利用双侧子宫内电穿孔技术研究基因对啮齿类动物行为影响的实验流程

摘要

新近发现的疾病相关基因在神经精神障碍发病机制中的作用仍不明确。一种改良的双侧子宫内电穿孔技术可实现将基因转入大量神经元群体中，并可用于研究基因表达变化对社交行为的因果影响。

摘要

随着全基因组关联研究揭示了多种神经系统疾病复杂的遗传基础，研究特定基因对大脑发育和功能贡献的需求日益增加。依赖小鼠模型来研究特定基因操作的作用并不总是可行的，因为转基因小鼠品系成本高昂，且许多新发现的与疾病相关的基因目前尚无商业化的遗传品系。此外，构建一个转基因小鼠品系可能需要数年的开发和验证时间。在体电穿孔技术（in utero electroporation）提供了一种相对快速且简便的方法，可在体内以细胞类型特异性的方式调控基因表达，仅需构建一个DNA质粒即可实现特定的遗传操作。双侧在体电穿孔可用于靶向大量前额叶皮层的锥体神经元。将这种基因转移方法与行为学研究相结合，可用来探究遗传操作对前额叶皮层神经网络功能以及幼年和成年小鼠社交行为的影响。

引言

全基因组关联研究（GWAS）推动了与脑部病理相关的新候选基因的发现^1,2,3,4。这些研究在理解严重神经精神疾病（如精神分裂症，SCZ）方面尤其具有重要意义，其中对新基因的探索已成为开展新研究方向和治疗干预的起点^5,6。携带精神分裂症风险的基因在产前及出生后早期发育阶段的前额叶皮层（PFC）中表现出表达偏倚，而该脑区已被证实与多种神经精神疾病的病理过程相关⁷。此外，精神疾病的小鼠模型也显示出PFC神经网络活动异常^6,8,9。这些结果提示，与精神分裂症相关的基因可能在该脑区的发育连接过程中发挥一定作用。为进一步明确这些候选基因在PFC神经连接建立中的作用，并确定其是否在神经精神疾病的发生中具有因果性，有必要利用动物模型进行深入研究。在小鼠中应用可调控基因表达的技术，以研究产前及出生后早期发育过程中特定神经环路的基因表达变化，是解析基因表达改变与PFC功能障碍之间分子机制的有力手段。

转基因小鼠品系为研究特定基因对大脑发育和功能的影响提供了一种方法。然而，依赖转基因小鼠可能存在局限性，因为在商业上并不总能获得可用于研究特定基因对发育中神经回路影响的小鼠品系。此外，构建定制小鼠品系可能极为昂贵且耗时。结合转基因小鼠与病毒学方法的交叉遗传操控策略，已彻底改变了人们对大脑的理解^10,11,12。尽管已取得诸多进展，病毒学策略仍存在某些局限性，具体取决于所使用的病毒载体类型，例如包装容量有限可能限制病毒表达¹³，以及病毒表达相关的细胞毒性¹⁴。此外，在大多数实验条件下，使用腺相关病毒（AAVs）实现稳定的基因表达需要大约2至4周时间¹⁵，这使得常规病毒策略难以在出生后早期发育阶段对基因进行操控。

子宫内电穿孔（IUE）是一种可实现快速且低成本基因转导的替代方法^16,17，当其与荧光标记、药理遗传学或光遗传学方法结合时，为解析神经元环路的功能提供了强大的平台。此外，随着CRISPR-Cas9基因组编辑技术的发展，可通过细胞类型特异性的基因敲低或敲除，或通过启动子调控，实现基因的过表达或精确修饰^18,19。当需要在狭窄的发育时间窗内检测基因对神经元环路的影响时，使用IUE进行基因操作尤为有利²⁰。IUE是一种多功能技术，通过将基因插入特定启动子驱动的表达载体中，即可轻松实现过表达。通过使用不同强度的启动子或可诱导型启动子以实现基因表达的时间控制，可进一步增加对基因表达的调控能力^21,22。此外，IUE能够靶向特定皮层层、细胞类型及脑区内的细胞，而这一点在其他方法中并不总能实现^5,17。近年来，基于三电极配置的IUE技术取得进展，该配置可产生更高效的电场分布，拓展了该方法的功能范围，并使研究人员能够靶向新的细胞类型，同时提高靶向效率、精确度及可靶向细胞的数量^23,24。该技术最近被用于确定与精神分裂症（SCZ）相关的基因补体成分4A（C4A）在前额叶皮层（PFC）功能和早期认知中的因果作用⁵。

本文介绍了一种实验流程，该流程结合基因转导技术，靶向投射至额叶皮层（包括前额叶皮层PFC）的大群兴奋性神经元，并联合行为学范式，不仅能够研究细胞和神经环路水平的变化，还可持续监测小鼠从早期出生后发育阶段直至成年期的行为表现。首先描述了一种双侧转染额叶皮层区域第2/3层（L2/3）大量锥体神经元的方法。随后，概述了用于检测幼年及成年小鼠社交行为的任务范式。在完成行为学任务后，可通过细胞计数来量化转染细胞的数量及其分布位置。此外，还可将转染细胞的数量与行为学数据进行相关性分析，以确定转染细胞数量的增加是否会导致更显著的行为改变。

方案

所有实验方案均根据美国国立卫生研究院（NIH）动物研究指南进行，并经波士顿大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. DNA 溶液的制备

1. 购买商用质粒，或将目的基因亚克隆至含有目标启动子的质粒中。本实验中使用了携带CAG启动子驱动EGFP表达的质粒（pCAG-EGFP）。
   注意：应根据所需表达水平选择合适的启动子。通常情况下，CAG启动子驱动的质粒可实现较高的外源基因表达水平，而细胞类型特异性启动子（例如神经元中的突触素启动子）活性相对较低。实验者应通过实验确定每种质粒的适宜表达水平。
2. 转化细菌，并在含有适当抗生素的细菌培养基中扩增菌种。
   1. 从-80 °C取出感受态细胞（DH5α细胞），冰上解冻20分钟。
   2. 将100 pg至100 ng质粒DNA与30 μL感受态细胞混合，冰上孵育20分钟。
   3. 在42 °C水浴中热激45秒，随后立即将离心管放回冰上冷却2分钟。
   4. 向转化后的感受态细胞中加入200至1,000 μL LB培养基，在37 °C摇床培养箱中培养45分钟。
   5. 取200 μL转化后的菌液涂布于含适当抗生素的LB琼脂平板，37 °C过夜培养。
   6. 次日，挑取单菌落接种于200 mL含适当抗生素的LB液体培养基中，37 °C摇床培养过夜。
3. 使用质粒大提试剂盒纯化质粒DNA。
   1. 按照所用大提试剂盒说明书操作。在洗脱步骤中，不要使用试剂盒提供的洗脱缓冲液，而应使用200 μL无菌1×PBS或分子生物学级水进行洗脱。
   2. 确保最终DNA浓度高于1 μg/µL。若目的基因所在质粒不含报告基因，则需同时准备一个携带报告分子（如绿色荧光蛋白GFP）的质粒用于共转染，以便观察转染细胞。
4. 手术前配制DNA溶液：将质粒DNA用1×PBS稀释至每种质粒终浓度为1 µg/µL。向DNA溶液中加入快绿染料，使其终浓度为0.1%。对于双侧注射，每只母鼠准备60 µL溶液（约供10只仔鼠使用）。
   注意：若质粒不含报告基因，应与GFP质粒共电穿孔。共电穿孔效率通常可达95%或更高。据本实验室经验，共转染不影响转染效率。所有用于电穿孔的质粒均应稀释至1 µg/µL。

2. 购买或繁殖配准孕鼠

1. 若订购妊娠时间明确的小鼠，应确保小鼠在胚胎发育第13天（E13）或更早时间到达，以便母鼠有充足时间适应动物饲养环境。 本实验方案中所有实验均使用CD-1远交系小鼠。
   注意：提前数天订购可减少动物应激反应，提高仔鼠存活率。
2. 若自行配种繁殖妊娠小鼠，每周一次将雌鼠与雄鼠过夜合笼。次日早晨检查阴道栓（E0.5）。通过监测雌鼠体重变化判断是否妊娠。
   注意：不同品系小鼠在妊娠期间的体重增长幅度不同，因此需确定所用小鼠品系的典型增重范围。
3. 无论订购还是自行繁殖小鼠，为减少母鼠应激，应在笼内放置筑巢垫料和小鼠屋。降低应激有助于提高仔鼠存活率。

3. 三叉电极的设计与组装

1. 使用厚度为 0.063 英寸的 2 级钛板作为电极触点的原料。
2. 采用标准机械加工技术或精密手动工具，将电极加工成以下尺寸：20 mm × 5 mm，尖端为圆头，背面带凹槽。使用细粒砂纸去除任何毛刺或粗糙边缘。
3. 为连接电极导线，将 22 号多股铜线缠绕在电极的凹槽上，并通过焊接固定。使用热缩管保护该连接处。
4. 然后，使用额外的热缩管将连接好的电极固定在可高压灭菌的非导电镊子上，制成两个负极。将单个正极固定在可高压灭菌的非导电材料上（例如去掉刷头的牙刷柄）。在导线的开口端安装标准香蕉插头。

4. 手术准备

1. 在手术前至少30分钟将怀孕的母鼠转移至手术区域，以减少从动物饲养设施转运后产生的应激反应。
2. 使用灭菌杀菌湿巾对整个手术区域进行消毒，随后用70%乙醇擦拭。手术开始前更换手套。
3. 使用玻璃珠灭菌器对已高压灭菌的器械进行灭菌处理。
4. 将无菌1×PBS（每只母鼠约50 mL）转移至50 mL锥形管中，并置于38–40 °C水浴中的试管架上。使用温度计检测无菌生理盐水的温度。
5. 开启水循环加热泵，确保在手术开始前预热至37 °C，以维持小鼠在手术期间的体温。 
6. 打开压力注射仪和电穿孔仪，并在手术前确认其正常工作。
7. 将质粒DNA溶液（步骤1.4中获得）在台式离心机中短暂离心，随后置于冰上。
8. 使用拉针仪拉制玻璃毛细管，使拉制后的玻璃毛细管尖端直径约为50 µm。
9. 用20–40 µL DNA溶液（步骤1.4中获得）填充毛细管。
10. 准备手术所需的所有物品，包括脱毛膏、碘伏、70%乙醇、棉签、眼膏、缝合线、纱布等。
11. 准备手术记录单，并填写必要信息，如小鼠编号和体重、手术日期、术者姓名等。

5. 体内电穿孔手术

1. 手术前称量小鼠体重，并将数据记录在手术记录单上。
2. 将怀孕小鼠（E16）置于诱导麻醉舱中，使用4%（v/v）氧气-异氟烷混合气体进行吸入麻醉。小鼠麻醉诱导完成后，转移至面罩吸入维持，异氟烷浓度维持在1–1.5%（v/v），并在整个手术过程中持续监测呼吸。确认小鼠已完全麻醉，呼吸频率应约为每分钟55–65次。
3. 术前给予镇痛药物：皮下注射布托啡诺（3.25 mg/kg）和美洛昔康（1–5 mg/kg），最大给药体积为10–30 ml/kg。
4. 使用脱毛膏或小心使用剃刀去除腹部毛发。用聚维酮碘和70%乙醇擦拭腹部进行消毒，重复至少3次。使用无菌纱布在腹部周围建立无菌区域，也可使用无菌手术巾。
5. 沿腹中线做一3–4 cm的皮肤切口，操作时用镊子轻轻提起皮肤，避免损伤下方肌肉。随后切开肌肉层，同样需小心提起肌肉，防止损伤重要器官。
6. 使用环形镊子小心将子宫角从母鼠体内拉出，并轻柔地放置于无菌区域，确保子宫角有软垫支撑，且不被过度牵拉远离母体。此后在整个手术过程中，持续使用预热的无菌1×PBS保持子宫角湿润。
7. 使用镊子或手指固定胚胎位置。将拉制的玻璃移液管 以与头部水平面呈45度角的方向小心插入侧脑室，侧脑室可肉眼识别，位于脑中线与眼睛之间。通过将移液管依次插入两个侧脑室（推荐方法），或向一侧脑室注射DNA溶液直至液体扩散至双侧脑室，向每个侧脑室注射约2–3 μL。若注射后出现新月形，则表明成功靶向侧脑室。
   注意：玻璃移液管尖端可能在手术过程中断裂。若发生此情况，应更换新的移液管，并在准备和填充新移液管期间确保子宫角持续保持湿润。
8. 为在额叶皮层双侧转染细胞，将两个负极电极置于胚胎头部两侧，位置略靠侧方并稍偏尾侧于侧脑室，正极电极置于两眼之间，位于发育中的吻突前方。
9. 确保胚胎充分湿润。施加四个方波脉冲（脉冲持续时间=50 ms，脉冲幅度=36 V，脉冲间隔=500 ms）。
10. 逐一注射并电穿孔所有胚胎，确保每个胚胎在DNA溶液注射后立即进行电穿孔。所有胚胎完成电穿孔后，小心将子宫角重新放回腹腔。此步骤中，可在腹腔内涂抹无菌1×PBS，以辅助子宫角复位。
11. 用无菌1×PBS填充腹腔，确保缝合完成后无残留气泡。使用可吸收缝线缝合肌肉层，使用不可吸收丝线缝合皮肤。
12. 将母鼠置于加热舱内，使其完全恢复，至少观察1小时。术后48小时内定期检查母鼠状态。随着麻醉作用消退并恢复意识，母鼠将开始活动并出现胡须颤动。
13. 若母鼠出现疼痛迹象（如蜷缩身体、呼吸急促），应给予术后镇痛药物。仅在出现疼痛表现时给药，因为皮下注射可能对母鼠造成应激；但若实验组给予镇痛药，则对照组也应给予，反之亦然。

6. 通过母婴互动任务检测早期社交行为

注意：本方案改编自先前的出版物^5,25。应在小鼠出生后第18至21天进行此操作。

1. 母体归巢行为在母体互动 I（MI1）任务中的观察。
   1. 确保在执行任务前的一周内不更换笼具垫料。
   2. 准备或制作一个易于清洁的开放场地（OF）实验装置（推荐使用丙烯酸材料），尺寸如下：50 × 50 × 30 cm（长×宽×高）。行为测试期间的光照条件可根据实验目的进行调整，光照会影响动物的觉醒水平和类似焦虑的行为表现。行为实验应在实验箱中央上方设置弱光（约20 lux）条件下进行录像记录。
   3. 在行为测试前两天，通过将母鼠置于实验箱角落的金属网杯（如铅笔杯）下方，每天适应5分钟，使其适应实验环境。
   4. 在测试当天（可在出生后第18至21天之间，即断奶前），使用消毒湿巾和70%乙醇彻底清洁实验箱。
   5. 在实验箱内设置两个对角，分别放置干净垫料，另一个角落放置来自幼鼠原笼的污染巢垫料。
   6. 让每只幼鼠在实验箱中自由探索3分钟，起始时将其放置在无垫料的中性角落。
      注意：使用30 fps的摄像机记录行为。每只幼鼠测试后需彻底清洁实验箱，并更换新鲜垫料。为避免因环境噪音或光照等因素导致的角落偏好，应交替设置干净垫料与巢垫料的位置。若在出生后第18至21天的发育窗口期内测试多个窝次，应每天在同一时间进行行为实验。同时确保在同一天内，对照组和实验组平行进行测试。
2. 母体社交互动在母体互动 II（MI2）任务中的观察
   1. 在完成MI1任务后立即进行本项任务。
   2. 设置实验箱，使一个角落放置一个空的金属网杯，对角放置罩在金属网杯下的母鼠。若小鼠能够移动网杯，可在杯顶用胶带固定配重物以防止移动。在另一个角落放置来自原笼的污染巢垫料。
   3. 开始MI2任务。将幼鼠放置在空角落，以30 fps记录5分钟内的行为，允许其自由探索。每只幼鼠单独测试，且每只测试后需彻底清洁整个实验箱及金属网杯。

7. 成年个体社会行为任务的检测

1. 在成年小鼠（P60-P70或更老）中进行成年期社交行为测试，这些小鼠此前已接受MI1和MI2任务测试。此处收集的数据来自另一个独立的队列。
2. 对成年小鼠连续3天进行抓握操作，使其适应实验人员。确保仅由已与小鼠熟悉化的实验人员进行行为实验，理想情况下由同一人完成所有任务。
3. 让小鼠在开放场（OF）装置中连续适应3天，每天5分钟。
4. 通过新物体识别任务检测行为，以评估一般运动能力及对新物体的兴趣。如果小鼠在社交互动中存在特异性缺陷，该步骤将有助于更准确地解释其社交行为表现。 
   1. 将小鼠放入装置中5分钟，装置的一个角落放置一个新物体（表面光滑、可清洁的小型塑料玩具）。每次测试之间需用70%乙醇彻底清洁装置。
   2. 在新物体识别测试中，将此前暴露过的、现已熟悉的“新物体”放置在一个角落，同时在对角放置一个新的陌生物体。所有任务中，不同试验之间应交换物体所在角落，作为对照。 
   3. 在新社交互动测试中，确保新引入的小鼠在年龄、品系和性别上相匹配，并提前连续两天、每天5分钟适应金属网杯环境。每次试验时，将一只新的陌生小鼠置于金属网杯下，对角放置一个空的金属网杯，允许测试小鼠在装置中自由探索5分钟，同时记录其行为。每次试验之间需彻底清洁装置及金属网杯。

8. 分析行为学数据

1. 使用 DeepLabCut（https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut）进行基本的身体部位追踪。有关安装和使用 DeepLabCut 的详细说明可在其 GitHub 页面上找到。此外，还提供了一个基于 Python 的自定义库 'dlc_utils'（https://github.com/balajisriram/dlc_utils），用于在完成基本身体部位追踪后对数据进行进一步分析。有关如何使用该库的更多细节，请参见其 GitHub 页面。
   1. 使用 Anaconda 安装流程安装 DeepLabCut。同时安装支持图形用户界面（GUI）的仅限 CPU 版本和启用 GPU 的版本，后者用于网络训练。
   2. 按照以下链接中的说明创建用于追踪身体部位的项目。简要步骤包括：从数据集中选取若干帧样本，并在这些样本帧中手动标记相关身体部位。训练 DeepLabCut 网络以预测身体部位，并验证训练后的网络是否表现良好。
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
   3. 为了在开放场环境中追踪动物位置并识别简单交互行为，需识别动物的质心、头部（操作定义为两耳之间的中点）、左耳和右耳，以及吻部和尾基部。追踪多个身体部位可在某些部位因遮挡而缺失时，实现合理的替代估算。
   4. 除动物身体部位外，还需追踪与环境相关的多个点位，例如行为箱的边缘。这些参考点可在多次实验会话中实现可重复的定位估算，即使行为装置相对于摄像机的位置在不同会话间略有变化。
   5. 在对行为数据中的身体部位完成追踪后，应根据视频每一帧预测结果的置信度对预测的身体部位位置进行滤波处理。低置信度的预测通常与被遮挡的身体部位有关。对于此类预测，可使用其他合适的身体部位进行替代，或利用其他已知部位的位置推断该部位的可能位置。在大多数开放场应用中，啮齿类动物身体的质心极少被遮挡，能够以高准确性和精确度进行预测。
   6. 利用预测的质心位置以及环境中追踪点的位置，估算动物行为的多种特征。例如，在开放场实验中，可通过位置的时间导数计算动物的运动速度。
2. 为避免偏倚，在可能的情况下，所有实验应相对于实验分组“盲法”进行，尤其是在结果评估存在主观因素时。通过将数据合并为雄性和雌性组，检验性别差异对主要实验结果的影响。所有统计检验均设计为在各组间使用相等数量的动物进行比较。

9. 转染细胞数量的特征分析：事后细胞计数

1. 确定每只小鼠转染的细胞数量，因为并非所有小鼠都能成功转染，且转染细胞的数量存在个体间差异。一种实现方法是：在交替的冠状切片中计数转染的神经元，然后通过插值法估算转染细胞的总数。为此，需对每隔一个的冠状切片（50 μm）进行成像和计数。
   1. 使用4%多聚甲醛经心脏灌注固定组织，随后解剖取出脑组织。经蔗糖 cryoprotection 后，将脑组织切成50 μm厚的冠状切片。
   2. 对于前额叶皮层，计数从Bregma前+2.75 mm至+1.35 mm范围内的细胞。该坐标范围包含前额叶皮层区域，并包括部分体感皮层（S1）。 采用此方法时，在更尾侧的皮层区域或皮层下区域未观察到转染细胞。
   3. 务必区分左右半球，例如在切片过程中用针孔标记其中一个半球，并对双侧细胞进行计数。可使用自动细胞计数软件或手动计数，通过DAPI确认细胞核的存在以判断完整细胞体。
2. 获得细胞计数数据后，设定纳入分析的阈值。例如，仅将双侧均成功电转的小鼠纳入分析。在进一步分析中，可将转染细胞数量与行为学反应进行相关性分析，以判断是否存在关联。该技术会靶向多个脑区，因此有必要提供哪些脑区发生了基因操作的具体信息。
   注意：某些基因的操作可能会影响神经元迁移、命运决定和/或细胞死亡。在细胞计数过程中，应仔细检查脑组织解剖结构，确保每个转染的神经元位于预期被转染的皮层层内（即L2/3）。此外，可通过测量软脑膜至皮层第6层（L6）的距离，对皮层厚度等大体解剖学指标进行定量分析。

结果

定制电穿孔仪及三叉电极的成功研发与应用。
针对子宫内电穿孔转染（IUE），基于先前报道的设计²⁷，构建了一种低成本的定制电穿孔仪（图1A 和 图2）。三叉电极的制备方法如下^23,24：使用塑料镊子，在叉尖处连接两个负极，正极则连接在牙刷柄末端（图1B）。电穿孔仪和三叉电极均经过测试，以确保其功能正常。IUE操作包括暴露子宫角、注射质粒DNA并对每个胚胎进行电穿孔（图1C）。如图所示，三叉电极可较为方便地用双手持握（图1B，右），利用叉尖稳定胚胎头部。通过IUE将GFP标记于L2/3层前额叶皮层（PFC）的锥体细胞胞体及其突起，从而证实了基...

讨论

本文描述了一种结合在大量前额叶皮层神经元中操控新感兴趣基因与小鼠行为学检测的技术流程。此外，该流程允许对同一批小鼠在出生后早期发育阶段及成年期进行纵向行为学研究。该技术避免了依赖遗传动物模型所带来的高昂时间与经济成本。本方案的优势在于，可用于研究近期全基因组关联研究（GWAS）已发现新遗传关联的神经发育性和神经精神类疾病^28,29。尽管该方法可实现兴奋性神经元的细胞类型特异性转染，但其局限性在于较难靶向其他脑细胞类型，如中间神经元或胶质细胞。然而，已有多个研究提出经改进的方法以靶向其他脑细胞类型^30,31。此外，通过调整电极相对于胚胎头部的位置并改变宫内电转（IUE）的时间，还可实现对其他脑区的双侧转染，包括海马、杏仁核、小脑以及视觉、体感和运动皮层^24,32。同时，在不同发育阶段进行宫内...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
13毫米丝线黑色编织缝合线	Havel's	SB77D	缝合皮肤
艾德森镊子	F.S.T.	11006-12	宫内电穿孔（IUE）
C270网络摄像头	罗技	N/A	记录行为
电穿孔仪	定制组装	N/A	参见图1、图2及Bullmann等，2015年
EZ-500离心柱质粒DNA大提试剂盒，20次	Bio Basic Inc.	BS466	质粒制备
快绿FCF染料	西格玛	F7252-5G	用于DNA溶液的染色剂
精细剪刀—锋利型	F.S.T.	14060-09	宫内电穿孔（IUE）
费舍品牌纱布海绵	费舍科学公司	1376152	宫内电穿孔（IUE）
Gaymar加热/冷却系统	Braintree	TP-700	加热垫
玻璃毛细管拉制仪	Sutter Instrument,	P-97	宫内电穿孔（IUE）
玻璃毛细管	Sutter Instrument,	BF150-117-10	宫内电穿孔（IUE）
脱毛乳液	Nair	N/A	脱毛
哈特曼止血钳	F.S.T.	13002-10	宫内电穿孔（IUE）
旷场迷宫—自制亚克力实验箱	定制组装	N/A	50 × 50 × 30 cm（长×宽×高）
pCAG-GFP	Addgene	11150	用于表达绿色荧光蛋白（GFP）的哺乳动物表达载体
Picospritzer III压力微注射仪	Parker Hannifin	N/A	压力注射器
牵开器—双齿钝头	F.S.T.	17023-13	宫内电穿孔（IUE）
环形镊	F.S.T.	11103-09	宫内电穿孔（IUE）
干珠灭菌器	西格玛	Z378569	手术器械灭菌
缝合线，3/0 PGA，FS-2，紫色，仅限兽用	Havel's	HJ398	缝合肌肉
水浴锅	Cole-Parmer	EW-12105-84	加热无菌生理盐水