组织特异性RNAi工具用于鉴定系统性应激信号通路组分

摘要

生物体蛋白质稳态的维持需要不同组织之间伴侣分子表达等蛋白质质量控制反应的协调。本文提供了在 C. elegans 中使用的工具，可用于监测特定组织中的蛋白质稳态能力，并确定细胞间信号传导反应。

摘要

在过去十年中，人们对蛋白质质量控制过程调控机制的认识取得了突破性进展，揭示了细胞间信号传导过程在调控非细胞自主性蛋白质稳态中的重要性。近期研究开始揭示从一种组织到另一种组织协调蛋白质质量控制的信号组分和通路。因此，明确非细胞自主性蛋白质稳态网络（PN）的机制与组分，及其在衰老、应激反应和蛋白质错误折叠疾病中的作用，具有重要意义。在实验室中，我们采用组织特异性RNAi介导的基因敲降，结合应激报告系统和组织特异性蛋白质稳态传感器来研究这一过程。本文描述了用于检测和鉴定非细胞自主性PN组分的方法，这些组分可在感知应激条件的组织以及响应细胞中发挥作用，从而激活保护性反应。我们首先介绍如何构建用于在特定组织中实现组成型基因敲降的发夹RNAi载体，以及如何在不同生命周期阶段通过饲喂RNAi实现组织特异性基因敲降。应激报告系统 和行为学检测作为 有效的检测指标 ，可实现对调控系统性应激信号通路的基因和条件进行快速筛选。 最后，利用在不同组织中表达的蛋白质稳态传感器，可检测发育和衰老不同阶段中PN组织特异性能力的变化。因此，这些工具将有助于阐明并监测特定组织中PN的功能能力，同时帮助鉴定在不同组织中发挥作用以介导生物体非细胞自主性PN的组分。

引言

细胞蛋白质稳态由一个复杂的蛋白质质量控制网络进行监控，该网络包括分子伴侣、应激反应以及降解机制，如泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬^1,2。应激反应通路的激活，例如由HSF-1介导的热休克反应（HSR）、内质网未折叠蛋白反应（UPR^ER）以及线粒体未折叠蛋白反应（UPR^mito），对于细胞在环境胁迫或导致毒性蛋白聚集的蛋白质错误折叠疾病中的适应与存活至关重要^1,2,3,4,5,6。

多细胞生物的细胞蛋白质稳态由一个额外的调控层面协调，例如 秀丽隐杆线虫, 需要协调不同组织中的细胞应激反应，以激活分子伴侣等保护性蛋白质质量控制组分⁷在过去十年中，已观察到热休克反应（HSR）和未折叠蛋白反应（UPR）等“细胞”应激反应通路存在细胞非自主性激活现象。

方案

1. 两种组织特异性RNAi方法：发夹RNAi与组织特异性SID-1互补

1. 组织特异性表达的发夹RNAi载体构建 sid-1 突变体
   1. 扩增目的基因序列（例如， hsp-90 序列分离自 hsp-90 来自Ahringer RNAi文库的RNAi克隆²⁰) 通过 PCR。将一个非回文序列置于 3’ 端 hsp-90 序列，即 SfiI 位点（ATCTA）²¹.
      注意：用于克隆的引物 hsp-90 带有 SfiI 序列（下划线标出）的为：
      as-hsp90-SfiI 5’-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3’
      as-Hsp90 5’ TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3’
   2. 将扩增的序列亚克隆至商业克隆试剂盒载体中 （例如，TOPO pCR BluntII）。
   3. 分离倒置的 hsp-90 序列来自 hsp-90 RNAi 克隆（Ahringer RNAi 文库）²⁰ 通过使用 XbaI 和 PstI 限制性酶切位点进行限制性消化，并....

结果

两种组织特异性RNAi方法：表达发夹结构或组织特异性SID-1互补
表达组织特异性的发夹RNAi构建体可实现基因在整个发育过程中的持续敲低。然而，当目标基因本身对特定组织的器官发生至关重要时，这种方法可能不切实际，例如elt-2基因，其对肠道发育必不可少²⁶。在RNAi抗性的sid-1突变体中实现组织特异性SID-1表达具有独特优势，即可以在发育的后期阶段精确控制组织特异性基因的敲低时间。在这两种情况下（无论是表达发夹构建体还是组织特异性SID-1互补），都需要验证组织特异性RNAi的效率，以确认仅有目标组织受到RNAi影响。这一验证可通过在不同组织中共同表达荧光标记蛋白（如与RFP融合的HSP-90（HSP-90::RFP））来实现。

我们将单独的 sid-1(pk3321) 突变体，或在神经元、肠道或体壁肌中表达 SID-1 的 sid-1 突变体，与在神经元（图 2A

讨论

本文所述方法展示了如何使用工具以组成型和时间特异性的方式实现对特定组织中 PN 组分的敲低。我们此前已鉴定出 TCS，这是一种由特定组织中 Hsp90 表达水平改变所诱导的细胞非自主性应激反应机制¹⁰。通过表达发夹 RNAi 在特定组织中敲低 hsp-90，可导致远端组织中保护性分子伴侣 hsp-70 的表达发生细胞非自主性上调，从而增强整个生物体的应激抗性¹⁰。然而，我们尚不清楚在感知应激或响应应激的组织中，哪些信号组分被激活以启动这一保护性反应。为了鉴定介导该过程的信号组分，组织特异性的反向遗传学筛选是重要的首选方法之一。

尽管通过表达发夹结构实现组织特异性基因敲低是有效的，但在需要检测大量基因时，这种方法存在缺点。利用RNAi抗性的sid-1突变体，并通过在肠道、神经元或肌肉中表达SID-1进行回补，可实现通过喂食RNAi进行组织特异性的基因敲低，因此该系统适用于组织特异性的遗传筛选。本文中我们描述了一个针对58个候选基因的小规.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	默克	A0166-5G	第3.1节 实验方案
DNA 纯化 & 浓缩仪-500	Zymo Research	D4031	第2.2节 实验方案
IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷β-D-硫代半乳糖苷	默克	367-93-1	第3.1节 实验方案
Multisite Gateway 克隆试剂盒	赛默飞世尔科技	12537100	第1.2节 实验方案
SigmaCote	默克	SL2-25mL	第2.3节 实验方案
四环素	默克	T7660-5G	第3.1节 实验方案
Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒	赛默飞世尔科技	K280002	第1.1节 实验方案