用于识别全身应激信号转导成分的组织特异性 RNAi 工具

摘要

维持生物体蛋白质稳态需要协调蛋白质质量控制反应，例如从一个组织到另一个组织的伴侣表达。在这里，我们提供了秀 丽隐杆线 虫中使用的工具，这些工具可以监测特定组织中的蛋白质稳态能力并确定细胞间信号反应。

摘要

在过去的十年中，围绕蛋白质质量控制过程调控的知识发生了变革性的增长，揭示了细胞间信号转导过程在细胞非自主蛋白质稳态调节中的重要性。最近的研究现在开始揭示协调蛋白质质量控制从一个组织到另一个组织的信号转导成分和通路。因此，确定细胞非自主蛋白质稳态网络 （PN） 的机制和组成部分及其与衰老、应激反应和蛋白质错误折叠疾病的相关性非常重要。在实验室中，我们将组织特异性 RNAi 的基因敲低与应激报告基因和组织特异性蛋白质稳态传感器相结合来研究这一点。我们描述了检查和识别细胞非自主 PN 成分的方法，这些成分可以作用于感知应激状况的组织和反应细胞以激活保护性反应。我们首先描述了如何在特定组织中产生用于组成型基因敲低的发夹 RNAi 构建体，以及如何通过在不同生命阶段饲喂 RNAi 来进行组织特异性基因敲低。应激报告基因和行为检测可作为有价值的读数，能够快速筛选改变全身应激信号传导过程的基因和条件。最后，利用在不同组织中表达的蛋白质稳态传感器来确定 PN 在不同发育和衰老阶段的组织特异性容量的变化。因此，这些工具应该有助于阐明并允许监测特定组织中 PN 的能力，同时有助于识别在不同组织中发挥作用以介导生物体中细胞非自主 PN 的成分。

引言

细胞蛋白质稳态由蛋白质质量控制成分的复杂网络监测，例如分子伴侣、应激反应和降解机制，包括泛素蛋白酶体系统 （UPS） 和自噬 ^1,2。应激反应通路的激活，例如 HSF-1 介导的热休克反应 （HSR）、内质网的未折叠蛋白质反应 （UPR^ER） 和线粒体 （UPR^mito），对于细胞在环境挑战或导致毒性蛋白质聚集的蛋白质错误折叠疾病期间的适应和生存至关重要 ^{1,2,3,4,5，6}.

细胞蛋白质稳态由多细胞生物（如秀丽隐杆线虫）中的另一层协调，这需要跨不同组织的细胞应激反应的协调，以激活保护性蛋白质质量控制成分，如分子伴侣⁷。在过去十年中，已观察到热休克反应 （HSR）、UPR^ER 和 UPR^线粒体以及跨细胞伴侣信号转导 （TCS） 的"细胞"应激反应通路的细胞非自主激活3,4,7,8,9,10 .在每种情况下，神经系统以及来自肠道的信号在控制跨组织伴侣的激活中起着至关重要的作用，以防止急性和慢性蛋白质错误折叠应激的毒性后果 3,5,9,11。这种从神经元到肠道和外周其他细胞的传递可以通过神经递质实现，UPR^ER 和 HSR ^6,8,11 就是这种情况。在一种形式的细胞非自主应激信号转导 TCS 中，由神经元中 HSP-90 表达增加激活，分泌的免疫肽在激活从神经元到肌肉的 HSP-90 伴侣表达中发挥作用⁵。在另一种形式的 TCS 中，降低肠道中主要分子伴侣 hsp-90 的表达会导致体壁肌肉中热诱导型 hsp-70 在允许温度下的表达增加 ^5,10。然而，在这种特殊情况下，在压力感知肠道和响应的肌肉细胞中激活的特异性信号分子是未知的。

因此，为了确定伴侣表达如何从一个组织激活到另一个组织，需要一种方法来监测蛋白质稳态网络 （PN） 的能力和组织特异性水平的应激反应激活。为了研究在单个组织中激活了哪种应激反应途径，可以利用与荧光蛋白标签融合的转录伴侣报告基因的可用选择（另见表 3）。这些包括荧光标记的 hsp-90、hsp-70 和 hsp-16.2 转录报告基因（指示 HSR 诱导）、hsp-4（指示 UPR^ER 激活）和 hsp-6（指示 UPR^线粒体）。然后，将这些报告基因与组织特异性应力条件相结合，可以获得强大的读数，该读数将精确定位对感知应力的远端"发送者"组织中 PN 不平衡的反应的单个组织。为了在特定组织中诱导应力状况或 PN 不平衡，可以采取不同的方法。例如，一种方法是通过应激转录因子（例如 xbp-1s）的活化形式的异位表达，另一种方法是使用组织特异性启动子降低必需分子伴侣（例如 hsp-90）的表达水平 ^8,10。为了仅消耗一种细胞类型的 PN 组分，通过 RNAi 进行组织特异性敲低是一种有用的工具。

然而，在秀丽隐杆线虫中，RNAi 是内吸性的;环境中的双链 RNA 可以进入并扩散到整个动物中，从而使目标基因沉默 ^12,13。摄入的 dsRNA 的这种系统性传播是由 SID（系统性 RNAi 缺陷）蛋白介导的，例如作为 dsRNA 转运蛋白的 SID-1 和 SID-2 蛋白，以及与晚期内体蛋白共定位并与摄入的 dsRNA 的输出有关的 SID-5 14,15,16。SID-1 是除神经元外所有细胞中的多通道跨膜蛋白，是 dsRNA 输出和输入细胞所必需的¹⁷。SID-2 表达仅限于肠道，在肠道中，它作为内吞受体从肠腔摄入 dsRNA 进入肠细胞的细胞质¹⁶。神经元对全身性 RNAi 缺乏反应，这与神经元中跨膜蛋白 SID-1 的表达降低有关，而 SID-1 对于输入的 dsRNA 至关重要^15,18。因此，要使组织特异性 RNAi 仅在一种细胞类型中有效，需要防止 dsRNA 的全身扩散。这可以通过利用 RNAi 抗性 sid-1 （pk3321） 突变体来实现，该突变体可防止 dsRNA 在组织中释放和摄取¹⁵。在该突变体中表达组织特异性发夹 RNAi 构建体或 SID-1 在特定组织中异位表达可以补充突变体 SID-1 的功能，并允许组织特异性 RNAi¹⁹。

那么，在 sid-1 功能丧失突变体中，肠道如何摄入 dsRNA，然后它如何到达异位表达 SID-1 构建体的神经元或肌肉细胞呢？在解释这种机制的当前模型中，内吞的 dsRNA 通过 SID-2 被摄取到肠细胞质中，然后通过另一种 SID-1 非依赖性机制（涉及 SID-5 和转胞吞作用¹⁷）输出到假腔中。因此，由于 sid-1 是 dsRNA 输入¹⁷ 所必需的，因此只有表达野生型 SID-1 的细胞才能将肠道释放的 dsRNA 吸收到假腔中。

在这里，我们演示了一组允许组织特异性 RNAi 的工具的使用。我们使用分子伴侣 Hsp90 的例子来描述发夹 RNAi 的构建，该 RNAi 可用于组成性敲低特定组织中的基因表达¹⁰。所描述的方法可用于任何感兴趣的靶基因。通过监测其他组织中荧光标记的应激报告基因的表达，可以探测其他组织对组织特异性 hsp-90 RNAi 引起的蛋白质稳态失衡的响应。作为组织特异性 RNAi 的第二种方法，我们展示了 sid-1 突变系统如何适应喂养表达 RNAi 的细菌，而不是表达发夹 RNAi 构建体。这在进行候选或全基因组 RNAi 筛选以识别组织特异性反应所需的组分时非常有用。同样，与重要 PN 成分耗竭相关的发育缺陷需要在发育后期对特定组织进行 RNAi 介导的敲低。我们展示了如何将 SID-1 互补系统用于组织特异性 TCS 修饰剂的候选 RNAi 筛选。在该示例中，我们旨在鉴定在"压力感知"发送者组织（肠道）和影响压力的组织（肌肉）中敲低后导致肌肉细胞中荧光标记的 hsp-70 报告基因表达发生变化的信号转导组分。

方案

1. 组织特异性 RNAi 有两种方式:发夹 RNAi 和组织特异性 SID-1 互补

1. 生成用于 sid-1 突变体中组织特异性表达的发夹 RNAi 构建体
   1. 通过 PCR 扩增靶基因序列（例如，从 Ahringer RNAi 文库²⁰ 的 hsp-90 RNAi 克隆中分离的 hsp-90 序列）。将非回文序列置于 hsp-90 序列的 3' 末端，即 SfiI 位点 （ATCTA）²¹。
      注:用于克隆带有 SfiI 序列（下划线）的 hsp-90 的引物是:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. 将扩增的序列亚克隆到市售克隆试剂盒载体（例如 TOPO pCR BluntII）中。
   3. 通过使用 XbaI 和 PstI 限制性位点的限制性消化，从 hsp-90 RNAi 克隆（Ahringer RNAi 文库）²⁰ 中分离倒置的 hsp-90 序列，并将其放置在载体中 hsp-90-SfiI 序列的下游（来自步骤 1.1.1），得到 hsp-90 发夹构建体（图 1）。
   4. 将发夹构建体亚克隆到 Gateway 入门载体 pDONR221 中，并将其与 Gateway 入门克隆融合，这些克隆包含神经元中任一表达的组织特异性启动子 （rgef-1p）; 在肠道中 （VHA-6p）; 或 Gateway 反应中的体壁肌肉 （unc-54p） 和 unc-54 3'UTR （或任何其他选择的 3'UTR），如供应商方案中所述。
   5. 使用编码序列外的独特限制位点线性化所得的发夹 RNAi 构建体（图 1），并以 1 ng/μL 发夹 RNAi 构建体的浓度显微注射为复杂阵列，与 100 ng/μL N2 布里斯托尔基因组 DNA（用 ScaI 消化）混合到表达 hsp-70p::RFP 报告基因（菌株 AM722）的秀丽隐杆线虫菌株中，并杂交到 sid-1 （pk3321） 的遗传背景中突变体（菌株 NL3321）。有关如何对复杂阵列进行显微注射的协议，请遵循²²。
   6. 作为阴性对照，使用在组织特异性启动子控制下表达含非回文 SfiI 的序列 （GGCCATCTAGGCC） 的空载体发夹构建体。
   7. 使用报告基因增加的 hsp-70p::RFP 表达作为读数，对表达 hsp-90 发夹 RNAi 的阳性转化体进行评分（图 3）。对于验证任何目标基因的组织特异性敲低的更通用方法，请使用目标基因的 qRT-PCR 测量全动物 mRNA 水平。
   8. 通过 γ 辐照整合表达肠道特异性 hsp-90 发夹构建体 （PVH2;见 表 1） 的所得菌株的染色体外阵列。有关将染色体外阵列整合到基因组中的信息，请参见²²。
2. 组织特异性 SID-1 表达，通过喂养表达 dsRNA 的细菌来实现组织特异性 RNAi
   1. 将载体 TU867 （unc-119p::SID-1）¹⁹ 中的 sid-1 基因组 DNA 亚克隆到 Gateway 入门载体 pDONR221 中。用于克隆 sid-1 DNA 的引物可在¹⁹ 中找到。如前面的 1.1.4 中所述，在 Gateway 反应中将 sid-1 pDONR221 构建体与含有肌肉 （myo-3p） 或肠道 （vha-6p） 特异性启动子的 Gateway 入门克隆和 unc-54 3'UTR（或任何其他选择的 3'UTR）融合。
   2. 将所得的 vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR 或 myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR 构建体与红色荧光咽共注射标记物（例如， myo-2p::RFP;5 ng/μL）显微注射到 sid-1 （pk3321） 突变体中。
   3. 如图²² 所述，将染色体外肠道或肌肉特异性 sid-1 阵列整合到基因组中。在这里，这导致了菌株 PVH5 [myo-3p::SID-1;myo-2p::RFP];sid-1 （pk3321） 和 PVH65 [vha-6p::SID-1;myo-2p::RFP];sid-1（PK3321） 的
   4. 对于 sid-1 （pk3321） 突变体中 sid-1 的神经元特异性表达，使用菌株 TU3401 uIs3401 [unc-119p::SID-1;sid-1（pk3321） 之前由 Calixto 等人生成¹⁹。
   5. 如 1.1.7 中所述，通过 qRT-PCR 测量所需靶基因的 mRNA 水平，确保目标基因的组织特异性敲低。或者，通过使用在同一组织中表达的荧光蛋白（例如 GFP 或 RFP）来确认组织特异性 RNAi 敏感性，并用 GFP 或 RFP RNAi 处理蠕虫。将线虫作为同步的 L1 期幼虫暴露于 GFP/RFP RNAi 并在 RNAi 细菌上生长，直到成年的第 1 天（见 图 2）。在我们的案例中，我们使用了在神经元、肌肉或肠道中表达 SID-1 的菌株，并在神经元 （AM987）、肠道 （AM986） 和肌肉 （AM988） 中交叉成表达 HSP-90::RFP 的菌株。

2. 使用应激报告器和蛋白质稳态传感器监测细胞自主和非自主蛋白质稳态

注意:要监测特定组织中的 PN 容量，请使用组织特异性蛋白质稳态传感器（例如在肠道中表达 Q44 或在肌肉中表达 Q35 的菌株 - 见 表 3）和应激报告基因（例如热诱导的 hsp-70p::mCherry 报告基因; 表 3）。

1. 将 sid-1 （pk3321） 突变等位基因基因遗传到蛋白质稳态传感器菌株中，并通过喂养 RNAi 确认 sid-1 （pk3321） 的存在
   1. 将蛋白质稳态传感器/应激报告基因菌株遗传性地杂交到 sid-1 （pk3321） 突变菌株的遗传背景中。要建立不同转基因菌株之间的遗传杂交，请按照²³ 获取详细方案。
      注意: sid-1（pk3321） 突变体对喂养 RNAi 具有抗性，因此用针对必需基因（如 elt-2 或 hsp-90）的 RNAi 处理胚胎只会导致 sid-1 基因杂合子或野生型菌株的发育停滞或幼虫致死。
   2. 让 10 个妊娠雌雄同体在针对 elt-2 或 hsp-90 和对照（空载体;EV） RNAi 板在 20 °C 下。 1 - 2 小时后去除母亲。使用 N2 Bristol 和 sid-1（pk3321） 突变体作为对照。
   3. 在接下来的 2-3 天内观察 RNAi 板上幼虫的发育。 ELT-2 RNAi 将导致 L1 幼虫停滞，而 hsp-90 RNAi 导致 N2 Bristol 的 L3 幼虫停滞。 sid-1 突变体将不受 RNAi 处理的影响，并将发育成妊娠成虫。
      注:sid-1 （pk3321） 的秀丽隐杆线虫纯合子将显示均匀的种群发育到成年期。杂合子将表现为一些表现出幼虫停滞的动物和一些动物发育成虫的混合种群。
2. 通过基因分型确认 sid-1 （pk3321） 的存在
   1. 将 15-20 个选定的候选 F2 菌株的蠕虫挑取到含有 15 μL 蠕虫裂解缓冲液的 PCR 管中（表 2）。
   2. 将试管置于 -80 °C 至少 10 分钟或过夜。
   3. 使用以下程序在 PCR 机中孵育试管:
   4. 65°C，60分钟（裂解蠕虫）;95 °C 15 分钟（灭活蛋白酶 K）;保持在 4 °C。
   5. 使用 2 μL 蠕虫裂解物作为"模板"进行基因分型的 PCR 反应，使用 sid-1 的以下引物: sid-1 forw:5'-agctctgtacttgtattcg-3' 和 sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'。
   6. 使用以下程序进行 PCR 基因分型:在 95 °C 下 1 个循环，持续 3 分钟;然后 95 °C 持续 10 次，55 °C 持续 30 秒，72 °C 持续 30 秒;在 72 °C 下循环 10 分钟，在 4 °C 下保持。
   7. 使用 PCR 纯化试剂盒（材料表）纯化 ~650 bp PCR 产物，并对 sid-1 PCR 产物进行测序，以鉴定 sid-1 （pk3321） 等位基因的 G 到 A 点突变。或者，G 到 A 点突变会产生一个 ApoI 限制性位点，该位点可用于 PCR 产物进行基因分型，如²⁴ 中所述。
3. 使用 iQ44::YFP 作为肠道的蛋白质稳态传感器
   1. 按照²⁵ 中描述的方案，同步在肠道中表达 Q44::YFP 的秀丽隐杆线虫（菌株 OG412）或通过漂白交叉到 sid-1（pk3321） 突变体背景中。将同步的 L1 幼虫接种到含有 OP50 细菌的 9 cm 线虫生长培养基 （NGM） - 琼脂平板上，并在 20 °C 下生长至 L4 阶段。
   2. 通过使用 5 mL M9 缓冲液从板上洗掉蠕虫来收集 L4 动物。使用玻璃移液管或硅化塑料移液器将含有 L4 蠕虫的 M9 缓冲液转移到 15 mL 试管中，并在室温下以 1000 x g 离心 1 分钟以轻轻沉淀蠕虫。小心去除上清液，确保蠕虫颗粒不受干扰。
   3. 关键步骤:要转移或电镀线虫，请使用玻璃移液器或塑料移液器吸头，按照制造商的说明使用硅化剂（例如 SigmaCote）处理。这可以防止蠕虫粘附在移液器吸头的塑料表面上。
   4. 再重复步骤 2.3.2 三次，以洗掉蠕虫中的所有 OP50 细菌。
   5. 在 5 mL M9 缓冲液中吸收蠕虫沉淀，并计数 10 μL 中存在的蠕虫数量。
   6. 将 L4 动物接种在含有空载体对照 （EV） 或 hsp-90 RNAi 细菌的 6 cm NGM 琼脂平板上，密度为每板 10 条蠕虫（每个时间点准备 5 块板和生物学重复），并在 20 °C 下孵育 24 -48 小时。
   7. 24 小时（=第 1 天成人）和 48 小时（=第 2 天成人）计算线虫肠道中表现出聚集体的 Q44 病灶的数量。每个生物重复总共 30-50 个线虫评分。

3. 细胞非自主蛋白质稳态修饰物的组织特异性候选 RNAi 筛选

注:对于组织特异性 RNAi 筛选，我们使用了菌株 PVH172，通过喂养 RNAi 细菌来允许肠道特异性 RNAi，而菌株 PVH171 允许肌肉特异性 RNAi（基因型见表 1）。

1. 候选 RNAi 板的制备
   1. 根据标准方法²⁵，制备补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素、12.5 μg/mL 四环素和 1 mM IPTG 的 6 cm NGM 琼脂平板。
   2. 使用 Ahringer RNAi 文库获得用于 RNAi 筛选²⁰ 的候选 RNAi 克隆。
   3. 使用塑料移液器吸头将 3 mL LB-amp 培养基（LB 培养基中的 50 μg/mL 氨苄青霉素）接种到 15 mL 试管中，并加入所需的 RNAi 克隆。在 37 °C 下搅拌生长过夜。
   4. 第二天，在细菌过夜培养物中加入异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）（来自 1 M 原液）至终浓度为 1 mM。
   5. 将培养物在 37 °C 下再搅拌 3 小时。
   6. 将 300 μL 细菌 RNAi 培养物接种到补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素、12.5 μg/mL 四环素和 1 mM IPTG 的 6 cm NGM 琼脂平板上。让板在室温下在工作台上干燥 2 天，用铝箔覆盖以避光。干燥后，RNAi 板可以在 4 °C 的盒子中储存数周。
2. 秀丽隐杆线虫的同步和 RNAi 细菌处理
   1. 为了同步蠕虫菌株，将 15 个妊娠成虫挑选到 RNAi 平板上，并让产卵 1 小时。然后从盘子中取出成虫。
   2. 关键步骤:在这种情况下，避免了通过漂白进行同步，因为它可以诱导 hsp-70p::RFP 报告基因，因为它对 秀丽隐杆线虫来说是一种应激条件。
   3. 挑选同步的 L4 期幼虫并转移到新的 RNAi 板中。
   4. 让线虫在相关 RNAi 上生长两代，以确保 dsRNA 的有效摄取，确保温度保持在 20 °C。
   5. 对于成像和 hsp-70p::RFP 荧光定量，使用第 1 天成人。
3. 显微镜载玻片的制备
   1. 将 ~250 μL 的 2% 琼脂糖溶液（在 M9 缓冲液中）放在玻璃显微镜载玻片上，并在顶部放置第二个载玻片以形成一个扁平圆盘，以制备显微镜载玻片。
   2. 将 5 μL 5 mM 左旋咪唑溶液（在 M9 缓冲液中）放在固定的琼脂糖垫上，并将 5 个第 1 天成虫转移到左旋咪唑滴剂中。让线虫麻痹 5 分钟。
   3. 一旦 秀丽隐杆线 虫瘫痪，请小心地用铂丝镐对齐，并在添加盖玻片之前用实验室湿巾去除多余的左旋咪唑。
   4. 关键步骤: 确保在制备显微镜载玻片后 30 分钟内拍摄蠕虫图像。显微镜载玻片上的麻痹线虫会变干和爆裂，从而影响荧光测量。
4. 显微镜设置和图像分析
   注意:图像是使用配备EM-CCD相机和显微镜图像自动化和图像分析软件的共聚焦显微镜获取的。
   1. 使用 561 nm 激光进行 RFP 荧光激发，以 10 倍放大倍率拍摄图像。确保使用相同的激光功率、针孔尺寸和荧光增益设置拍摄所有图像，以便进行比较。
   2. 将所有图像另存为 TIFF 文件。
   3. 使用 ImageJ 执行图像分析。以每单位面积的像素数测量每张图像中的荧光强度，减去背景荧光。将每个图像的荧光强度归一化到图像区域以及蠕虫的长度。
   4. 使用 "分析"|"在 ImageJ 中测量。通过将强度除以面积，将生成的强度值标准化为图像区域。
   5. 要将强度标准化为蠕虫长度，请在 ImageJ 中沿蠕虫长度画一条线并使用 Analyze |测量。将荧光强度标准化为蠕虫长度的原因是，蠕虫的大小可能会有所不同，这取决于被 RNAi 敲低的基因，这可能会影响平均强度。
   6. 将测得的荧光强度标准化为未处理的对照（即，转基因 C。 在对照 （EV） RNAi 板上生长的秀丽隐杆线虫）。汇集标准化值以比较每种 RNAi 条件的平均荧光强度。目标是每个生物复制对 20 条蠕虫进行成像，并收集至少 3 个生物复制图像。
   7. 使用学生 t 检验计算平均荧光强度值的 P 值，并使用 Benjamini-Hochberg 方法对多重测试进行校正，错误发现率为 0.05。

结果

组织特异性 RNAi 以两种方式进行:发夹构建体的表达或组织特异性 SID-1 互补
组织特异性发夹 RNAi 构建体的表达允许在整个发育过程中对基因进行组成型敲低。然而，当所研究的基因是该特定组织的器官发生所必需的时，这有时可能是不切实际的，例如肠道发育所需的 elt-2 ²⁶。RNAi 抗性 SID-1 突变体中的组织特异性 SID-1 表达具有特殊的优势，即组织特异性基因敲低可以在发育的后期进行计时。在这两种情况下（对于发夹构建体或组织特异性 SID-1 互补的表达），都需要验证组织特异性 RNAi 的效率，以确认只有目标组织受 RNAi 影响。这是通过在不同组织中共表达荧光标记的蛋白质（如 HSP-90）与 RFP （HSP-90::RFP） 融合来实现的。

我们将单独的 sid-1 （pk3321） 突变体或在神经元、肠道或体壁肌肉中表达 SID-1 的 sid-1 突变体基因杂交到在神经元（

讨论

此处描述的方法展示了允许以组成性和时间方式对 PN 成分进行组织特异性敲低的工具的使用。我们之前已经确定了 TCS，这是一种由 Hsp90 表达水平的组织特异性改变诱导的细胞非自主应激反应机制¹⁰。通过发夹 RNAi 表达对 hsp-90 的组织特异性敲低导致细胞不自主地上调远端组织中保护性 hsp-70 伴侣表达，从而增加机体应激抵抗力¹⁰。然而，我们不知道压力感知或反应组织中的哪些信号成分被激活以启动这种保护性反应。为了鉴定介导这一过程的信号转导成分，组织特异性反向遗传筛选是重要的选择方法之一。

尽管通过表达发夹构建体进行组织特异性敲低可能有效，但当需要研究大量基因时，这有缺点。使用抗 RNAi 的 sid-1 突变体辅以肠道、神经元或肌肉中 SID-1 的表达，可以通过喂养 RNAi 进行组织特异性基因敲低，因此是组织特异性遗传筛选的合适工具。虽然我们在这里描述...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	Merck	A0166-5G	协议第 3.1 节。
DNA 洁净 &Concentrator-500	Zymo Research	D4031	协议第 2.2 节。
IPTG 异丙基-β;-D-硫代半乳糖苷	Merck	367-93-1	协议第 3.1 节。
多位点网关克隆试剂盒	Thermo Fisher	12537100	实验方案第 1.2 节。
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	实验方案第 2.3 节。
四环素	Merck	T7660-5G	协议第 3.1 节。
零钝性 TOPO PCR 克隆试剂盒Thermo	Fisher	K280002	方案第 1.1 节。