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方法文章

小鼠全眼球消化用于单核吞噬细胞的多参数流式细胞术分析

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DOI：

10.3791/61348

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2020年6月17日

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了一种将完整眼球消化为单细胞悬液的方法，用于多参数流式细胞术分析，以鉴定特定的眼部单核吞噬细胞群体，包括单核细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

摘要

先天免疫系统在眼部病理生理过程中发挥着重要作用，包括葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变以及年龄相关性黄斑变性。先天免疫细胞，特别是单核吞噬细胞，表达重叠的细胞表面标志物，这使得鉴定这些细胞群体具有挑战性。多参数流式细胞术可同时对多种细胞表面标志物进行定量分析，从而区分小鼠眼内的单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞。本方案描述了完整小鼠眼球的摘除、眼部解剖、消化为单细胞悬液，以及对单细胞悬液进行髓系细胞标志物染色的步骤。此外，我们还解释了如何使用单色对照确定合适的电压，以及如何利用荧光减一对照（fluorescence minus one controls）划定阳性门控范围。多参数流式细胞术的主要局限性在于无法保留组织结构信息。这一局限可通过分别对眼内不同解剖区域进行多参数流式分析，或结合免疫荧光染色加以弥补。然而，免疫荧光技术受限于缺乏定量分析能力，且大多数显微镜可检测的荧光染料数量有限。我们介绍了利用多参数流式细胞术对激光诱导的脉络膜新生血管中单核吞噬细胞进行高通量定量分析的方法。此外，多参数流式细胞术还可用于巨噬细胞亚群的鉴定、细胞命运示踪，以及为转录组学或蛋白质组学研究进行细胞分选。

引言

先天免疫系统包含多种细胞类型，可刺激补体激活和炎症反应。先天免疫细胞包括自然杀伤（NK）细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞以及单核吞噬细胞。单核吞噬细胞由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成，已被证实参与多种眼科疾病的病理生理过程，包括葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变以及年龄相关性黄斑变性（AMD）1。在本实验方案中，我们将重点介绍在新生血管性AMD小鼠模型中，利用多参数流式细胞术鉴定单核吞噬细胞的方法2。该方案也可适用于糖尿病视网膜病变和/或葡萄膜炎的小鼠模型，但由于这些疾病具有全身性特征，建议进行更广泛的ocular解剖。

单核吞噬细胞表达重叠的细胞表面标志物。长期存在的组织驻留型巨噬细胞和小胶质细胞起源于卵黄囊来源的红髓系祖细胞3，而循环巨噬细胞和树突状细胞则由骨髓来源的巨噬细胞-树突状细胞祖细胞分化而来4。在小鼠中，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞共有的细胞表面标志物包括 CD45、CD11b5、F4/806、Cx3cr17，以及细胞内标志物 Iba18。为克服这一难题，通过对多个组织来源的巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞进行转录组分析，确定 CD64 为巨噬细胞特异性的细胞表面标志物6。在健康眼组织中，虹膜、脉络膜、睫状体和视神经中均已有巨噬细胞的描述3。相比之下，树突状细胞的鉴定更为困难；目前最特异的树突状细胞鉴定方法依赖于使用 Zbtb46-GFP 报告小鼠进行细胞命运图谱分析9。除该报告小鼠外，通过 CD11c 和 MHCII 的表达结合 CD64 的缺失，也可识别潜在的树突状细胞6,10。在正常眼组织中，角膜、结膜、虹膜和脉络膜中均已鉴定出树突状细胞11。小胶质细胞是位于视网膜内的特化巨噬细胞，受血-视网膜屏障保护，并起源于卵黄囊前体细胞12。因此，视网膜小胶质细胞可通过其 CD45 表达水平较低13以及 Tmem119 高表达（已有适用于流式细胞术的抗体）与单核细胞来源的巨噬细胞相区分14。然而，在小胶质细胞活化后，CD45 可能上调15，而 Tmem119 可能下调3，这体现了小胶质细胞生物学的复杂性，在年龄相关性黄斑变性（AMD）及其小鼠模型中可能具有重要意义。最后，单核细胞至少可分为两类亚型：经典型和非经典型。经典型单核细胞表达 CCR2+Ly6ChighCX3CR1low 表型，而非经典型单核细胞则表达 CCR2-Ly6ClowCX3CR1high 标志物5。

由于需要对标志物表达水平进行定量分析（即高水平与低/弱表达水平的区分），多参数流式细胞术是区分眼组织及其他组织中单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞的理想方法。该方法的其他优势包括可鉴定亚群、能够利用荧光激活细胞分选（FACS）对细胞群体进行分选以用于转录组或蛋白质组学分析，以及命运图谱追踪。多参数流式细胞术的主要缺点在于无法保留组织结构信息。这一局限可通过将眼部解剖为不同的眼内亚区（如角膜、结膜、虹膜、晶状体、视网膜以及脉络膜-巩膜复合体）来克服。此外，可辅以免疫荧光成像进行验证，但该方法受限于可检测标志物的数量，且缺乏可靠的定量能力。

全基因组关联研究已将多种补体基因与年龄相关性黄斑变性（AMD）联系起来16。补体激活可导致过敏毒素的产生、白细胞募集以及继发性炎症反应。在补体受体缺陷型小鼠中，激光损伤导致的单核吞噬细胞募集减少，且激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）面积减小17。类似地，C-C基序趋化因子受体2（CCR2）基因敲除小鼠因组织中单核细胞募集功能缺陷，也表现出单核吞噬细胞募集减少以及激光诱导的CNV面积减小18。这些数据表明补体系统和单核吞噬细胞与实验性CNV以及可能的新生血管型AMD相关。支持这一关联的证据显示，新生血管型AMD患者外周血单核细胞上的补体受体表达失调19,20。这些结果表明AMD与单核吞噬细胞之间存在显著关联。

在本研究中，我们将采用实验性激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）模型，通过多参数流式细胞术对小鼠眼部的单核吞噬细胞群体进行表征。激光诱导的CNV是新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的标准小鼠模型，已用于验证当前一线治疗方案的有效性21。本实验方案将描述小鼠眼球的摘除、眼部组织解剖、消化制备单细胞悬液、抗体染色、利用单色对照确定激光电压，以及使用荧光减一（FMO）对照进行设门策略分析。有关激光诱导CNV模型的详细描述，请参见先前发表的研究22。通过本方案，我们将鉴定小胶质细胞、单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞群体。此外，我们将利用MHCII和CD11c进一步定义激光诱导CNV模型中的巨噬细胞亚群。

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方案

所有实验程序均经西北大学机构动物护理与使用委员会批准。C57BL/6小鼠饲养于西北大学比较医学中心（伊利诺伊州芝加哥）的屏障设施内，采用群养方式。所有动物均保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环，并可自由获取食物和饮水。

1. 眼组织的采集

  1. 使用受控的二氧化碳吸入法处死10至12周龄的C57BL/6J小鼠（性别不限），直至小鼠无反应且不再呼吸。实施颈椎脱位或其他经批准的辅助方法以确保安乐死完成。
    注意：可进行经心脏灌注以清除未进入眼组织的循环白细胞。在本实验中，全身灌注不会减少在未经处理或经激光处理的完整眼球中检测到的小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的数量。因此，这些细胞类型的大多数位于眼组织内，此步骤为可选。
  2. 为摘除眼球，将弯曲镊子轻轻置于突出于眼眶外的眼球下方，同时在眼眶附近向下施力。在眼球下方夹紧镊子，但避免挤压眼球本身。将眼球从周围结膜组织中分离（详见先前发表文献）23。
  3. 将眼球向外侧牵拉，直至视神经成为唯一连接组织，继续牵拉以分离眼球。视神经通常在张力作用下自行断裂，但有时需使用小型剪刀切断视神经。将摘除的眼球置于含有钙离子和镁离子的冰冷1×Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，并放入1.7 mL微量离心管。

2. 眼组织的消化

  1. 准备消化缓冲液，其中包含 0.1 mg/mL 消化酶和 0.2 mg/mL DNase，溶于冷的 HBSS 中。首先将 5 mg 消化酶用 2 mL 无菌水重悬。用 HBSS 制备 10 mg/mL DNase 的初始稀释液。每配制 10 mL 消化缓冲液（足够处理 3 只动物），混合 9.4 mL 冷 HBSS、0.4 mL 重悬后的消化酶和 0.2 mL 稀释后的 DNase I。
    注：这些浓度是通过多次实验经验性确定的，旨在提供单细胞抗体染色的最佳水平，同时减少细胞死亡。曾尝试使用胶原酶 D 替代消化酶，但导致细胞活力降低和 CD45+ 细胞减少。有关优化消化条件的迭代过程的更多细节，请参见讨论部分。
  2. 在解剖显微镜下以 10 倍总放大倍数，使用精细镊子和弹簧剪刀在冷 HBSS 中去除残留的结膜和视神经。
  3. 将清洁的眼球转移至干燥的解剖皿或小型称量舟中。在眼球上通过视轴处制造两个穿刺伤口，其中一个用于注入消化缓冲液，另一个位于距第一个伤口 90˚ 的位置作为液体流出通道，然后使用配备 30 G 针头的注射器向玻璃体腔内注入 0.15–0.20 mL/眼的消化缓冲液。
  4. 使用弹簧剪刀和精细镊子将整个眼球剪碎，确保所有组织碎片小于 0.5 mm × 0.5 mm。通过镊子进行钝性机械破坏以解离晶状体组织，防止后续步骤中堵塞移液器吸头。对每个样本，分别用 0.75 mL 消化缓冲液冲洗镊子和剪刀至小皿中。每个样本使用新的培养皿。
  5. 使用 P1000 移液器将培养皿中的内容物转移至冰上的解离管中，注意在移液过程中避免损失任何材料。再用额外的 1.5 mL 消化缓冲液冲洗培养皿，使解离管中的总体积达到 3.25–3.50 mL。
  6. 将解离管倒置安装到电子解离仪上，运行预设程序“m_brain_03_01”，该程序包括在室温下以 200 rpm 转速进行 1 分钟单向旋转。确保所有组织均位于解离管底部，并与消化缓冲液及转子充分接触，此要求适用于本步骤及后续所有步骤。
  7. 将解离管放入摇床培养箱中，在 37 ˚C、200 rpm 条件下孵育 30 分钟。
  8. 重复步骤 2.6 和 2.7 一次。第二次孵育 30 分钟后，按照步骤 2.6 的方法使用电子解离仪进行最后一次机械消化。
  9. 加入 10 mL 冷的流式缓冲液以终止反应，并将试管置于冰上。

3. 细胞悬液的制备

  1. 为制备单细胞悬液，将终止消化反应后的眼组织混合液经40 μ将5 μm滤膜置于50 mL锥形离心管上。使用2.5 mL注射器的推杆，将未完全消化的眼组织残余物压过滤膜。
  2. 用10 mL流式缓冲液冲洗消化管，并在使用同一支推杆再次将未消化的眼组织碎片通过滤膜前，润洗滤膜。
  3. 重复步骤 3.2，使用 5 mL 流式缓冲液。
  4. 用最后 10 mL 流式缓冲液清洗解离管和滤器。
    注：每份样本的消化液和流式缓冲液总体积约为 38–40 mL。
  5. 将锥形管在400 × g下离心 x g 4 ℃下离心10分钟 ˚C. 倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  6. 通过将10倍浓缩的裂解液加入无菌水中，制备1倍工作浓度的裂解液。通过轻弹离心管撞击另一支试管使沉淀充分散开。为裂解红细胞，在室温（RT）下加入1 mL 1倍裂解液，轻轻旋转混匀，作用30秒。
  7. 用 20 mL 流式缓冲液终止反应。
  8. 将锥形管在400 × g下离心 x g 4℃下孵育10分钟 ˚C. 倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  9. 轻弹试管使其与另一试管碰撞，以重悬沉淀。每管加入 5 mL 冷的 1× HBSS。
  10. 离心管于400 × g离心 x g 4℃下10分钟 ˚C. 吸去上清液。

4. 单核吞噬细胞的细胞悬液染色

  1. 每份样本用冷的 HBSS 将 Live/Dead 染料按 1:5,000 稀释，制备 0.5 mL 的 Live/Dead 染色液。
  2. 使用 P1000 移液器将 Live/Dead 染料加入每个样本，确保完全重悬沉淀。将样本转移至 1.2 mL 微孔管中。
  3. 取少量样品（10 μL) 使用血细胞计数板或自动细胞计数器对细胞进行计数（参见4.4）。将样品在室温避光条件下与活/死细胞染料孵育15分钟。
  4. 使用台盼蓝对细胞进行计数，以确定每份样本中的活细胞数量。
    注意：通常情况下，2 只 10–12 周龄的 C57BL/6J 小鼠眼球所含细胞少于 2 × 10⁶ 个。6 活细胞
  5. 加入 400 μL 洗涤液重悬样本 μ冷流式缓冲液 L。在400 × g下，使用微量离心管架离心管子 x g 4°C 下 10 分钟 ˚C. 吸取上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  6. 将细胞充分重悬于 500 μ冷流式缓冲液 L。在400 × g下，于微量离心管架中离心管子 x g 4℃下，10分钟 ˚C. 吸取上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  7. 最多阻断 5 x 106 50 个活细胞 µL of Fc 封闭（使用纯化的抗小鼠CD16/CD32大鼠抗体，按1:50比例用冷流式缓冲液稀释）。若细胞数量超过5 x 106 活细胞，相应增加体积。
  8. 加入 Fc 将裂解液加入沉淀中，确保充分裂解样本。4℃孵育20分钟 ˚C.
  9. 加入50 μ抗体染色液 L（参见 表1 每5 x 10⁶细胞所用每种抗体的选择与用量）6 活细胞直接与F中的细胞相连c 封闭并充分混匀，在 4 ℃ 下孵育 30 分钟 ˚C.
    注意：抗体用量取决于流式细胞仪的配置，应在每个实验室和仪器上单独进行滴定。参见 表2 用于仪器配置滤光片和反射镜。进行抗体滴定时，首先采用生产商推荐的浓度，计算染色指数。通过测试不同抗体浓度（包括高于和低于生产商推荐浓度的范围），选择染色指数保持稳定的最低抗体浓度。同时，确保阳性染色信号亮度不超过单色对照的亮度。使用未染色细胞样本，确保阴性染色细胞处于量程范围内，且峰值位于或低于 1 × 102使用荧光减一对照来界定阳性染色的细胞。
  10. 加入 700 μL 缓冲液洗涤样本 μL 的冷流式缓冲液。在400 × g下，将离心管置于微孔板离心管架中离心 x g 4℃下10分钟 ˚C. 吸取上清液时避免扰动细胞沉淀。
  11. 可选地，在抗体染色后，样品可用500 μ2%多聚甲醛溶于流式缓冲液中，室温固定样品15分钟。随后按4.10步骤进行一次洗涤。将固定后的样品于4℃保存 ˚C. 应在流式细胞术数据采集当天加入计数微球。固定后的样本应在1-2天内上机进行流式细胞术检测。
    警告：多聚甲醛具有腐蚀性，且对健康有害。
  12. 再次使用 500 μL 冷流式缓冲液。在400 × g下，于微量离心管架中离心 x g 4℃下，10分钟 ˚C. 吸取上清液的一半，注意不要扰动细胞沉淀。
  13. 将沉淀重悬，并转移至96孔U型底检测板中。以400 × g离心板 x g 4℃下，5分钟 ˚C. 倒出上清液时，将培养板翻转，用力快速振荡一次，使液体流入水槽，注意勿扰动沉淀。
  14. 在新的1.2 mL微量滴定管中，加入50 μ充分涡旋混匀的计数微球的升数。
  15. 在96孔板中将沉淀重悬于200 μ250微升冷流式缓冲液。将上一步的细胞混合物加在磁珠上层，总体积为250微升，上机进行流式细胞仪检测。 μL / 微量滴定管

5. 流式细胞术数据的采集

  1. 开启并准备流式细胞仪。此处列出的说明适用于改装的四激光细胞仪（表2）。
  2. 运行测试样本，其中包含来自每个样本的小量等分试样，以确保所有细胞在每个检测器上均处于量程范围内。调整电压，使所有细胞均在量程内。
  3. 对染色混合物中使用的每种荧光染料运行单色对照（SCC）（表3）。将微量滴定管放入较大的5 mL聚苯乙烯管中，以便放置到流式细胞仪的进样台上。
    注意：BV421（太平洋蓝）、FITC、PE、Alexa647（APC）和Alexa700等母体荧光染料不需要与染色混合物中相同的抗体（例如，CD64 PE染色无需使用CD19 PE抗体）。然而，由于偶联荧光染料可能发生解离，PE-CF594、PE-Cy7或APC-Cy7等串联荧光染料需要使用与染色混合物相同的抗体进行SCC。
    1. 通过向1.2 mL滴定管中加入2滴补偿微珠以及1 μL仓鼠抗小鼠CD11c BV421来制备BV421的SCC。使用补偿微珠的原因是CD11c BV421为IgG lambda亚型，而非5.3.3节所述的kappa亚型。在4 ˚C孵育15分钟。加入0.2 mL流式缓冲液。
    2. 通过向胺反应性微珠中的阳性染色微珠（绿色盖）加入一滴，再加入1 μL活/死染料来制备活/死染料的SCC。在室温避光条件下孵育15分钟。加入一滴胺反应性微珠中的阴性微珠（白色盖）。加入0.2 mL流式缓冲液。
    3. 通过向1.2 mL滴定管中加入一滴抗大鼠和抗仓鼠Ig kappa微珠组中的阳性染色微珠（绿色盖），再加入所列抗体用量（表3），制备其余SCC。在4 ˚C孵育15分钟。加入一滴抗大鼠和抗仓鼠Ig kappa微珠组中的阴性微珠（白色盖）。加入0.2 mL流式缓冲液。
    4. 充分涡旋混合所有微珠悬液。SCC可在4 ˚C保存最多3天。
      注意：荧光报告小鼠的SCC为未染色细胞。
    5. 运行SCC时，设置电压，使SCC样本在相同检测器通道中的荧光峰值高于任何细胞样本的荧光信号。此外，电压应设置为使任一SCC在目标通道与其在其他任何通道的直方图峰值之间至少有0.5对数单位的差异（图1）。
  4. 以“低速”运行样本，保持每秒事件数低于4000。若无法适当降低流速，可用额外的冷流式缓冲液稀释样本。记录所加体积，因后续计数计算需要此数据（见代表性结果）。
  5. 每个样本至少采集3 × 106个事件。由于色素颗粒和碎片在细胞仪上也被计为事件，此数值可能高于实际细胞数量。
  6. 除活/死染料外，对每种荧光染料记录一个荧光减一对照（FMO），以用于第6.4节中的正确设门策略。FMO是指除一种荧光染料外其余均染色的样本。
  7. 根据制造商或设施的操作说明清洁并关闭流式细胞仪。

6. 流式细胞术数据的注释

  1. 使用分析软件打开一个新的工作表。从细胞仪导入所有样本和单色对照的 FCS 文件。
  2. 使用单色对照（SCCs）创建补偿矩阵。
  3. 将补偿矩阵应用于染色样本和荧光减一对照（FMOs）。
  4. 使用荧光减一对照（FMOs）确定阳性染色以绘制设门。

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结果

图1 显示了SCC和细胞在红色激光下的非补偿频率直方图：Alexa647、Alexa700和APC-Cy7。在 图1A，品红色线条表示 Alexa647 的 SCC 峰值，而青色线条表示预期的 0.5 Log 差异。注意 Alexa700 和 APC-Cy7 的峰值位于青色线条左侧（亮度较低）。还需注意，所有细胞均位于品红色线条左侧。任何位于 SCC 峰值右侧的细胞均未被补偿。根据荧光染料的化学特性，某些特定通道已知会渗漏至其他通道（例如，紫激光：BV421 -> V500，黄绿激光：PE -> PE-CF594，红色激光：Alexa647> Alexa700，Alexa700 -> APC-Cy7，交叉激光：PE-Cy7 -> APC-Cy7）。如果上述任一条件未满足，则可向上调整一个通道的电压，同时将任何溢出通道向下调整。参见 图1B 和 图1C 有关红激光的更多示例...

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讨论

多参数流式细胞术可对复杂组织中的多种细胞类型进行定量分析。本报告中，我们描述了在小鼠眼部激光损伤后，通过流式细胞术检测单核吞噬细胞群体（包括单核细胞、树突状细胞以及巨噬细胞亚群）的方法。Liyanage 等人近期报道了一种类似的设门策略，用于检测中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、树突状细胞（DC）、巨噬细胞、浸润性巨噬细胞和单核细胞27。我们的设门策略主要区别在于加入了CD64标记。Liyanage 等人将树突状细胞定义为CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+细胞，巨噬细胞定义为CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G-细胞。我们则将树突状细胞定义为CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

JAL 获得美国国立卫生研究院（NIH）K08EY030923 项目资助；CMC 获得美国国立卫生研究院国家关节炎与肌肉骨骼疾病研究所 K01 项目（5K01AR060169）以及狼疮研究联盟新研究项目（637405）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.6 ml 微型离心管Fisher Scientific05-408-120
1.7 ml 微量离心管Costar3620
10 ml 移液管Fisher Scientific431031
15 ml 离心管ThermoFisher339650
1× HBSS，500 mlGibco14025-092
2.5 ml 注射器Henke Sass Wolf7886-1
20% 甲醛溶液电子显微镜科学公司15713-S
25 ml 移液管Fisher Scientific431032
30 G 针头Exel26437
3 ml 鲁尔锁型注射器Fisher Scientific14955457
41 x 41 x 8 mm 聚苯乙烯称量皿Fisher Scientific08-732-112
50 ml 离心管Falcon352070
96孔U型底无盖检测板Falcon353910
胺反应性微珠赛默飞世尔科技A10628
分析软件FlowJov 10
抗大鼠和抗仓鼠Ig kappa微珠试剂盒BD 生物科学552845
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室664
细胞计数仪InvitrogenAMQAX1000
细胞计数板InvitrogenC10283
补偿微珠ThermoFisher01-1111-42
计数微珠赛默飞世尔科技01-1234-42
弯头镊子Fisher Scientific16-100-123
消化酶Sigma Aldrich5401020001
解剖显微镜国家光学与科学仪器公司DC3-420T
解离管Miltenyi Biotec130-096-334
DNase罗氏10104159001
电子解离仪Miltenyi Biotec130-095-937
FACS Diva 软件BD 生物科学
Fc阻断剂，大鼠抗小鼠CD16/CD32BD 生物科学553142
精细镊子Integra Miltex17035X
流动缓冲液Miltenyi Biotec130-091-221
流式细胞仪BD 生物科学
流式管Falcon352008
仓鼠抗小鼠 CD11c BV421BD 生物科学562782
冰桶Fisher Scientific07-210-123
活/死染料赛默飞世尔科技65-0866-14
裂解液，10倍浓缩液BD 生物科学555899
微量离心管及管架Fisher Scientific02-681-380
小鼠抗小鼠CD64 PEBioLegend139304
小鼠抗小鼠 NK1.1 PECF594BD 生物科学562864
P1000 移液器吸头德文特科学P2404
P1000 移液器GilsonFA10006M
P2 移液器吸头Eppendorf22491806
P2 移液器GilsonFA10001M
P20 移液器GilsonFA10003M
P200 移液器吸头德文特科学P2401
P200 移液器GilsonFA10005M
移液器Fisher ScientificFB14955202
大鼠抗小鼠 B220 PECF594BD 生物科学562313
大鼠抗小鼠 CD11b APC-Cy7BD 生物科学557657
大鼠抗小鼠 CD19 AlexaFluor 700BD 生物科学557958
大鼠抗小鼠 CD19 PEBD 生物科学553786
大鼠抗小鼠 CD4 PECF594BD 生物科学562314
大鼠抗小鼠 CD45 FITC赛默飞世尔科技11-0451-82
大鼠抗小鼠 CD45 PE-Cy7BD 生物科学552848
大鼠抗小鼠 CD8 PECF594BD 生物科学562315
大鼠抗小鼠 Ly6CBD 生物科学561085
大鼠抗小鼠 Ly6G PECF594BD 生物科学562700
大鼠抗小鼠MHC II AlexaFluor 700BioLegend107622
大鼠抗小鼠 Siglec F PECF594BD 生物科学562757
大鼠抗小鼠 Tim4 AlexaFluor647BD 生物科学564178
摇床培养箱Labnet311DS
弹簧剪Fine Science Tools15024-10
无菌细胞筛，40 mm 尼龙网Fisher Scientific22363547
无菌水，500 mlGibcoA12873-01
水平转子离心机Eppendorf5910 R
0.4% 台盼蓝溶液Gibco15250061

参考文献

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小鼠全眼球消化用于单核吞噬细胞的多参数流式细胞术分析
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