（而是单独放置），可能导致电极头戴装置受损，或幼崽被母鼠伤害或遗弃。
该方法的一个局限性在于，深度电极记录在微小的新生儿大脑中空间定位能力有限，这限制了在脑电图（EEG）记录中精确定位特定癫痫发作病灶的能力。在缺氧缺血模型中，另一个局限性是癫痫发作负荷的变异性。此前已有充分报道，在该啮齿类动物缺氧缺血模型中，病变范围和行为缺陷存在显著差异7,
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致谢
我们感谢以下资助来源：美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所——K08NS101122（JB）、R01NS040337（JK）、R01NS044370（JK），以及弗吉尼亚大学医学院（JB）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 外科手术 | |||
| 圆头涂布器 | Metrex Research | 8300-F | i-bond 涂布器 |
| 颅骨成形材料（粉剂/树脂） | Coltene | H00383 | Perm Reline/Power |
| I-Bond | Kulzer GmbH, Germany | ||
| LOOK 丝线缝合线 | Surgical Specialities Corporation | SP115 | LOOK SP115 黑色编织非吸收性外科缝合线 |
| RS-5168 Botvin 镊子 | Roboz Surgical Instrument | RS5168 | 用于手术/结扎的镊子 |
| RS-5138 Graefe 镊子 | Roboz Surgical Instrument | RS5138 | 用于手术/结扎的镊子 |
| I-Bond 用紫外灯 | Blast Lite By First Media | BL778 | I-Bond 用紫外灯 |
| Vannas 显微解剖剪 | Roboz Surgical Instrument | RS5618 | 用于结扎的剪刀 |
| Vet Bond | 3M Vetbond | 1469SB | 兽用胶水 |
| 缺氧 | |||
| 缺氧装置 | Starr Life Science | ||
| 氧气传感器 | Medical Products | MiniOxI—用于缺氧装置的氧气分析仪/传感器 | |
| 脑电图记录 | |||
| 0.079" 雌性插座连接器 | Mill-Max Manufacturing Corp | 832-10-024-10-001000 | 从 Digikey 订购 |
| Grass 放大器 | Natus Neurology Incorporated | Grass 产品 | |
| LabChart Pro | ADI Instruments | 用于运行系统的软件 | |
| 0.079" 雄性插孔连接器 | Mill-Max Manufacturing Corp | 833-43-024-20-001000 | 从 Digikey 订购 |
| 运算放大器 | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2274CD | TLC2274 四通道低噪声轨到轨运算放大器 |
| 运算放大器 | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2272ACDR | TLC2274 四通道低噪声轨到轨运算放大器 |
| 不锈钢丝 | A-M Systems | 791400 | 0.005" 裸线 / 0.008" 涂层线，100 英尺 |
| 超柔性导线 | McMaster-Carr | 9564T1 | 36 号多色导线 |
参考文献
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