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方法文章

支气管肺泡灌洗联合油酸注射猪双打击急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型

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DOI：

10.3791/61358

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2020年5月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University

本文内容

摘要

目前存在多种复杂的动物模型用于研究急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病理生理学。支气管肺泡灌洗联合油酸注射诱导的肺损伤可作为一种新的二次打击动物模型，适用于急性呼吸窘迫综合征的研究。

摘要

在21世纪，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的治疗仍对重症监护医师构成重大挑战，严重病例的死亡率仍高达50%。需要进一步的研究以更深入地理解该疾病的复杂病理生理机制。目前已有多种成熟的动物模型可用于诱导急性肺损伤，但尚无一种模型能够充分模拟ARDS复杂的病理机制。该疾病发生发展的最关键因素是肺泡毛细血管单位的损伤。结合两种成熟的肺损伤模型，可更详细地模拟其潜在的病理机制。支气管肺泡灌洗（BAL）可导致表面活性物质耗竭以及肺泡塌陷，反复灌洗液体可继而导致低氧血症。表面活性物质耗竭是人类ARDS的关键因素之一。BAL常与其他肺损伤方法联合使用，但此前尚未与二次打击后继以油酸注射（OAI）的方法相结合。油酸注射可导致气体交换严重受损、肺力学恶化以及肺泡-毛细血管屏障破坏。OAI模拟了ARDS大多数预期效应，包括肺组织广泛炎症、肺泡渗漏增加及气体交换障碍。不同模型联合使用的一个缺点在于难以区分单独由BAL、单独由OAI或两者共同作用对肺损伤所造成的影响。本报告中介绍的模型将BAL与OAI相结合，形成一种新的“二次打击”肺损伤模型。该新模型易于实施，未来可作为研究ARDS不同治疗策略的替代方案。

引言

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种以气体交换障碍和肺部浸润为特征的疾病，常需重症监护治疗。尽管已有近50年的广泛研究，全球重度ARDS的病死率仍然很高（高达50%）1。ARDS的诊断依据柏林定义，包括发病时间、胸部影像学表现、肺水肿来源及低氧血症等标准2。为了更准确地区分不同严重程度的ARDS患者，根据低氧血症的程度分为三种类型：轻度（200 mmHg < PaO2/FIO2 ≤ 300 mmHg）、中度（100 mmHg < PaO2/FIO2 ≤ 200 mmHg）和重度（PaO2/FIO2 ≤ 100 mmHg）2。目前广泛使用并认可多种以肺损伤为重点的动物模型，用于研究ARDS中的病理生理变化及不同的治疗方法3。

已知的动物模型包括使用内毒素（例如，静脉输注细菌、结扎并穿刺盲肠以模拟脓毒症诱导的肺损伤）、缺血/再灌注模型、烟雾/烧伤急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型、油酸输注模型以及支气管肺泡灌洗模型3。每种模型仅能反映少数病理生理变化，且对研究结果各有优缺点3。这些模型无法体现ARDS疾病的复杂性。结合两种已被证实的模型可对ARDS的病理生理机制得出更可靠的结论。在本研究中，我们结合了支气管肺泡灌洗和油酸输注两种方法，以模拟人类ARDS的复杂性。油酸是一种不饱和脂肪酸，可通过激活固有免疫受体直接作用于肺泡-毛细血管单位，继而引发中性粒细胞聚集、促炎性细胞因子释放以及细胞死亡4,5。油酸输注可导致严重低氧血症、肺动脉压升高以及肺血管外水分积聚。常伴随因右心室功能衰竭引起的低血压和心肌抑制。通过反复使用平衡电解质溶液进行支气管肺泡灌洗（BAL）诱导肺损伤，可降低肺泡表面活性物质的脂质浓度3。表面活性物质可降低肺泡表面张力，防止肺泡塌陷。BAL可立即引起低氧血症，并增加肺泡-动脉氧分压差3。人类ARDS同样与表面活性物质的耗竭相关3。该联合模型的缺点在于需要中心静脉通路、气管插管和全身麻醉。此外，某些机制（例如油酸输注）在转化医学中的相关性仍不明确。至少目前尚难以确定肺损伤的哪一部分（BAL 与 OAI，或两者共同作用）对肺损伤起主导作用。该模型的优点在于其适用于大型动物，监测和操作方式与人类患者相似（无需特殊设备），能够良好地再现ARDS的主要特征，并且可在无系统性炎症（例如内毒素模型）的情况下研究孤立性ARDS。下文将详细描述猪的“二次打击”（BAL 和 OAI）肺损伤模型，并提供代表性数据，以表征肺功能损害的稳定性。

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方案

本文所述所有动物实验均已获得机构和州级动物护理委员会（德国莱茵兰-普法尔茨州科布伦茨地区检验局，批准号 G18-1-044）的批准，并依照欧洲和德国实验动物科学学会的指南进行。

1. 麻醉、插管和机械通气

  1. 在麻醉前 6 小时禁食，以降低误吸风险，但允许自由饮水以减少动物应激。
  2. 在动物箱内，通过肌内注射给予氯胺酮（4 mg∙kg-1）和阿扎哌隆（8 mg∙kg-1）以实现镇静。
  3. 使用酒精局部消毒后，通过耳缘静脉置入常规外周静脉导管（20 G）建立静脉通路。
  4. 将血氧传感器夹在动物的一只耳朵或尾部，开始监测外周血氧饱和度（SpO2）。
  5. 注射芬太尼（4 µg∙kg-1）、丙泊酚（3 mg∙kg-1）和阿曲库铵（0.5 mg∙kg-1）以诱导麻醉。
  6. 将猪仰卧位放置于担架上。
  7. 使用适合动物的面罩进行通气，设定吸气峰压低于 20 cmH2O，呼气末正压（PEEP）为 5 cmH2O，呼吸频率为 14–16 次/分钟，吸入氧浓度（FiO2）为 1.0。
  8. 开始持续输注平衡电解质溶液（5 mL∙kg-1∙h-1）、丙泊酚（8–12 mg∙kg-1∙h-1）和芬太尼（0.1–0.2 mg∙kg-1∙h-1），以维持麻醉状态。
  9. 进行气管插管时，选用适合该动物的常规气管导管（例如，体重 25–30 kg 时，气管导管内径 ID 为 6–7），并配备导管芯，同时使用带有 Macintosh 4 号喉镜片的常规喉镜。需要两人配合操作。
    1. 操作者 1：一手拉出舌头，另一手下压吻部。
    2. 操作者 2：插入喉镜，并按常规向前推进，直至可视会厌。
  10. 向上提拉喉镜以暴露声门。有时会厌会“黏附”于软腭，此时可用导管尖端将其松动。
  11. 将导管经声门插入，并撤出导管芯。
  12. 充盈导管气囊。
  13. 将导管连接至呼吸机，并通过二氧化碳波形监测和听诊确认导管位置正确。
  14. 开始机械通气（潮气量 6–8 mL/kg，PEEP 为 5 cmH2O，FiO2 为 0.4，调节呼吸频率以维持呼气末二氧化碳（etCO2）在 35–45 mmHg 之间）。

2. 仪器设备

  1. 用绷带固定后肢，以便导管插入所需血管。需要准备动脉导管、动脉导引鞘、中心静脉导管以及用于肺动脉导管置入的静脉导引鞘。
  2. 使用酒精消毒剂对股部区域进行充分消毒。根据计划进行的检查，采用不同程度的无菌操作方法。
  3. 用生理盐水冲洗导管，完成导管准备。
  4. 将超声探头置于腹股沟韧带上，扫描股血管区域。
  5. 将探头旋转90°，以长轴视角完整显示股动脉。在某些情况下，如有需要，也可使用短轴视角充分显示股动脉。
  6. 在超声引导下，采用Seldinger技术，沿血管长轴用导引套件中的穿刺针穿刺股动脉。当有搏动性鲜红色血液流出时，插入导丝，随后撤出穿刺针。
  7. 可视化股静脉后，在超声引导下，使用导引套件中的穿刺针沿长轴穿刺静脉，并持续负压抽吸。当可抽出静脉血时，断开注射器，插入导丝，随后撤出穿刺针。
  8. 使用超声确认导丝位置。
  9. 沿已置入的导丝分别插入动脉导管和静脉导管。
  10. 在对侧重复动脉和静脉穿刺操作，并按照上述Seldinger技术插入动脉和静脉导引鞘。
  11. 将动脉导管和静脉导管分别连接至压力传感器。
  12. 将两个压力传感器置于心脏水平位置，并将三通旋塞打开至大气，以校准系统归零。
    注意：必须避免系统内出现气泡或血迹，以确保获得可靠的测量数值。
  13. 将丙泊酚和芬太尼的输注切换至中心静脉导管的一个端口。
  14. 校准用于超快速pO2测量的探头，并经由动脉导引鞘插入探头。
    注意：使用超快速pO2测量探头检测pO2并非必需，但有助于实时观察pO2的变化。

3. 插入肺动脉导管

  1. 检查肺动脉导管（PAC）的球囊是否有损坏。
  2. 连接传感器并进行校准。
  3. 将 PAC 通过导入鞘插入（球囊处于放气状态）。
  4. 当 PAC 通过导入鞘（15–20 cm）后，充气球囊。
  5. 推进 PAC 并监测典型的波形（静脉血管、右心房、右心室、肺动脉、肺毛细血管楔压）。放气球囊，并检查是否能从 PAC 的所有端口抽出血液。

4. 肺损伤的诱导：支气管肺泡灌洗作为第一次打击

  1. 准备已加热至 40 °C 的无菌平衡电解质溶液（例如 Sterofundin）。
    注意：使用无菌平衡电解质溶液以避免肺部污染。
  2. 在进行支气管肺泡灌洗前，用 10 分钟时间将吸入氧浓度（FiO2）从 0.4 逐步调整至 1.0。
  3. 开始超快速 pO2 测定。
  4. 准备去甲肾上腺素用于持续输注，并准备推注用药（若平均动脉压 < 60 mmHg）。将去甲肾上腺素注射泵连接至中心静脉导管的一个通路，但暂不启动。
  5. 将相当于 30 mL∙kg-1 的预热无菌平衡电解质溶液倒入漏斗中。检查该漏斗是否可与气管插管连接。
  6. 将呼吸机管路在无呼气末正压（PEEP）丢失的情况下从吸气端断开。
  7. 将漏斗连接至气管插管。
  8. 手动将漏斗抬高至动物上方 1 米处。
  9. 打开盖子，利用静水压力在 30 秒内将全部预热的平衡电解质溶液从漏斗经气管插管灌入。
  10. 30 秒后，将漏斗降至动物下方 1 米处，利用重力被动回收已灌注的溶液。随后将动物重新连接至呼吸机以恢复氧合。
  11. 收集回收的灌洗液并记录其体积，该数据用于计算肺泡液清除率。
    注意：为最大程度清除表面活性物质，灌洗后的平衡电解质溶液不得重复使用。
  12. 使用吸痰导管吸除管路内残留的溶液。
  13. 支气管肺泡灌洗后需密切监测血流动力学，并随时准备好去甲肾上腺素。必要时可给予推注或持续输注去甲肾上腺素以稳定血压（参见步骤 4.4）。
  14. 重复步骤 4.5–4.13 所述的 30 mL∙kg-1 平衡电解质溶液灌注，直至动脉血氧分压与吸入氧浓度比值（PaO2/FiO2）低于 250 mmHg。通常需进行 4 至 5 次支气管肺泡灌洗。
  15. 若 PaO2/FiO2 比值低于 250 mmHg，则开始通过注射油酸诱导肺损伤。此过程中不得更改呼吸机参数设置。

5. 肺损伤诱导：通过油酸注射实现二次打击

  1. 制备油酸溶液：在20 mL注射器中加入油酸，剂量为0.1 mL∙kg-1，并将其连接至三通阀。另取一个20 mL注射器，采集2 mL血液。向两个注射器中均加入生理盐水，使总体积达到20 mL，并将第二个注射器也连接至三通阀。
    注意：操作油酸时需佩戴手套和护目镜。
  2. 准备去甲肾上腺素用于持续输注，以及用于推注给药（当平均动脉压 < 60 mmHg时）。将去甲肾上腺素注射泵连接至中心静脉导管的一个端口，但暂不启动。
  3. 继续监测仍在进行的超快速pO2测量。吸入氧浓度（FiO2）仍保持为1.0。
  4. 将三通阀连接至肺动脉导管（PAC）的近端端口。
  5. 通过三通阀反复将溶液在两个注射器之间来回转移，充分混合油酸与血液/生理盐水混合液，并在整个过程中持续混合。当形成均匀乳剂后，注入2 mL乳剂，并继续混合。
    注意：若停止混合，乳剂可能分离为亲脂性和亲水性两相。
  6. 注射油酸后密切监测血流动力学变化，并随时准备好去甲肾上腺素。必要时，以推注或持续输注方式给予去甲肾上腺素以稳定血压（参见步骤5.2）。
    注意：需保持警惕；动物可能在该操作过程中死亡。
  7. 每隔3分钟重复注射2 mL乳剂，直至PaO2/FiO2比值低于150 mmHg。
  8. 若在PaO2/FiO2比值降至100–200 mmHg之前注射器已空，按步骤5.1所述再准备2个注射器。重复步骤5.5–5.8，直至PaO2/FiO2比值处于100–200 mmHg之间。
    注意：通常需要半支至一整支油酸与血液/生理盐水混合液。
  9. 当PaO2/FiO2比值处于100–200 mmHg之间时，等待30分钟并再次检测。若比值持续低于200 mmHg，则开始实验/治疗；否则按步骤5.1再准备2个注射器，并重复步骤5.5–5.9。
    注意：按照上述方法诱导肺损伤后，肺功能损害可能在一定范围内保持稳定、进一步恶化或有所改善。

6. 实验结束与安乐死

  1. 在持续麻醉的基础上追加注射 0.5 mg 芬太尼，等待 5 分钟。随后注射 200 mg 丙泊酚和 40 mmol 氯化钾，使动物在深度麻醉状态下安乐死。

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结果

支气管肺泡灌洗及分次给予油酸后，PaO2/FiO2 比值下降（图1）。由于难以预测支气管肺泡灌洗（例如分次油酸剂量）对 PaO2/FiO2 比值的影响，建议在诱导肺损伤过程中持续监测 PaO2/FiO2 比值。超快速 pO2 测定技术可实现 PaO2 的实时监测，且已有充分验证6。在双重打击后，PaO2/FiO2 比值应在 PEEP 为 5 cm H2O 的条件下持续维持在 100 至 200 mmHg 之间达 30 分钟。若该比值高于 200 mmHg，应重复上述步骤 5.8 和 5.9，以防止动物在实验过程中自发恢复。同时，在肺损伤诱导期间，平均肺动脉压（mPAP）升高，并在整个实验过程中持续处于较高水平（图2）。这种急性肺动脉高...

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讨论

所述通过双重打击法在猪体内诱导重度肺损伤的方法适用于研究急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的不同治疗方案。双重打击模型模拟了ARDS病理机制中的两个核心要素：肺泡-毛细血管单位的丧失以及内皮屏障的破坏7。由于存在两次打击，制定包含预设目标值（例如PaO2/FiO2比值）的实验方案至关重要。

这种双打击方法的主要缺点是难以确定肺损伤在多大程度上由平衡电解质溶液灌洗、油酸输注或两者共同作用引起。这一问题在其他联合肺损伤模型中也普遍存在（例如，灌洗与机械通气打击法3）。此外，油酸法最初被用于研究脂肪/脂质栓塞所致急性肺损伤的机制8。油酸不溶于水，必须在血液中持续乳化。在重复注射油酸后，可立即出现严重的血流动力学变化，如心肌抑制、全身性低血压和肺动脉高压，并可能导致右心室衰竭3,6,...

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披露

所有作者均声明不存在经济利益或其他任何利益冲突。

致谢

作者感谢 Dagmar Dirvonskis 提供出色的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M 氯化钾溶液ösung 7.46% 20 mLFresenius, Kabi Deutschland GmbH氯化钾
吸痰导管 理想型 CH14，52 厘米，直型德国 B. Braun Melsungen AG吸痰管
去甲肾上腺素 1 mg/mL，25 mL赛诺菲-安万特德国有限公司去甲肾上腺素
阿曲库铵 Hikma，50 mg/5 mLHikma Pharma GmbH，Martinsried阿曲库铵
BD Discardit II 注射器 2、5、10、20 mLBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga，西班牙注射器
BD Luer ConnectaBecton Dickinson Infusion Therapy AB 赫尔辛堡，瑞典三通止流阀
BD Microlance 3 20 GBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga，西班牙插管
Datex Ohmeda S5GE Healthcare Finland Oy，赫尔辛基，芬兰血流动力学监测仪
恩格斯特öm CarestationGE 医疗，美国麦迪逊呼吸机
芬太尼-杨森 0.05 mg/mL扬森-西拉格有限公司，诺伊斯芬太尼
Fü搅拌棒，直径 4.3Rüsch气管插管导引器
Incetomat-线 150 cmFresenius, Kabi Deutschland GmbH灌注管路
Ketamin-Hameln 50 mg/mL哈梅尔恩制药有限公司氯胺酮
喉镜Rüsch喉镜
logicath 7 Fr 三腔 30 cm 长Smith- Medical Deutschland GmbH中心静脉导管
Masimo Radical 7Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA外周血氧饱和度
Neofox 氧传感器 300 微米光纤海洋光学，佛罗里达州拉戈，美国超快 pO2 测量
Ölsä十八酸（Ph. Eur NF），C18H34O2，M 282.47 g/mol，密度 0.9德国达姆施塔特 Applichem GmbH油酸
原装 Perfusor 注射器 50 mL 鲁尔锁德国 B.Braun Melsungen AG灌注器注射器
PA-导管 Swan Ganz 7.5 Fr，110 cmEdwards Lifesciences LLC，美国加利福尼亚州尔湾市PAC
PE漏斗，60 mmAquintos-Wasseraufbereitung GmbH，德国漏斗
8.5 和 9 Fr 带止血阀/侧孔的经皮鞘管导入套装，10 cmArrow国际公司，宾夕法尼亚州雷丁，美国导入鞘
Perfusor FM Braun德国B.Braun Melsungen AG注射泵
丙泊酚 2% 20 mg/mL（50 mL 瓶装）Fresenius, Kabi Deutschland GmbH丙泊酚
Radifocus 导引器 II，Größe 5-8 Fr日本东京 Terumo Corporation导入鞘
Rüschelit Super Safety Clear 6.5 /7.0Teleflex Medical Sdn. Bhd，马来西亚气管插管
Seldinger穿刺针带固定翼ü凝胶Smith- Medical Deutschland GmbH塞丁格导管
Sonosite Micromaxx 超声系统美国华盛顿州博塞尔 Sonosite超声
不锈钢Macintosh喉镜öße 4Welch Allyn 69604喉镜用刀片
Sterofundin 输液B. Braun Melsungen AG，德国支气管肺泡灌洗
Stresnil 40 mg/mLLilly Deutschland GmbH，Elanco动物健康部门azaperon
Vasofix Safety 22 G德国 B.Braun Melsungen AG静脉导管

参考文献

  1. Rubenfeld, G. D., et al. Incidence and Outcomes of Acute Lung Injury. New England Journal of Medicine. 353 (16), 1685-1693 (2005).
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